专利名称：一种l-赖氨酸联产l-乳酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物化工领域中的氨基酸串联生产有机酸的发酵方法，具体地说，涉及一种L-赖氨酸联产L-乳酸的方法。
背景技术：
谷氨酸棒杆菌作为工业氨基酸(如谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸等)生产的主力军，其中赖氨酸作为一种碱性必需氨基酸，广泛应用于食品、饲料和医药工业中，在平衡氨基酸组成方面起着十分重要的作用。目前，赖氨酸工业生产以谷氨酸棒杆菌发酵法为主，好氧发酵结束后产生的大量菌体一般被用于蛋白饲料加工或者是直接被废弃，存在一定的资源利用率低下，附加值不高。如果能够将好氧生产L-赖氨酸的废弃菌体经过简单的处理，直接用于厌氧生产L-乳酸，这种好氧、厌氧串联培养模式能够充分高效资源利用化，有效地解决L-赖氨酸生产后菌体的高附加值利用，以及厌氧生产L-乳酸菌体培养的高成本等问题。L-乳酸主要应用于食品工业、医药、化妆品等领域，也是生物可降解材料聚乳酸的单体之一。聚乳酸的生产和应用开发，为消灭“白色”污染产生划时代意义，市场潜力巨大。发酵法生产L-乳酸根据合成乳酸的代谢途径及生成产物的不同，可将乳酸发酵分为同型、异型和混合型，但是发酵过程中的共性都是以高密度的菌体培养为前提，这需要消耗大量的能耗，特别是对于聚乳酸取代传统塑料的生成成本成为很大的制约。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种L-赖氨酸联产L-乳酸的方法。该方法回收生产L-赖氨酸的菌体，再次厌氧发酵来生产L-乳酸，操作简单，设备要求不高，易于自动化控制，具有很好的经济效益。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:`
一种L-赖氨酸联产L-乳酸的方法，该方法包括如下步骤:(I)将L-赖氨酸生产菌好氧培养48 72h (优选60h)发酵生产L-赖氨酸；(2)离心收集好氧培养后的菌体,厌氧发酵培养基重悬该菌泥,然后转入发酵罐中，通入N2气体维持罐内正压,28 34°C (优选30°C)下,搅拌培养24 40小时,并维持厌氧发酵液的pH在6.5 7.5,发酵生产L-乳酸。步骤(I)中，所述的L-赖氨酸生产菌为常规使用的谷氨酸棒杆菌，如谷氨酸棒杆菌 Corynebacterium glutamicum ATCC21300 和谷氨酸棒杆菌 Corynebacteriumglutamicum ATCC21513。步骤⑴中，所述的好氧培养条件为:好氧培养基包括如下组分:葡萄糖80g/L，K2HPO4.3H201.0g/L, KH2PO4L Og/L,MgSO4.7Η200.25g/L, (NH4) 2S0440g/L, Mn2+、Fe2+0.02g/L, ZnCl2lmg/L, CuSO40.2mg/L,生物素100 μ g/L, VB1200 μ g/L, CaC0330g/L, pH 为 7.0 ;培养温度:28 34°C，优选30°C ；
通气比:0.5 1.5v/vm,优选 lv/vm。步骤(I)中，所述的厌氧发酵培养基包括如下组分:葡萄糖40 80g/L，K2HPO4.3H200.5g/L, KH2PO40.5g/L, MgSO4.7H200.5g/L, Mn2+、Fe2+0.02g/L,生物素 100 μ g/L,维生素 B1200 μ g/L,初始 ρΗ7.0。步骤(2)中，使用碳酸盐、氨水和碱液中的任意一种或几种的组合维持厌氧发酵液的pH在6.5 7.5。本发明的L-赖氨酸生产菌在好氧发酵之前许经过常规的种子培养:将于固体LB平板上30°C培养20 24h，然后用接种环挑取3环菌至装有30mL种子培养基的500mL摇瓶中，30°C，200r/min培养12 14h，此时的菌体0D_值约为25-28，然后一般按照3 (v/V) %接种量将种子液转接至发酵培养基进行好氧发酵培养。其中所述的种子培养基包括如下组分:葡萄糖 20g/L，K2HPO4.3H201.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4.7H200.4g/L，尿素 2.5g/L，Mn2+、Fe2+0.02g/L，生物素 100 μ g/L, VB1200 μ g/L, pH 为 7.0。有益效果:本发明与现有技术相比具有如下优势。1、对本发明获得的产物进行分析，谷氨酸棒杆菌在好氧条件下，积累18 22g/LL-赖氨酸；厌氧条件下，能显著的积累L-乳酸，因此其产业化的经济效益是明显的。2、利用本发明的方法，赖氨酸好氧发酵阶段结束时产生大量的菌体，直接利用其厌氧生产L-乳酸，省去了厌氧过程菌体富集的过程，有效的利用了生物质资源，降低了生产成本。厌氧发酵L-乳酸后的废弃菌体，可再生产蛋白饲料、核酸等，继续创造高附加值利润。3、本发明的生产工艺较原有的单纯好氧产氨基酸，厌氧产有机酸，菌体高效回收利用，无需添加格外的辅料 ，对环境无污染，是环境友好的工艺方法。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例中，种子培养基包括如下组分:葡萄糖20g/L，K2HPO4.3H201.5g/L, KH2PO40.5g/L，MgSO4.7Η200.4g/L，尿素 2.5g/L，Mn2+、Fe2+0.02g/L，生物素 100 μ g/L, VB1200 μ g/L, pH 为
