专利名称：一种烟草赤星病菌孢子悬浮液及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种烟草赤星病菌孢子悬浮液及其应用。
背景技术：
烟草赤星病(Tobacco Brown Spot)是烟叶成熟期普遍发生的叶部病害，其病原为链格孢菌(Altorimriei alternata)。目前,在实验室一般采用平板培养菌丝、自然产孢后制备烟草赤星病菌孢子悬浮液，但其菌丝培养时间通常在10天以上才能长满平板，菌丝老熟、产孢量足以制备孢子悬浮液还需要继续培养5 10天，由于其培养时间长，容易造成培养基干燥，培养物污染，而且不经过诱导菌丝产孢效率低。尽管有个别研究通过紫外光诱导可加快产孢，但紫外剂量与时间难以控制，容易造成变异，也容易导致培养物污染。因此，如何更为有效的制备烟草赤星病菌孢子悬浮液是一个亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种培养快速、产孢量大、质量稳定的烟草赤星病菌孢子悬浮液，第二目的在于提供该烟草赤星病菌孢子悬浮液的应用。除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液是按以下步骤制备的:
A、病菌分离:从发病 田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；
B、病菌培养:将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3 4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27 29°C恒温培养4飞(1，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；
C、诱导产孢:将符合诱导产孢条件的培养基平板密封后置于2 4°C的冰箱内黑暗诱导培养2 3d，然后转入培养箱，黑暗、梯度降温培养，历时2 3d由20°C降温至15°C ；
D、制备孢子悬浮液:诱导培养完成后，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，组织捣碎f2min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。本发明的第二目的是这样实现的，所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在烟草品种抗感赤星病测定中的应用；或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在防治烟草赤星病药剂、生防菌或天然产物筛选中的应用；或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在研究烟草赤星病菌的土壤生态及病菌侵染循环中的应用。本发明采用多点接种方式，能够较快长满平板，比常规中央平板接种方式要缩短3 4天；通常病菌在培养基平板上由于营养耗尽、菌丝老熟而激发和促进自然产孢，产孢时间比较分散，比本发明产孢时间还要延长2 3天以上。本发明缩短培养时间达5 7天，培养周期大大缩短。本发明利用低温高湿刺激、梯度程序降温、黑暗诱导等方法的综合作用促进烟草赤星病菌快速、大量的产生孢子，病菌在前期适温、短时间光照(相当于短日照)培养时，菌丝生长速度快；在2 4°C黑暗冰箱中造成低温高湿刺激，20°C到15°C梯度程序降温、黑暗诱导直接促进了老熟菌丝大量产生孢子；经测算，同样大小的培养基平板，利用本发明方法产孢量为常规产孢量的5(Γ100倍。本发明由于接种量大、病菌前期培养菌丝生长快，诱导产孢时为密封状态，大大降低了培养物被污染的机会，从而保证了培养质量；培养菌丝、诱导产孢的时间相对固定、集中，能够达到同步生长、同步产孢，同一病菌同批次、不同批次间制备的孢子量差异小，所以质量更为稳定。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。本发明所述烟草赤星病菌孢子悬浮液是按以下步骤制备的:
Α、病菌分离:从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；
B、病菌培养:将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3 4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27 29°C恒温培养4飞(1，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；
C、诱导产孢:将符合诱导产孢条件的培养基平板密封后置于2 4°C的冰箱内黑暗诱导培养2 3d，然后转入培养箱，黑暗、梯度降温培养，历时2 3d由20°C降温至15°C (降温速率约每9.6 14.4h降温1°C);
D、制备孢子悬浮液:诱导培养完成后，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，组织捣碎f2min，使孢子与菌丝分`离、孢子从孢子链断开成单孢，然后过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。作为优选实施方式:
B步骤所述的培养基为燕麦培养基(0A)、马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、马铃薯蔗糖培养基(PSA)、查彼培养基(Czapek’ s medium)或理查培养基(Richard’ s medium)。D步骤所述的促进孢子萌发的溶液为f 2%的灭菌葡萄糖、果糖、蔗糖、蛋白胨溶液中一种或一种以上组合。或者，D步骤所述的促进孢子萌发溶液为2 5%感病品种烟草成熟的新鲜烟叶组织捣碎液，所述的组织捣碎液是经过滤灭菌的。所述的感病品种烟草为K326、云烟85或G140。D步骤所述的组织捣碎采用的是研钵、捣碎机或研磨机。D步骤所述的过滤为脱脂棉过滤或4飞层脱脂纱布过滤。本发明所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在烟草品种抗感赤星病测定中的应用，是将烟草赤星病菌孢子悬浮液调整浓度、加入分散剂作为烟草赤星病的人工接种物。或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在防治烟草赤星病药剂、生防菌或天然产物筛选中的应用，调整烟草赤星病菌孢子悬浮液浓度涂布平板即可。或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在研究烟草赤星病菌的土壤生态及病菌侵染循环中的应用，调整烟草赤星病菌孢子悬浮液浓度后，吸附于载体上，然后埋入或拌入土壤。本发明的工作原理:
