GsNAC74及其编码基因在培育耐逆性植物中的应用的制作方法

GsNAC74及其编码基因在培育耐逆性植物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种GsNAC74及其编码基因在培育耐逆性植物中的应用。本发明提供了如下1）-3）中任一种物质在调控植物耐逆性或培养耐逆性植物中的应用：1）蛋白GsNAC74；2）编码蛋白GsNAC74的DNA分子；3）含有编码蛋白GsNAC74的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述蛋白GsNAC74的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明从野生大豆中克隆了一个NAC家族的转录因子基因GsNAC74，研究发现，GsNAC74基因的过量表达提高了转基因植株的耐逆性，干扰该基因表达，降低转基因植株的耐逆性。
【专利说明】GsNAC74及其编码基因在培育耐逆性植物中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种GsNAC74及其编码基因在培育耐逆性植 物中的应用。

【背景技术】
[0002] 环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等对植物的生长发育有重要 影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前， 基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环 境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。植物中已经 发现了多类转录因子与植物耐逆性相关，例如：EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB，WRKY等 等。
[0003] NAC (MAM/ATAFl/2/￡UC2)家族是植物中特有的转录因子家族，NAC家族蛋白的N 末端具有保守氨基酸序列，称为NAC域，N端序列具有DNA结合的特性。NAC家族的C末端 氨基酸序列呈现多态性，大部分研究证明其为基因的DNA激活域。
[0004] 已经研究的NAC基因在不同的生命过程中起到非常重要的作用。例如对病原菌的 防卫、植物衰亡、形态发生以及对非生物胁迫的应答等。
[0005] 已经研究的NAC基因在不同的生命过程中起到非常重要的作用。例如对病原菌的 防卫、植物衰亡、形态发生以及对非生物胁迫的应答等。近两年来，关于NAC家族蛋白在非 生物胁迫信号过程中的作用有了越来越多的报道。油菜中几个BnNAC基因受到伤害、低温 和干旱的诱导，暗示NAC类基因可能参与了非生物胁迫的过程。水稻中报道了 3个和非生 物胁迫相关的基因。SNAC1转基因水稻表现出抗旱和抗盐的表型，而SNAC2可以提高转基因 水稻低温和高盐的耐性。0sNAC6对生物胁迫与非生物胁迫信号均有应答反应，其过量表达 株系表现出对干旱、高盐的耐受性，并且在抗病方面也有所贡献。拟南芥中的研究表明，过 量表达ANAC019，ANAC055可以增强植物的耐旱性。ANAC072即RD26受干旱、高盐和ΑΒΑ的 诱导，RD26的下游基因，如GLY1 (glyoxalase I家族)，与耐逆性相关。上述研究证明，NAC 蛋白在非生物胁迫中具有重要的作用，而且参与了多种不同的信号途径。
[0006] 大豆起源于我国。我国有最丰富的野生大豆资源。从黑龙江野生大豆资源中筛选 到耐2. 5%盐的材料，编号为Y20。从耐盐材料中发掘耐盐相关基因，可为培育耐盐大豆提供 基因资源。


【发明内容】

[0007] 本发明的一个目的是提供如下1) _3)中任一种物质的新用途。
[0008] 本发明提供了如下1 )_3)中任一种物质在调控植物耐逆性或培养耐逆性植物中的 应用：1)蛋白GsNAC74 ;2)编码蛋白GsNAC74的DNA分子；3)含有编码蛋白GsNAC74的DNA 分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
[0009] 所述蛋白GsNAC74的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0010] 上述应用中，所述编码蛋白GsNAC74的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列 1 ;
[0011] 所述含有编码蛋白GsNAC74的DNA分子的重组载体为将所述编码蛋白GsNAC74的 DNA分子插入表达载体中，得到表达蛋白GsNAC74的重组载体。
[0012] 在本发明的实施例中，表达载体为pBin438,重组载体为将序列表中的序列1所示 的核苷酸插入pBin438的BamH I和Sac I酶切位点之间得到的载体。
[0013] 上述应用中，调控植物耐逆性为提高植物耐逆性。
[0014] 上述应用中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；所述植物为双子叶植物或单子 叶植物；所述双子叶植物具体为大豆。
[0015] 上述提高植物耐逆性具体体现为将编码蛋白GsNAC74的DNA分子通过含有编码 蛋白GsNAC74的DNA分子的重组载体导入植物中，得到转基因毛状根，在盐胁迫或干旱 胁迫下，所述转基因毛状根的增长率大于与转空载体毛状根；其中，转空载体毛状根为将 pBin438转入植物得到的转空载体毛状根。
[0016] 本发明的另一个目的是提供沉默或抑制植物中蛋白GSNAC74表达的物质的新用 途。
[0017] 本发明提供的沉默或抑制植物中蛋白GsNAC74表达的物质在降低植物耐逆性中 的应用。
[0018] 上述应用中，所述沉默或抑制植物中蛋白GsNAC74表达的物质为重组载体，
[0019] 所述重组载体为将DNA分子1和DNA分子2均插入表达载体中，得到沉默或抑制 植物中蛋白GsNAC74表达的重组载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自5'末端 第126-537位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列。
