一种快速生长型转基因动物的生产方法
【专利摘要】本发明提供了一种快速生长型转基因动物的生产方法，其是将含有生长激素基因的细菌人工染色体转入动物基因组中，并在该转基因动物体内进行表达。本发明是利用BAC自身特点，将含有猪GH基因的BAC作为载体携带猪自身的调控元件使GH基因以较低的拷贝数按照原组织的状态在小鼠体内进行表达，研究结果显示生长激素分泌量无明显过量超标，各项生理指标监测表明小鼠处于正常的状况，从而获得了健康的，生长速度相对较快，体重增加的小鼠家系，该模型的成功建立为培育肉质等特性明显改善的转基因猪新品种研究奠定了良好的基础。
【专利说明】一种快速生长型转基因动物的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种快速生长型转基因动物的生产方法。
【背景技术】
[0002] 猪作为一种优质的肉用型家畜，对其瘦肉率、肉质等主要经济性状方面的育种改 良一直是研究的热点。从传统育种的角度，通常只能在饲料和生长环境上加以调节控制， 但仍受到动物自身的限制。随着人们生活水平的提高和营养观念的转变，对猪的要求不再 仅仅是膘肥体重，而是希望对猪肉的蛋白质、脂肪含量、风味、口感等方面进行改进。始于20 世纪80年代初的转基因动物技术，是一种通过重组DNA技术，将外源基因导入动物体内， 外源性基因稳定整合在染色体基因组上并传给下一代。转基因技术不受有性繁殖的局限， 并且使基因能够在种系关系相距遥远的个体之间流动，其对特定性状的改良、方向更明确、 更单一等这些独特性优势将在育种领域发挥不可替代的作用。从当前的发展趋势看，转基 因技术对家畜品种改良的研究和应用将成为最活跃、最有实际应用价值的研究方向之一， 该技术的发展将为动物育种带来前所未有的革命性变化。
[0003] 为了得到生长更加理想的家畜品种，可将一些和动物生长发育相关的基因转入， 将使之在肉产量，质量，肥瘦组成方面更符合市场的需求。生长激素 （Growth Hormone)是 一类广泛存在于多种动物体内的由垂体嗜酸性细胞分泌的一种蛋白质激素，其作用是调控 新陈代谢、促进生长发育，而其宏观表现为体重增加、胴体瘦肉率提高等。1982年，美国科 学家首次将大鼠生长激素基因与金属硫蛋白基因启动子拼接成融合基因，导入小鼠受精卵 后，获得了转基因"超级鼠"。这一研究的成功为生产转基因大家畜奠定了良好的基础。此 后，相继出现转人GH、转猪GH、转大鼠 GH和转牛GH基因等外源DNA的转基因猪，绵羊，兔， 牛，研究表明它们与非转基因的动物相比，生长速度和饲料转化效率有显著提高，胴体的脂 肪率也明显降低，但是常伴随着健康异常的问题，例如：关节炎、应激敏感性增加、肝脏与 肾脏炎症、胃溃疡、生育能力降低、寿命减短等。研究这些推断异常现象的产生可能是由于 转入的生长激素基因连续异位地在不同组织器官中表达，同时体内外源生长激素远超其自 身生理水平，自身的反馈机制也被破坏而引起。
[0004] BAC (细菌人工染色体）是一可容纳约300kb的DNA片段的克隆载体，其遗传稳定 性好，嵌合率低，转化率高，易操作，同时它能包括编码区且还包含内含子和调控区，其携带 的基因可以和各种酶类、转录因子作用，遵守基因表达和复制的机制，理论上和正常染色体 上的基因相似，因此BAC可将复杂的基因和基因家族，包括远程的顺式作用元件转入受体 生物基因组中，使转入的基因在一定范围接近原有的组织状态，减少转基因的沉默的可能。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种快速生长型转基因动物的生产方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的一种快速生长型转基因动物的生产方法，其是将 含有生长激素基因的细菌人工染色体转入动物基因组中，并在该转基因动物体内进行表 达。优选所述生长激素基因为猪生长激素基因。
[0007] 前述的方法，其中含有猪生长激素基因的细菌人工染色体的核苷酸序列在 GenBank上的国际编号为CH242-271011，或与该序列同源性在70%以上的核苷酸序列，或在 严格条件下，能够与该序列杂交的核苷酸序列。
[0008] 前述的方法，其是将含有生长激素基因的细菌人工染色体通过显微注射法、体细 胞克隆法或精子载体法等方法转入动物基因组中。
[0009] 前述的方法，所述动物为牛、羊、猪、马、兔、鹿、狗等。