本发明采用多点接种方式，加快了培养进程，缩短培养周期。本发明利用低温高湿刺激、梯度程序降温、黑暗诱导等方法的综合作用促进烟草赤星病菌快速、大量的产生孢子，产孢量为常规产孢量的5(Γ100倍。本发明由于接种量大、病菌前期培养菌丝生长快，诱导产孢时为密封状态，大大降低了培养物被污染的机会，从而保证了培养质量；培养菌丝、诱导产孢的时间相对固定、集中，能够达到同步生长、同步产孢，同一病菌同批次、不同批次间制备的孢子量差异小，所以质量更为稳定。实施例1
从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27°C恒温培养4d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于2°C的冰箱内黑暗诱导培养2d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时2d由20°C降温至15°C (降温速率约每9.6h降温1°C);诱导培养完成后，以1%的灭菌葡萄糖溶液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以研钵组织捣碎lmin，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用脱脂棉过滤过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。实施例2
从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于29°C恒温培养6d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于4°C的冰箱内黑暗诱导培养3d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时3d由20°C降温至15°C(降温速率约每14.4h降温ΓΟ;诱导培养完成后，以2%的灭菌果糖、蔗糖溶液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以捣碎机组织捣碎2min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用6层脱脂纱布过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。实施例3
从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于28°C恒温培养5d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于3°C的冰箱内黑暗诱导培养2.5d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时2.5d由20°C降温至15°C (降温速率约每12h降温1°C);诱导培养完成后，以1.5%的灭菌蔗糖、蛋白胨混合溶液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以研磨机组织捣碎1.5min,使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用4层脱脂纱布过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。 实施例4从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27°C恒温培养4d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于2°C的冰箱内黑暗诱导培养3d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时2d由20°C降温至15°C (降温速率约每9.6h降温1°C);诱导培养完成后，以经过滤灭菌的3.5%感病品种烟草G140成熟的新鲜烟叶组织捣碎液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以研钵组织捣碎lmin，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用5层脱脂纱布过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。实施例5
从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于29°C恒温培养6d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于4°C的冰箱内黑暗诱导培养2d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时3d由20°C降温至15°C(降温速率约每14.4h降温1°C);诱导培养完成后，以经过滤灭菌的2%感病品种烟草K326成熟的新鲜烟叶组织捣碎液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以研钵、捣碎机或研磨机组织捣碎2min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用脱脂棉过滤过滤 除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。实施例6