[0020] 在本发明的实施例中，表达载体为pZHOl，重组载体为将序列1的自5'末端第 126-537位核苷酸插入pZHOl载体的SacI和ΚρηΙ酶切位点，且将序列1的自5'末端第 126-537位核苷酸的反向互补序列插入pZHOl载体的Sail和Xbal位点间，得到的载体。
[0021] 上述应用中，所述耐逆性为耐盐性和/或耐干旱；所述植物为单子叶植物或双子 叶植物。
[0022] 上述降低植物耐逆性具体体现为将重组载体导入植物中，得到转基因毛状根，在 盐胁迫或干旱胁迫下，所述转基因毛状根的增长率小于转空载体毛状根；其中，转空载体毛 状根为将pZHOl转入植物得到的转空载体毛状根。
[0023] 本发明的第三个目的是提供重组载体。
[0024] 本发明提供的重组载体，为将编码蛋白GsNAC74的DNA分子插入表达载体中，得到 表达蛋白GsNAC74的重组载体；所述蛋白GsNAC74的氣基酸序列为序列表中的序列2 ;所述 编码蛋白GsNAC74的DNA分子的核苷酸序列具体为序列表中的序列1。
[0025] 在本发明的实施例中，表达载体为pBin438,含有编码蛋白GsNAC74的DNA分子的 重组载体为将序列表中的序列1所示的核苷酸插入pBin438的BamH I和Sac I酶切位点 之间得到的载体。
[0026] 本发明的第四个目的是提供重组载体。
[0027] 本发明提供的重组载体，为将DNA分子1和DNA分子2均插入表达载体中，得到沉 默或抑制植物中蛋白GsNAC74表达的重组载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的 自5'末端第126-537位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互 补序列。
[0028] 在本发明的实施例中，表达载体为pZHOl，重组载体为将序列1的自5'末端第 126-537位核苷酸插入pZHOl载体的SacI和ΚρηΙ酶切位点，且将序列1的自5'末端第 126-537位核苷酸的反向互补序列插入pZHOl载体的Sail和Xbal位点间，得到的载体。
[0029] 可用现有的植物表达载体构建含有GsNAC74基因的重组表达载体。
[0030] 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植 物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的 3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因(如大豆贮 存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0031] 使用GsNAC74构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒（CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子 (Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与 其它植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强 子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起 始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制 信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来 自转录起始区域或结构基因。
[0032] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗 化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因）等。
[0033] 转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因 子代。
[0034] 本发明中所述的"多核苷酸"、"多核苷酸分子"、"多核苷酸序列"、"编码序列"、"开 放阅读框（0RF)"等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA 序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相 应的反义链。
[0035] 本发明基因可通过如下方式导入宿主中：将本发明基因插入表达盒中，再将表达 盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或农杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达 载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介 导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
[0036] 转入本发明基因的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该 基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。
[0037] 本发明基因可通过如下方式导入宿主中：将本发明基因插入表达盒中，再将表达 盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或农杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达 载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介 导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
