一种生产富含多不饱和脂肪酸转基因动物的方法
【专利摘要】本发明提供了一种制备富含多不饱和脂肪酸的转基因动物的方法。该方法是将Seq?ID?No.1和Seq?ID?No.2的DNA分子导入哺乳动物细胞中，获得的表达△-12脂肪酸脱氢酶和ω-3脂肪酸脱氢酶的转基因细胞；以所述的转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得的克隆胚胎；将所述的克隆胚胎通过非手术法移入动物子宫内进行妊娠，获得转基因动物。本发明的方法能在转基因家畜体内稳定表达△-12和ω-3脂肪酸脱氢酶，显著提高家畜肉中的ω-3PUFAs的含量。
【专利说明】一种生产富含多不饱和脂肪酸转基因动物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种生产富含多不饱和脂肪酸转基因 动物的方法。
【背景技术】
[0002] 多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs)是指在脂肪酸的碳链 中含有多于一个双键的脂肪酸。根据脂肪酸碳链甲基端距离最近一个双键的距离，多不饱 和脂肪酸主要分为《-3PUFAS和c〇-6PUFA S两大类。自然界中ω-3类PUFAs主要包括 α-亚麻酸（a-linolenic acid，ALA)、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA)和 二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA) ;ω-6 类 PUFAs 主要包括亚油酸（linoleic acid)和花生四烯酸（AA)。
[0003] 多不饱和脂肪酸对于个体的发育和健康有非常重要的作用，ARA和EPA是类二十 烷酸的合成前体，是类二十烷酸调控通路的起始；ARA和DHA可以促进肌肉和大脑的发育并 在这两种组织中含量丰富；EPA和DHA的缺乏影响视网膜发育，导致视力疾病，并在抑制肿 瘤细胞增殖等方面起着重要的作用；流行病学研究表明ARA、EPA、DHA可以有效降低心血管 疾病发病。虽然多不饱和脂肪酸在个体发育中占有绝对重要作用，脊椎动物自身却没有直 接合成ω-3和ω-6类PUFAs的酶类，这两类脂肪酸的获得只能通过食物供给，因为这两 类脂肪酸的重要作用而且不能在动物体内自身合成，所以这两类脂肪酸也被称为必须脂肪 酸。
[0004] 食物中PUFAs的主要来源为植物，植物中存在可以自身合成直接合成ω-3和ω-6 类PUFAs的酶类，所以很多植物含有丰富的PUFAs。但植物中的PUFAs以亚油酸和亚麻酸为 主，它们不能合成更长链的脂肪酸，人们还要通过自身的代谢酶类才能获得20个碳以上 的长链脂肪酸。而食物中ω-3类长链PUFAs的主要来源为海洋鱼类，海洋鱼类以海洋浮游 微生物为食，体内聚集了大量的DHA和EPA。然而，由于鱼类资源的减少以及海洋污染的日 益严重，已在一些鱼类中检测到重金属。另外，由于鱼油的高热量以及特殊的气味而不适用 于所有人群，吸收也会因个人的生理状况不同而异。动物食品中缺少PUFAs，尤其是牛、羊等 反刍动物。在动物饲料中添加多不饱和脂肪酸成分曾被广泛用来提高肉制品中多不饱和脂 肪酸含量，但是这种方法会大大提高饲养成本。鉴于以上几方面的原因，如果能在动物中转 入几个关键的酶基因，使其能够自身合成长链多不饱和脂肪酸，从而提高肉质品和奶制品 的品质以满足人们日常对多不饱和脂肪酸的营养需要。