[0010] 本发明还提供含有国际编号CH242-271011核苷酸序列的表达载体以及含有该表 达载体的转基因动物细胞。。
[0011] 本发明还提供含有国际编号CH242-271011核苷酸序列的转基因动物细胞。
[0012] 本发明还提供一种制备克隆胚胎的方法，其以上述的转基因细胞为核移植供体细 胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。
[0013] 本发明进一步提供一种制备转基因家畜的方法，其是将上述方法制备的克隆胚胎 通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因家畜。
[0014] 本发明是利用BAC自身特点，将含有猪GH基因的BAC作为载体携带猪自身的调控 元件使GH基因以较低的拷贝数按照原组织的状态在小鼠体内进行表达，研究结果显示生 长激素分泌量无明显过量超标，各项生理指标监测表明小鼠处于正常的状况，从而获得了 健康的，生长速度相对较快，体重增加的小鼠家系，该模型的成功建立为培育肉质等特性明 显改善的转基因猪新品种研究奠定了良好的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是国际编号为CH242-271011的BAC结构示意图。
[0016] 图2为pGH-BAC经Notl酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，A是BAC (GenBank 号：⑶466386)经Notl酶切后脉冲电泳结果，鉴定其大小约为177kb，B是大量酶切BAC通过 脉冲电泳切胶回收目的片段。Ml:X-Hind III，M2:MidRange II PFG，箭头 lmarkerl79kb， 箭头2:marker9416bp，箭头3:线性化的BAC，箭头4:BAC载体带。
[0017] 图3为转基因小鼠制备流程如图3所示。
[0018] 图4为PCR鉴定转pGH-BAC基因小鼠结果。
[0019] 图5为Southern blotting鉴定转基因小鼠及其拷贝数结果；其中，A和B表示Fq 代小鼠鉴定，C和D表示Fi代小鼠，4014bp的条带是基因组上整合的pGH-BAC被探针杂交出 来的片段，代2、15、16、31、35、37、41、44、46、49为阳性，其相应的Fi代与原代结果一致； +表示pGH BAC为阳性对照；+(3, 10, 30)表示拷贝数，WT为野生型小鼠对照。
[0020] 图6为RT-PCR检测mRNA水平上pGH基因在各组织器官中的表达结果；其中A为 取Fi代13个家系的阳性小鼠的各组织器官提取RNA，反转录为cDNA进行RT-PCR，其中8个 完整整合BAC家系的阳性小鼠在垂体中表达了 pGH基因；B表示列举其中一家系pGH-mRNA 水平在各器官中的表达情况，GAPDH为小鼠持家基因，+ :猪垂体cDNA :转基因小鼠 cDNA ; 11:心；1^肝；5:脾丄11:肺；1( :肾；？：垂体，：肌肉。
[0021] 图7为免疫组化检测pGH在小鼠垂体中的表达结果；其中A表示未加抗体的空白 片，B表示非转基因小鼠的垂体片，C和D表示其中两个家系的阳性转基因小鼠垂体片。
[0022] 图8为匕-49家系的转基因小鼠与非转基因小鼠比较；其中A表示的是匕-49家 系的小鼠从断奶后的第三周开始每七天进行一次体重的称量直至第十周，平均体重该家系 的转基因小鼠相比非转基因的小鼠有明显的增加；B为小鼠年龄在150天时进行外观上的 比较，左侧阳性小鼠体重为：55. 55g,右侧为同窝阴性小鼠,体重为：42. 41g ;C为FQ-49家系 中10周小鼠断颈屠宰后大腿肌肉上的比较，左侧为阳性转基因小鼠，右侧为同窝非转基因 小鼠。
[0023] 图9为转pGH-BAC基因小鼠体重情况。
[0024] 图10A和图10B分别为雄性、雌性转pGH-BAC基因小鼠器官重量的比较。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0026] 以下实施例所使用的载体、试剂及其来源：