[0038] 转入本发明基因的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该 基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。
[0039] 本发明的基因可以在序列1的基础上进行以下修饰，再导入宿主中，以达到更好 的表达效果：
[0040] 1)为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可根据实际需 要进行修饰和优化。如可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编 码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，优化过程中，最好能使优化后的 编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量 可为35%，优选为多于45%，更优选为多于50%，最优选多于约60%。
[0041] 2)为了翻译的有效起始，可以修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列。例如，利用在植 物中已知的有效的序列进行修饰。
[0042] 3)将本发明基因与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达。所述 启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动 子。启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种。例如组织或 器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定。尽管证明了来源于双子 叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植 物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达。
[0043] 优选的组成型启动子包括CaMV35S和19S启动子。所述启动子还可为来源于在大 多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因中的启动子。另一个优选的组成型启动子为泛素 启动子。上述启动子还可为在根、木髓、叶或花粉中引导表达的启动子，即组织特异性启动 子。棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(美国专利US6, 040, 504)、水稻蔗糖合酶启动 子(美国专利US5, 604, 121)、夜香树黄化叶卷曲病毒启动子（W001/73087)。
[0044] 化学诱导型启动子可为Rab29A启动子(美国专利US5, 614, 395)。
[0045] 4)将本发明基因与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率。 例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9。任何已知在植物中起作用的可得到的终止子 都可以与本发明基因进行连接。
[0046] 5)可向本发明基因中引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和 bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV, MCMV和AMV)。
[0047] 在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技 术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞 中，就可定位了。
[0048] 上述重组载体中的出发载体可根据所使用的转化技术及靶植物物种的特性进行 选择。上述选择可体现在载体中的抗性标记的选择上。对于一些靶物种，可以优选不同的 抗生素或除草剂选择性标记。通常用在转化中的选择性标记包括赋予对卡那霉素和相关抗 生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，，赋予对抗生素潮霉素抗 性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因， 和提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
[0049] 在优选的实施方式中，将本发明的核苷酸序列直接转化到质体基因组中。质体转 化的主要优点是质体通常不需要实质修饰就能表达细菌基因，并且质体能表达单启动子控 制下的多个开放读框。通过同源重组将基因插入每个植物细胞中存在的所有几千个环形质 体基因组拷贝中的质体表达利用了拷贝数大大高于核表达基因的优势，使得表达水平可以 容易地超过总可溶植物蛋白质的10%。将本发明基因插入到质体靶向载体中，并且转化进 入期望的植物宿主质体基因组中。获得了对于含有本发明核苷酸序列的质体基因组而言属 同质的植物，该植物具有高水平地表达核苷酸序列的能力。
[0050] 本发明的实验证明，本发明从野生大豆中克隆了一个NAC家族的转录因子基因 GsNAC74,研究发现，GsNAC74基因的过量表达提高了转基因植株的耐逆性，干扰该基因表 达，降低转基因植株的耐逆性，因此该基因对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫 (耐盐/耐旱)作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治 理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定。