[0005] 多不饱和脂肪酸PUFAs的合成是一个连续的过程，需要在一系列的去饱和酶(月旨 肪酸脱氢酶）和延伸酶依次催化作用下合成。首先硬脂酸（C18:0)在Λ-9去饱和酶的作 用下脱氢生成油酸（C18:ln_9)，油酸在Λ 12和Λ 15去饱和酶的依次作用下生成亚油酸 (<：18:211-6)和〇-亚麻酸（(：18:311-3)。亚油酸和〇-亚麻酸是合成（〇-6和（〇-3?耶48的基 础物质。亚油酸和α-亚麻酸分别在Λ 6去饱和酶、Λ 6延伸酶以及Λ 5去饱和酶的依次作 用下生成花生四烯酸（C20: 4η-6，ΑΑ)和二十碳五烯酸（C20: 5n-3，EPA)，ΑΑ和ΕΡΑ进一步在 延伸酶和去饱和酶的作用下生成DPA (C22:5n-6)和DHA (C22:6n-3)。EPA向DHA转化时， 也可以通过以下途径：EPA延伸至二十二碳五烯酸，再延伸至二十四碳五烯酸，然后由Λ-6 去饱和酶脱氢，最后β-氧化降解掉两个碳，生成DHA。催化ω-9类PUFAs转化为ω-6类 PUFAs的酶类统称为ω-6脂肪酸脱氢酶（ω-6去饱和酶)，Λ 12去饱和酶即此类催化酶；催 化c〇-6PUFAs转化为c〇-3PUFAs的酶统称ω-3脂肪酸脱氢酶（ω-3去饱和酶)，Λ 15去饱 和酶也属于此类。哺乳动物缺乏△-12和ω-3脂肪酸脱氢酶，不能合成多不饱和脂肪酸的 前体物质：亚油酸和亚麻酸，因而连续的合成过程不能正常进行，自身不能合成长链 多不饱和脂肪酸。在畜牧生产中可以通过转基因的方法改良哺乳动物的遗传特性，在哺乳 动物体内转入Λ-12 (FAT-2)和ω-3脂肪酸脱氢酶（FAT-1)从而完善哺乳动物脂肪酸合 成的代谢链，重建一个长链多不饱和脂肪酸的合成途径，使家畜可以自身合成长链多不饱 和脂肪酸。
[0006] 已有成功的利用转基因方法使哺乳动物合成多不饱和脂肪酸的报道，2004年， K. Saeki等将菠菜△ 12脂肪酸脱氢酶基因转入猪体内，首次实现了植物基因在家畜动物 中的表达，从转基因猪中分离的前脂肪细胞经诱导分化所含亚油酸比转基因猪未分化的细 胞中的多十几倍；白脂中亚油酸含量转基因猪比野生型高1.2倍多。Kang，Jing X.等在 小鼠中表达了线虫ω-3脂肪酸脱氢酶（FAT-1基因编码)，将小鼠中的c〇-6PUFAs转化为 c〇-3PUFAs，提高了 c〇-3PUFAs的含量，降低了 c〇-6/c〇-3PUFAs的比例，Lai等在克隆猪中 成功的表达了此基因。但这些研究忽视了长链脂肪酸的另一些方面，体内过多ω-ePUFAs 转化为《-3PUFAS可能会影响子代的胚胎发育，降低子代个体的生育个数；另外，体内长 链不饱和脂肪酸水平的提高改善了营养水平的同时也会伴随着其它问题的发生，很多研究 证明，不饱和脂肪酸水平的提高，增加了肉质的过氧化水平，尤其是脂肪组织的过氧化明 显，这就为肉质的保存增加了难度；第三，长链脂肪酸在体内可以通过PPARa β Y、SREBP、 LXRa等信号通路调节脂肪代谢，影响肝脏中脂肪的合成，减少了脂肪沉积，降低脂肪组织 中脂滴的大小。这些问题是在畜牧生产过程中所不愿看到的，即在提高《-3PUFAS的同时 也对其它方面产生了影响。
[0007] 鉴于上述PUFAs的优点和带来的一些问题，本发明构建了肌肉特异表达fat-1、 fat-2基因的动物模型，理论上可以在肌肉组织特异的提高多不饱和脂肪酸水平，提高肉质 水平的同时减少多不饱和脂肪酸对其它组织的影响。通过显微注射，获得了肌肉特异表达 fat-1、fat-2基因的小鼠模型，通过对脂肪酸组成进行色谱分析，肌肉组织《-3PUFAS水 平大大提高，《-9PUFAS水平降低，c〇-6PUFA S没有受到显著影响；同时n-6/n-3显著降低， 而其它组织的脂肪酸水平同正常小鼠相比没有显著变化。基于小鼠模型，本发明通过体细 胞核移植的方法获得了肌肉特异表达fat-1、fat-2基因的转基因猪。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种生产富含多不饱和脂肪酸转基因动物的新方法。
[0009] 为了实现本发明目的，本发明提供一种转基因细胞，其是将Seq ID No. 1和Seq ID No. 2的DNA分子导入哺乳动物细胞中，获得的表达Λ-12脂肪酸脱氢酶和ω-3脂肪酸脱氢 酶的转基因细胞。优选地，所述哺乳动物细胞为CH0细胞或胎儿成纤维细胞。
[0010] 本发明还提供一种制备克隆胚胎的方法，其是以上述转基因细胞为核移植供体细 胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。