[0027] 含有猪生长激素的BAC(国际编号：CH242-271011)购自美国BAC/PAC Resource Center at Children' s Hospital Oakland Research Institute。引物合成及序列测定 由上海生工完成。实验动物用昆明小白鼠，购自北京实验动物中心。Taq酶、内切酶均为 Takara公司产品；BAC纯化及回收试剂盒为Qiagen公司产品；Q-PCR试剂盒购自Applied Biosystem 公司；MidRange PFG Marker 购自 NEB 公司；Trizol 为 Tiangen 公司产品，PCR 法DIG引物标记盒和地高辛杂交检测试剂盒购于Roche公司；Southern杂交膜购自于美国 Amersham biosciences公司；抗猪GH -抗购自Accurate公司，IgG二抗购自中山金桥公 司。酶切、PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆（第三版）》。实施例 中所使用的其它技术手段，若未特别指明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028] 实施例1猪生长激素 BAC (pGH-BAC)纯化和鉴定
[0029] 1. lpGH-BAC 提取和鉴定
[0030] 根据GenBank上的猪生长激素基因（pGH)序列（GenBank号：M17704)和GenBank 上BAC的序列（GenBank号：CU466386)确定pGH基因的5'侧翼序列约为75kb，3'侧翼序列 约为100kb (图1)。
[0031] BAC(国际编号：CH242-271011，其结构如图1所示，图中pTARBACl. 3为载体骨架， BAC携带了约177kb的猪基因片段，猪生长激素基因位于该BAC的中间，其5'和3'侧翼序 列分别为75kb，100kb，保证了该基因周围含有足够多的调控元件。同时在BAC5、pGH基因、 BAC3分别设有引物p51和p52 ;GH1和GH2 ;p31和p32检测BAC的完整性)提取参照Qiagen 大提质粒试剂盒说明书进行，用T7和SP6引物进行末端测序比对，同时依据NCBI的序列设 计引物对BAC两末端及GH基因进行PCR扩增，引物见表1。
[0032] 表1检测转pGH-BAC小鼠引物表
[0033]
【权利要求】
1. 一种快速生长型转基因动物的生产方法，其特征在于，其是将含有生长激素基因的 细菌人工染色体转入动物基因组中，并在该转基因动物体内进行表达。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生长激素基因为猪生长激素基因。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，含有猪生长激素基因的细菌人工染色体 的核苷酸序列在GenBank上的国际编号为CH242-271011，或与该序列同源性在70%以上的 核苷酸序列，或在严格条件下，能够与该序列杂交的核苷酸序列。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，其是将含有生长激素基因的细 菌人工染色体通过显微注射法、体细胞克隆法或精子载体法转入动物基因组中。
5. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述动物为牛、羊、猪、马、兔、 鹿、狗。
6. 含有国际编号CH242-271011核苷酸序列的表达载体。
7. 含有国际编号CH242-271011核苷酸序列的转基因动物细胞。
8. 含有权利要求6所述表达载体的转基因动物细胞。
9. 一种制备克隆胚胎的方法，其以权利要求7或8所述的转基因细胞为核移植供体细 胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。
10. -种制备转基因家畜的方法，其是将权利要求9所述方法制备的克隆胚胎通过非 手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因家畜。
【文档编号】C12N15/877GK104059924SQ201310092670
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月21日 优先权日:2013年3月21日
【发明者】胡晓湘, 童佳, 张然, 李秋艳, 戴蕴平, 李宁 申请人:中国农业大学