[0051] 下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

【专利附图】

【附图说明】
[0052] 图1为GsNAC74在野生大豆Y20中的表达受盐胁迫的诱导
[0053] 图 2 为植物表达载体 pBin438-GsNAC74 和 pZH01-GsNAC74-RNAi 的示意图
[0054] 图3为转GsNAC74毛状根的分子鉴定
[0055] 图4为转GsNAC74毛状根和对照在NaCl和PEG处理时的生长
[0056] 图5为转GsNAC74毛状根和对照在正常、盐和旱胁迫下的相对增长率

【具体实施方式】
[0057] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0058] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0059] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值土标准差。
[0060] 所有植物材料均生长于25° C每天的光照为16h/8h (光照/黑暗）。
[0061] 大?科丰 1 号（Glycine max L. Merr. Kefengl)记载在￥.1(.2]1&1^，￥.]\此1^，6· Z. Luo, J. S. Zhang, C. Y. He, X. L. ffu, J. Y. Gai, S. Y. Chen, QTL mapping of tenagronomic traits on the soybean(Glycine max L. Merr.) genetic map and theirassociation with EST markers, Theor. Appl. Genet, 2004, 108:1131-1139 中，公众可以从中国科学院遗传与 发育生物学研究所和黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所获得；
[0062] 植物双元表达载体pBin438记载在李太元，田颖川，秦晓峰，等.高效抗虫转基 因烟草的研究[J].中国科学（B辑），1994, 24 (3) : 276-282中，由中国科学院微生物研究所 方荣祥院士提供。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所和黑龙江省农业科学院耕 作栽培研究所获得。
[0063] 发根农杆菌 K5"记载在 Attila Kereszt, et al.，Agrobacteriurnrhizogenes-me diaded transformation of soybean to study of root biology, NatureProtocols, 2007 ,2(4),549-552)中，公众可从 Peter M Gressnon 教授，The Universityof Queensland, St Lucia, Queensland4072, Australia,获得，或经 Peter M Gressnon 教授同意（书面同意书） 后由中国科学院遗传与发育生物学研究所和黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所获得。
[0064] 载体 pZHOl 记载在 Han Xiao, et al. Functional analysis of the rice AP3homologue 0sMADS16by RNA interference,Plant Molecular Biology, 2003, 52, 957-966,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所和黑龙江省农 业科学院耕作栽培研究所获得。
[0065] 实施例1、大豆转录因子GsNAC74的获得及其表达受非生物胁迫诱导研究
[0066] 将耐盐野生大豆（Glycine soja Sieb. Et Zucc. ) Y20种子播种于装满蛭石的盆 中，生长于25±2°C，连续光照，两周后取出大豆苗，操作时注意避免伤根，进行盐处理：将 大豆根浸入200mM NaCl水溶液中，分别在0、1、3、12小时收集新鲜叶片和根各lg。将收集 的叶片和根分别混合，在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽 提，上清中加入无水乙醇沉淀得到叶片和根的总RNA。进行转录组分析。
[0067] 通过转录组分析，获得一批盐胁迫诱导的基因，筛选20个，鉴定在野生大豆叶片 和根中的表达水平。结果表明，其中一个基因的表达在大豆Y20中均受盐胁迫诱导，将该基 因命名为GsNAC74,其核苷酸序列为序列表中的序列1，该基因编码的蛋白命名为GsNAC74， 该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0068] 分析了盐胁迫下GsNAC74的表达特征。材料和处理同上，两周龄的Y20苗经 200mMNaCl处理0、1、3、12小时，分别收集叶片和根各lg，提取总RNA，反转录得到cDNA。以 cDNA为模板，用引物Primer-F和Primer-R进行Real Time PCR分析。
[0069] 大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-TF和Primer-TR。
[0070] Primer-F:5,-ATGGGTCTTAGAGACATTGGT-3，（序列 3)
[0071] Primer-R:5,-CATAACAAGACCACACTATTA-3，（序列 4)
[0072] Primer-TF :5' -AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3'
[0073] Primer-TR :5' -TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3'
[0074] Q-PCR得到的值是基因相对于GmTubulin的表达量。实验重复三次，结果取平均值 土标准差。