[0011] 本发明还提供一种生产富含多不饱和脂肪酸转基因动物的方法，其是将上述方法 制备的克隆胚胎通过非手术法移入动物子宫内进行妊娠，获得转基因动物。优选地，所述动 物为猪、羊或牛。
[0012] 本发明还提供一种DNA分子，其核苷酸序列如Seq ID No. 1所示，或该序列经替 换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能蛋白的核苷酸序列。
[0013] 本发明还提供一种DNA分子，其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示，或该序列经替 换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能蛋白的核苷酸序列。
[0014] 本发明通过构建肌肉特异表达fat-1、fat-2基因的小鼠模型，并对脂肪酸组 成进行色谱分析，发现小鼠肌肉组织中《-3PUFAS水平大大提高，c〇-9PUFA S水平降低， ω-ePUFAs没有受到显著影响；同时n-6/n-3显著降低，而其它组织的脂肪酸水平同正常 小鼠相比没有显著变化。基于小鼠模型，本发明通过体细胞核移植的方法获得了肌肉特异 表达fat-l、fat-2基因的转基因猪，使Λ -12和ω -3脂肪酸脱氢酶能在转基因猪体内稳定 表达，显著提高了家畜肉中的《-3PUFAS的含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为本发明融合PCR构建串联fat-Ι和fat-2的示意图。
[0016] 图2为本发明琼脂糖凝胶检测fat-Ι和fat-2基因融合产物，其中1 :lkb梯度DNA 分子量标准，2 :fat-l的PCR产物，3 :fat-2的PCR产物，4 :fat-l和fat-2的融合PCR产物 ff-F2A，5 :阴性对照（fat-Ι和fat-2混合，不加引物的PCR产物)。
[0017] 图3为本发明p-alpha-actin-ff载体的示意图。
[0018] 图4为本发明转基因小鼠制备流程图。
[0019] 图5为本发明RT-PCR检测，在alpha-actin启动子调控下fat-Ι和fat-2转基因 小鼠各个家系肌肉组织的表达，GAPDH为持家基因，1 :质粒阳性对照，2-5 :ff20、ff23、ff26 和ff29家系转基因小鼠，6 :野生型小鼠，7 :ff20家系转基因小鼠的RNA直接扩增产物(对 照：防止DNA污染)，8 :100bp梯度DNA分子量标准。
[0020] 图6为本发明RT-PCR检测，在alpha-actin启动子调控下fat-Ι和fat-2转基因 小鼠各组织的表达，1-9分别为：肾脏、肝脏、脾脏、肌肉、小肠、脑、肺脏、脂肪、心脏，GAPDH 为持家基因。
[0021] 图7为本发明F1代转基因阳性小鼠和野生型小鼠血清中的脂肪酸水平比较，左柱 为野生型小鼠组，右柱为转基因小鼠组，每组小鼠样本量为7只。
[0022] 图8为本发明转基因猪PCR阳性检测，1-9分别为41，43,44,47,48,49,62,63,66 号猪基因组，10为阳性质粒，11和12为阴性猪基因组和水，13为100bp梯度DNA分子量标 准。
[0023] 图9为本发明转入p-alpha-actin-ff片段克隆猪（177天）的照片。
【具体实施方式】
[0024] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0025] 以下实施例中如无特殊说明，所用方法均为常规方法，所用试剂均为市售商品。