从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于28°C恒温培养5d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于3°C的冰箱内黑暗诱导培养2.5d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时2.5d由20°C降温至15°C (降温速率约每12h降温1°C);诱导培养完成后，以经过滤灭菌的5%感病品种烟草云烟85成熟的新鲜烟叶组织捣碎液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以研钵、捣碎机或研磨机组织捣碎1.5min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用4层脱脂纱布过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。实施例7
以赤星病菌97Aa003菌株按实施例1的方法制备烟草赤星病菌孢子悬浮液，并以该悬浮液进行品种抗性评价，具体步骤为:
1.材料与方法 1.1材料
供试品种为NC71、NC297、云烟201、KRK26共4个品种，抗病对照品种为净叶黄，感病对照品种为G140共6个品种。1.2 方法
1.2.1抗性测定品种的小区布置
试验处理为6个处理，每个品种为I个处理，每处理植烟30株，4次重复。小区随机排列。管理与种植同优质烤烟模式。试验用地约1.5亩。本试验在云南省烟草农业科学研究院研和试验基地进行。1.2.2病菌人工接种
封顶去2片脚叶后，将烟草赤星病菌孢子悬浮液用1%的葡萄糖稀释至10万个孢子/ml，按0.2%的质量比加入吐温80、过325目标准筛的硅藻土，搅拌均匀，喷雾处理中下部叶，至叶片布满均匀一层细小水珠为止，接种后在试验田中灌注水至半沟，保湿24 48h。1.2.3病情调查
在烟草赤星病菌接种的前一天，进行一次病情基数调查，接种后每7d调查一次病情。调查各处理的叶片，调查记载采用GB/T 23222 “烟草病害分级及调查方法”中烟草赤星病害的国家标准。以发病盛期时病情指数的高低，评价抗性。2.结果与分析
受试验品种的抗性测定结果见表I。表I抗性品种的测定结果(病情基数为O)
权利要求
1.一种烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征在于所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液是按以下步骤制备的: A、病菌分离:从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种； B、病菌培养:将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3 4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27 29°C恒温培养4飞(1，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢； C、诱导产孢:将符合诱导产孢条件的培养基平板密封后置于2 4°C的冰箱内黑暗诱导培养2 3d，然后转入培养箱，黑暗、梯度降温培养，历时2 3d由20°C降温至15°C ； D、制备孢子悬浮液:诱导培养完成后，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，组织捣碎f2min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。
2.根据权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是:B步骤所述的培养基为燕麦培养基、马铃薯葡萄糖培养基、马铃薯蔗糖培养基、查彼培养基或理查培养基。
3.根据权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是:D步骤所述的促进孢子萌发的溶液为广2%的灭菌葡萄糖、果糖、蔗糖、蛋白胨溶液中一种或一种以上组合。
4.根据权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是:D步骤所述的促进孢子萌发溶液为2 5%感病品种烟草成熟的新鲜烟叶组织捣碎液，所述的组织捣碎液是经过滤灭菌的。
5.根据权利要求4所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是:所述的感病品种烟草为K326、云烟85或G140。
6.根据权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是:D步骤所述的组织捣碎采用的是研钵、捣碎机或研磨机。
7.根据权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是:D步骤所述的过滤为脱脂棉过滤或4飞层脱脂纱布过滤。
8.—种权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在烟草品种抗感赤星病测定中的应用。
9.一种权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在防治烟草赤星病药剂、生防菌或天然产物筛选中的应用。
10.一种权利要求1所述的烟草赤 星病菌孢子悬浮液在研究烟草赤星病菌的土壤生态及病菌侵染循环中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种烟草赤星病菌孢子悬浮液及其应用，所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液是通过病菌分离、病菌培养、诱导产孢、制备孢子悬浮液步骤获得的。所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液应用于烟草品种抗感赤星病测定中，或防治烟草赤星病药剂、生防菌或天然产物筛选中，或研究烟草赤星病菌的土壤生态及病菌侵染循环中。本发明采用多点接种方式，培养速度快、培养周期短；利用低温高湿刺激、梯度降温、黑暗诱导等方法的综合作用促进烟草赤星病菌快速、大量的产生孢子，为常规产孢量的50~100倍。本发明方法污染小，培养菌丝、诱导产孢的时间相对固定、集中，同步生长、同步产孢，同批次、不同批次制备孢子量差异小，质量更为稳定。
文档编号C12R1/645GK103194421SQ20131009416
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月22日 优先权日2013年3月22日
发明者方敦煌, 刘勇, 李永平, 肖炳光 申请人:云南省烟草农业科学研究院