[0075] 结果如图1所示，GsNAC74基因在200mM NaCl处理时其转录水平均有不同程度升 高，在Y20叶中，处理1小时时下降，3小时回升，至12小时时急剧升高，而在根中的表达 变化趋势有所不同，在盐胁迫下1小时转录水平即升高，至6小时达到峰值，12小时略有下 降。总体上，GsNAC74无论在野生大豆Y20的叶还是根中均受盐胁迫的诱导表达。
[0076] 实施例2、转录因子GsNAC74基因在调控植物耐逆性中的应用
[0077] -、过表达载体 pBin438-GsNAC74 的构建 RNA 干扰载体 pZH01-GsNAC74-RNAi 构建
[0078] 1、转录因子GmMYB74基因的获得
[0079] 将实施例一中获得的野生大豆Y20的总RNA，反转录成cDNA为模板(也可人工合成 序列1所示的DNA分子作为模板)，用如下带BamH I酶切位点的上游引物和带SacI酶切位 点的下游引物进行PCR扩增，得到约891bp的PCR产物。
[0080] 引物为：
[0081] 带BamH I酶切位点的上游引物：
[0082] BamH IF-5, -cgGGATCCATGGGTCTTAGAGACATTGGT-3，（序列 5)
[0083] 带Sac I酶切位点的下游引物：
[0084] Sac IR-5, -cGAGCTCTCATAACAAGACCACACTATTA-3'（序列 6)
[0085] 经过测序，该PCR产物大小约为891bp，具有序列表中的序列1所示的核苷酸，即 为GsNAC74,其编码的蛋白为GsNAC74,其氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0086] 2、过表达载体pBin438-GsNAC74的构建
[0087] 用限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切由上述一得到的PCR产物，回收酶切产 物，将该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体pGEM-T Easy (Promega)连接，将连接产物 转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳 性克隆，得到含有回收片段的重组质粒pGEM-T Easy-GsNAC74。以该重组质粒载体上的T7 和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明该PCR产物具有序列表 中序列1所示的核苷酸，为GsNAC74,由891bp组成。
[0088] 以上述重组质粒pGEM-T Easy_GsNAC74为模板，以上述引物(带BamH I酶切位点 的上游引物和带Sac I酶切位点的下游引物)扩增GsNAC74,得到约891bp的PCR产物。将 该PCR产物用BamH I和Sac I酶切，得到酶切产物与经过同样酶切的载体pBin438连接， 得到重组载体PBin438-GsNAC74,经过过测序，该重组载体为将序列表中的序列1所示的核 苷酸插入pBin438的BamH I和Sac I酶切位点之间得到的载体，且序列表中的序列1位于 CaMV35S启动子之后。重组表达载体pBin438-GsNAC74结构示意图示于图2A。
[0089] 3、RNA 干扰载体 pZH01-GsNAC74-RNAi 构建
[0090] 以上述重组质粒pGEM-T Easy_GsNAC74为模板，用下列引物（Xbal SacI)F和 (SallKpnl) R扩增出412bp片段，经过测序该片段具有序列表中序列1自5'末端第126-537 位核苷酸。
[0091] (Xbal SacI)F-5'GCTCTAGAGAGCTCGATGGAAATTGACTTGCACAC3'
[0092] (Sail KpnI)R-5, ACGCGTCGACGGTACCCGAAGCCAAAGTTAGGGATG3，
[0093] 将PCR产物与RNAi载体pZHOl的链接，具体如下：第一链用Sac I和Κρη I双酶 切链接，然后使用Xba I和Sal I双酶切将反链连接到第一链阳性克隆上，获得植物表达载 体 pZH01-GsNAC74-RNAi。
[0094] 经过测序，pZH01-GsNAC74-RNAi (部分结构示意图如图2B)为将序列1的自5'末 端第126-537位核苷酸插入pZHOl载体的SacI和ΚρηΙ酶切位点，且将序列1的自5'末端 第126-537位核苷酸的反向互补序列插入pZHOl载体的Sail和Xbal位点间，得到的载体， 为RNA干扰载体。
[0095] 二、过表达GsNAC74毛状根和RNA干扰GsNAC74毛状根的获得
[0096] 1、转化
[0097] 1)将上述一获得的重组表达载体pBin438-GsNAC74和pZH01-GsNAC74-RNAi，分别 通过电击法导入转化发根农杆菌K599,得到重组农杆菌K599/pBin438-GsNAC74和重组农 杆菌 K599/GsNAC74-RNAi。
[0098] 提取重组农杆菌K599/pBin438-GsNAC74的质粒，送去测序，结果为该质粒为 pBin438-GsNAC74,说明重组菌构建正确。
[0099] 提取重组农杆菌K599/GsNAC74-RNAi的质粒，送去测序，结果为该质粒为 pZHOl-GsNAC74-RNAi，说明重组菌构建正确。
[0100] 2)用注射器将重组农杆菌 K599/pBin438-GsNAC74 和 K599/GsNAC74-RNAi 分别 接种生长6天含两片真叶的大豆科丰1号（以下也称为野生型大豆）幼苗，保湿生长：光 照16小时，温度25°C，湿度50%。2周后，长出毛状根即为转化的毛状根。获得58个转 pBin438-GsNAC74毛状根根系和58个转GsNAC74-RNAi毛状根根系，分别标记为OE和RNAi， 可进一步作转基因鉴定和耐逆性检测。
[0101] 以相同的方法将空载体pBin438转入大豆科丰1号幼苗，得到57个转空载体毛状 根根系，以作为实验对照。
[0102] 以相同的方法将空载体pZHOl转入大豆科丰1号幼苗，得到39个转pZHOl毛状根 根系。