[0026] 实验小鼠：昆明白品系；pMD19_T购自Takara公司（货号D104A);地高辛标记 核酸检测试剂盒购于Rothe公司；Southern、Northern杂交膜均购自于美国Amersham biosciences公司；Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均为美国NEB公司产品；质粒纯化及回收 试剂盒为Omega公司产品；引物合成及序列测定由上海生工完成和华大基因完成；酶切、连 接、回收、转化、PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆（第三版）》。
[0027] 实施例lfat-1、fat-2真核表达载体的构建
[0028] 通过RT-PCR获得了秀丽隐杆线虫的fat-l、fat-2基因，并根据哺乳动物的密码子 偏好性，对两个基因的CDS序列进行了优化，其核苷酸序列分别如Seq ID No. 1和Seq ID No. 2所示。将两段基因的⑶S序列通过融合PCR的方法连在一起，两段基因之间用F2A短 肽(编码该短肽的核苷酸序列如Seq ID No. 3所示）相连，以保证在基因表达时可以分别翻 译出两种蛋白。
[0029] 为了将fat-Ι和fat-2串联，并在中间插入F2A短肽序列，本发明采用融合PCR的 方法。在设计引物时，fat-Ι的下游引物和fat-2的上游引物有50bp的互补区域，便于进行 融合PCR，对fat-Ι和fat-2两段序列进行PCR扩增后，分别用fat-Ι的上游引物和fat-2的 下游引物，直接对两段序列扩增，得到融合的fat-l-F2A-fat_2序列（Seq ID No. 4)，命名为 ff-F2A，通过测序和比对，ff-F2A序列和预期的序列完全一致，从图中可以看出，融合PCR 产物ff-F2A的长度近似等于fat-1和fat-2基因 PCR产物长度的加和。在设计引物是，在 fat-Ι上游引物和fat-2下游引物中已经分别加入了 NHel和Sail酶切位点，获得ff_F2A 后进行双酶切将ff_F2A连入p-alpha-actin表达载体中，得到载体p-alpha-actin-ff。 载体构建中使用的引物如表1所示。融合PCR构建串联fat-1和fat-2的示意图如图1所 示，构建载体的琼脂糖凝胶检测图如图2所示，构建好的表达载体的示意图如图3所示。构 建好的载体全长30. 2kb，包含猪alpha-actin启动子序列11. 8K，3'调控区7. 6K，插入片段 2· 4Κ。
[0030] 表1融合PCR所用的引物
[0031]
【权利要求】
1. 一种转基因细胞，其是将Seq ID No. 1和Seq ID No. 2的DNA分子导入哺乳动物细 胞中，获得表达Λ -12脂肪酸脱氢酶和ω-3脂肪酸脱氢酶的转基因细胞。
2. 根据权利要求1所述的转基因细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CH0细胞或胎 儿成纤维细胞。
3. -种制备克隆胚胎的方法，其是以权利要求1或2所述的转基因细胞为核移植供体 细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。
4. 一种生产富含多不饱和脂肪酸转基因动物的方法，其是将权利要求3所述方法制备 的克隆胚胎通过非手术法移入动物子宫内进行妊娠，获得转基因动物。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述动物为猪、羊或牛。
6. -种DNA分子，其核苷酸序列如Seq ID No. 1所不，或该序列经替换、缺失或添加一 个或几个核苷酸形成的编码同等功能蛋白的核苷酸序列。
7. -种DNA分子，其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一 个或几个核苷酸形成的编码同等功能蛋白的核苷酸序列。
【文档编号】C12N15/53GK104059881SQ201310092669
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月21日 优先权日:2013年3月21日
【发明者】胡晓湘, 彭云乾, 张然, 李秋艳, 戴蕴平, 李宁 申请人:中国农业大学