[0103] 2、转基因毛状根分子鉴定
[0104] 分别提取转pBin438-GsNAC74毛状根、转GsNAC74-RNAi毛状根、转pBin438毛状 根和转pZHOl毛状根的的总RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，用Primer-73F和 Primer-73R作为引物进行进行GsNAC74基因表达量分析。Real-Time PCR反应使用Τ0Υ0Β0 公司的RealTime PCR Master Mix试剂盒，并按照说明进行操作。GsNAC74基因表达量检测 所用引物为同上；大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-TF和Primer-TR。实验 重复三次，结果取平均值土标准差。
[0105] Primer-73F :5, -ATGGGTCTTAGAGACATTGGT-3，（序列 3)
[0106] Primer-73R :5, -CATAACAAGACCACACTATTA-3'（序列 4)
[0107] Primer-TF :5' -AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3'
[0108] Primer-TR :5' -TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3'
[0109] 结果如图3所示，图3A为转GsNAC73-RNAi毛状根（记作GsNAC74-RNAi)和转 pZHO 1毛状根(记作K599 )中GsNAC74表达的RT-PCR检测结果，表明，在K599中检测到内源 GsNAC74的表达，而转GsNAC73-RNAi毛状根中没有检测到GsNAC74的表达；
[0110] 图 3B 显示了 Real Time PCR 检测转 pBin438-GsNAC74 毛状根（记作 74-0E)和转 pBin438毛状根(记作K599)中GsNAC74表达的结果，从图中看出，以大豆GmTubulin基因为 内标，转pBin438-GsNAC74毛状根中GsNAC74的相对表达量约为65% ;转pBin438毛状根中 检测出的GsNAC74的相对表达量是大豆原有的GsNAC74的表达，约为2%。
[0111] 从上述结果可以看出，转pBin438-GsNAC74毛状根中，GSNAC74的表达量远高于转 空载体根系中GsNAC74的表达量；而转GsNAC74-RNAi毛状根中，几乎检测不到GsNAC74的 表达。
[0112] 因此，转pBin438-GsNAC74毛状根为过表达GsNAC74毛状根；转GsNAC74-RNAi毛 状根为RNA干扰GsNAC74毛状根。
[0113] 三、过表达GsNAC74毛状根和RNA干扰GsNAC74毛状根耐逆性鉴定
[0114] 实验样本为转pZHOl毛状根、转pBin438毛状根、转pBin438-GsNAC73毛状根和转 GsNAC73-RNAi 毛状根。
[0115] 1、耐盐性鉴定
[0116] 转 pBin438 毛状根（记作 K599)、转 pBin438-GsNAC74 毛状根（记作 GsNAC74-0E)和 转GsNAC74-RNAi毛状根（记作GsNAC74-RNAi )各取6个浸入80mM NaCl水溶液中，25 ° C 处理3天。以在水中25° C生长3天为对照。实验重复三次，结果取平均值土标准差。
[0117] 处理3天后，拍照观察，结果如图4的前两行所示，经80mM NaCl处理3天的转 pBin438 毛状根（记作 K599)、转 pBin438-GsNAC74 毛状根（记作 74-0E)和转 GsNAC74-RNAi 毛状根（74-RNAi)的三者表型有显著差异。
[0118] 具体测量各组根系(统计主根长度)，
[0119] 在水中25° C生长3天各株系的根长如图5A所示，转pBin438毛状根(记作 K599)、转 pBin438-GsNAC74 毛状根(记作 74-0E)和转 GsNAC74-RNAi 毛状根(记作 74-RNAi) 的根长分别为3. 2±0. 6、3. 3±0. 5、3. 2±0. 3厘米。
[0120] 80mM NaCl水溶液处理组根长结果如下：
[0121] 转pBin438毛状根(记作K599)处理前和处理后根长平均值分别约为1. 7±0. 4和 2. 0±0. 4 厘米；
[0122] 转pBin438-GsNAC74毛状根(记作74-0E)处理前和处理后根长分别为平均值分别 约为1. 7±0. 3和2. 4±0. 3厘米；
[0123] 转GsNAC74-RNAi毛状根(记作74-RNAi)处理前和处理后根长分别为平均值分别 约为1. 6±0. 4和1. 7±0. 4厘米。
[0124] 再计算每一根毛状根的增长率=(处理后根长-处理前根长)/处理前根长，然后取 平均值土标准差；将增长率作图如图5B所示，经80mM NaCl水溶液处理3天后，过量表达 毛状根74-0E的相对增长率为42 ± 2%，转pBin438毛状根K599的相对增长率为16 ± 3%，转 GsNAC74-RNAi毛状根的相对增长率为5±4%，三者间有显著差异。统计数据表明，GsNAC74 的过量表达显著增加了毛状根对盐胁迫的耐性，而GsNAC74基因表达的受阻，明显降低了 毛状根的耐盐性，它们的差异为极显著。
[0125] 采用同样的方法处理、检测转pZHOl毛状根，结果与转pBin438毛状根无显著差 异。
[0126] 2、耐旱性鉴定
[0127] 以聚乙二醇6000 (PEG)处理模拟干旱胁迫。将转pBin438毛状根(记作K599)、 转pBin438-GsNAC74毛状根（记作74-0E)和转GsNAC74-RNAi毛状根（记作74-RNAi)分别 浸入4% (体积百分含量）PEG在25° C处理3天。每个根系各为6个。
[0128] 实验重复三次，结果取平均值。
[0129] 毛状根测量具体如下(统计主根长度）：
[0130] 转pBin438毛状根(记作K599)处理前和处理后根长分别为平均值分别约为 1. 7±0· 2 和 2. 0±0· 3 厘米；
[0131] 转PBin438-GsNAC74毛状根(记作74-0E)处理前和处理后根长分别为平均值分别 约为1. 6±0. 4和2. 9±0. 5厘米；
[0132] 转GsNAC74-RNAi毛状根(记作74-RNAi)处理前和处理后根长分别为平均值分别 约为1. 7±0. 3和1. 9±0. 4厘米。
[0133] 计算毛状根的相对增长率。计算毛状根长度增长率的公式同上。实验重复三次， 结果取平均值。
[0134] 结果如图5C所示，经4%PEG处理后，转pBin438-GsNAC74毛状根74-0E、转 GsNAC74-RNAi毛状根74-RNAi与转pBin438毛状根K599间根的相对增长率有显著差别； 具体如下：转pBin438毛状根K599增长率约为20±4%，转GsNAC74-RNAi毛状根74-RNAi 的相对增长率为4±3%，而转pBin438-GsNAC74毛状根74-0E的增长率约为84±9%，转 PBin438-GsNAC74毛状根74-0E的增长率与转pBin438毛状根的增长率有极显著差异。
[0135] 采用同样的方法处理、检测转pZHOl毛状根，结果与转pBin438毛状根无显著差 异。
[0136] 结果表明，GsNAC74的过量表达明显提高了毛状根的耐旱能力，而该基因的失活， 则降低了毛状根的耐旱性，它们间的差异均达到极显著水平。
[0137] 上述实施例说明，野生大豆转录因子NAC家族成员GsNAC74与植物的耐盐、耐旱性 相关，其过量表达显著增加植物的耐盐、耐旱性。
[0001] 序列表 <uo>中国科学院遗传与发育生物学研究所；黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所 <120〉GSNAC74及其编码基因在培育酎逆性植物中的应用 <160>6 <210> 1 <211> 891 <212> HNA <213〉 Glycine soja Sieb, Et Zucc. <400 1 atgggtctta gagacattgg tgcttcactg cccccagggt ttcggtttta cccgagtgat 60 gaggagttgg tccttcatta cctttacaaa aagatcacta atgaggaagt tctgaagggt 120 acettgatgg aaattgactt gcacacgtgc. gfcigccatggc aactcee.aga ggtggctaag 180 ctcaatgcaa acgaatggta cttcttcagc ttccgtgacc gtaaatatgc aaccggcttt 240 cgfiHccfiatc gcgcgacgac at.ctggctac tggaaagciia cggggaagga tcgtacggtg 300 tttgaccctg ccacgcgtga ggttgtaggg atgaggaaga cattggtgtt ctacaggaac 360 agggctccaa atggcatcaa aacgggttgg atcatgcatg agtttcgctt ggagacgcca 420 catttgccac ctaaggagga ctgggttttg tgtagagtgt ttcacaaggg caaagcagac 480 aacagtgcca aactcatcat gtacgagagc acagttccat ccctaacttt ggcttcgtca 540 tctccaacca accaaaacac cacaccatca attgggtata accaatttct tgccccattc 600 tcttcctcaa tggcaaccca tcatcacaat cacaatcatc atattccaaa ccaaagccaa 660 aacaacaaca acaacLcclt gaLggglctc cltcagllct clagggaaac aaacaccaac 720 aaclctagcB ccgllHclca atilLagLecc tiaaLglgalg aLaaLaaLgg aiaLgggiLe 780 ttatgggaca tggacctcga agaaaatagc ttcaatgatg gcgtggcatc aaacttggat 840 ggaatgagat tcttcgagct tgataataat aatagtgtgg tcttgttatg a 891 <210> 2
[0002] <211> 296 <212〉 PRT <213〉 Glycine soja Sieb. Et Zucc. <400> 2 Met Gl.y Leu Arg Asp Lie Gly Ala Ser Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe 1 5 10 15 Tyr Pro Ser Asp Clu Glu Leu Val Leu His Tyr Leu Tyr Lys Lys lie 20 25 30 Thr Asn Glu Glu Val Leu Lys Gly Thr Leu Met Glu lie Asp Leu His 35 40 45 Thr Cys Glu Pro Trp Gin Leu Pro Glu Val Al.a Lys Leu Asn Ala Asn 50 55 60 Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Phe Arg Asp Arg Lys Tyr Ala Thr Gly Phe 65 70 75 80 Arg Thr Asn Arg Ala Thr Thr Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys 85 90 95 Asp Arg Thr Yal Phe Asp Pro Ala Thr Arg Glu Val Val Gly Met Arg 100 105 110
[0003] Lys Thr Leu Val Phe Tyr Arg Asn Arg Ala Pro Asn Gly He Lys Thr 115 120 1^5 Gly Trp lie Met His Glu Phe Arg Leu Glu Thr Pit) His Leu Pro Pro 130 135 140 Lys Glu Asp Trp Val Leu Cys Arg Val Phe His Lys Gly Lys Ala Asp 145 150 155 160 Asn Scr Ala I.ys f.cu Tic Met Tyr Glu Ser Thr Val Pro Scr i ；ou Thr 165 170 175 Leu Ala Ser Ser Ser Pro Thr Asn Gin Asn Thr 丁hr Pro Ser lie Gly 180 185 190 Tyr Asn Gin Phe i,eu Ala Pro Phe Ser Ser Ser Met Ala Thr His His 195 200 205 His Asn His Asn His His He Pro Asn Gin Ser Gin Asn Asn Asn Asn 210 215 220 Asn Ser Leu Met Gly Leu Leu Gin Phe Ser Arg Glu Thr Asn Thr Asn 225 230 235 240 Asn Ser Ser Thr Val Thr Gin He Ser Pro Lys Cys Asp Asp Asn Asn
[0004] 245 250 255 Gly Tyr Gly Phe Leu Trp Asp Met Asp Leu Glu Glu Asn Ser Phe Asn 260 265 270 Asp Gly Val Ala Ser Asn Leu Asp Gly Met. Arg Phe 1'he G:[u Leu Asp 275 280 285 Asn Asn Asn Ser Val Val Leu Lei! 290 295 <210> 3 <211> 21 <212> DNA 〈213> 人工合成 <220〉 <223> <400> 3 atgggtctta gagacattgg t 21 <210> 4 <211> 21 〈212〉 DNA <213>人工合成 <220> <223 > <400> 4 cataacaaga ccacactatt a 21 <210> 5 <211> 29
[0005] <212> DNA <213>人工合成 <220> <223> <400> 5 cgggatccat gggtcttaga gacattggt 29 <2i0> 6 <211> 29 <212> DNA <213〉人工合成 <220> <223> <400> 6 cgagctctca taacaagacc acactatta 29
【权利要求】
1. 如下1) -3)中任一种物质在调控植物耐逆性或培养耐逆性植物中的应用： 1) 蛋白 GsNAC74 ; 2) 编码蛋白GsNAC74的DNA分子； 3) 含有编码蛋白GsNAC74的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述蛋白GsNAC74的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述编码蛋白GsNAC74的DNA分子的核 苷酸序列为序列表中的序列1 ; 所述含有编码蛋白GsNAC74的DNA分子的重组载体为将所述编码蛋白GsNAC74的DNA 分子插入表达载体中，得到表达蛋白GsNAC74的重组载体。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐干旱。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子 叶植物。
5. 沉默或抑制植物中蛋白GsNAC74表达的物质在降低植物耐逆性中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述沉默或抑制植物中蛋白GsNAC74表 达的物质为重组载体， 所述重组载体为将DNA分子1和DNA分子2均插入表达载体中，得到沉默或抑制植物 中蛋白GsNAC74表达的重组载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自5'末端第 126-537位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列。
7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐干旱。
8. 根据权利要求5-7中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子 叶植物。
9. 重组载体，为将编码蛋白GsNAC74的DNA分子插入表达载体中，得到表达蛋白 GsNAC74的重组载体；所述蛋白GsNAC74的氣基酸序列为序列表中的序列2 ;所述编码蛋白 GsNAC74的DNA分子的核苷酸序列具体为序列表中的序列1。
10. 重组载体，为将DNA分子1和DNA分子2均插入表达载体中，得到沉默或抑制植物 中蛋白GsNAC74表达的重组载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自5'末端第 126-537位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列。
【文档编号】C12N5/10GK104059137SQ201310092331
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月21日 优先权日:2013年3月21日
【发明者】陈受宜, 来永才, 张劲松, 牛灿芳, 李炜, 张万科, 毕影东, 肖佳雷, 林晴, 李琬, 马彪 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所, 黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所