7.0。好氧培养基包括如下组分:葡萄糖80g/L，K2HPO4.3H201.0g/L, KH2PO4L Og/L,MgSO4.7H200.25g/L, (NH4) 2S0440g/L, Mn2+、Fe2+0.02g/L, ZnCl2lmg/L, CuSO40.2mg/L,生物素100 μ g/L, VB1200 μ g/L, CaC0330g/L, pH 为 7.0。厌氧发酵培养基包括如下组分:葡萄糖40 80g/L，K2HPO4.3H200.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4.7Η200.5g/L, Mn2+、Fe2+0.02g/L，生物素 100 μ g/L，维生素 B1200 μ g/L，初始ρΗ7.0。所述的赖氨酸生产菌Corynebacterium glutamicum ATCC21300 和Corynebacterium glutamicum ATCC21513均为常规使用的谷氨酸棒杆菌,可市售获得。实施例1:
将L-赖氨酸生产菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC21513)于固体LB平板上30°C培养20h，用接种环挑取3环菌至30mL种子培养基，30°C，200r/min培养12h，按接种量3 (v/v) %将种子液转移至发酵培养基,30°C, 500r/min,通气比为lv/vm,培养60h。好氧发酵结束后，5000r/min离心IOmin,收集菌体,用厌氧发酵培养基(其中含40g/L葡萄糖)洗漆一次，然后重悬在厌氧发酵培养基中，转入发酵罐中，通入N20.2v/vm,转速200r/min, 30°C培养24h。发酵结果，好氧阶段L-赖氨酸产量为18.6g/L，厌氧阶段L-乳酸产量为30.2g/L。实施例2:将L-赖氨酸生产菌(Corynebacterium glutamicum ATCC21300)于固体 LB 平板上30°C培养20h，用接种环挑取3环菌至30mL种子培养基，30°C，200r/min培养12h，按接种量3 (v/v) %将种子液转移至发酵培养基，300C，200r/min,通气比为lv/vm，培养60h。好氧发酵结束后，5000r/min离心IOmin,收集菌体,用厌氧发酵培养基(其中含80g/L葡萄糖)洗漆一次，然后重悬在厌氧发酵培养基中，转入发酵罐中，通入N20.2v/vm,转速200r/min,30°C培养40h。测定发酵产物，好氧阶段L-赖氨酸产量为18.2g/L，厌氧阶段L-乳酸产量为 64.8g/L。实施例3:
将L-赖氨酸生产菌(Corynebacterium glutamicum ATCC21513)于固体 LB 平板上30°C培养20h，用接种环挑取3环菌泥至30mL种子培养基，30°C，200r/min培养12h，按接种量3 (v/v) %将种子液转移至发酵培养基，300C，500r/min,通气比为lv/vm，培养72h，通气比为lv/vm。好氧发酵结束后，5000r/min离心IOmin,收集菌体,用厌氧发酵培养基(其中含60g/L葡萄糖)洗涤一次，然后重悬在厌氧发酵培养基中，转入发酵罐中，通入N20.2v/Vm，200r/min，3(TC培养40h。测定发酵产物，好氧阶段L-赖氨酸产量为21.5g/L，厌氧阶段L-乳酸产量为51.3g/L。实施例4:将L-赖氨酸生产菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC21300)于固体LB平板上30°C培养20h，用接种环挑取3环菌泥至30mL种子培养基，30°C，200r/min培养12h，按接种量3(v/v)%将种子液转移至发酵培养基，30°C，500r/min，通气比为lv/vm，培养72h。好氧发酵结束后，5000r/min离心IOmin,收集菌体,用厌氧发酵培养基(其中含40g/L葡萄糖)洗漆一次，然后重悬在厌氧发酵培养基中，转入发酵罐中，通入N20.2v/vm, 200r/min, 30°C培养40h。测定发酵产物，好氧阶段L-赖氨酸产量为20.5g/L，厌氧阶段L-乳酸32.7g/L。
权利要求
1.一种L-赖氨酸联产L-乳酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: (1)将L-赖氨酸生产菌好氧培养48 72h发酵生产L-赖氨酸； (2)离心收集好氧培养后的菌体，厌氧发酵培养基重悬该菌泥，然后转入发酵罐中，通入N2气体维持罐内正压，28 34°C下，搅拌培养24 40小时，并维持厌氧发酵液的pH在6.5 7.5，发酵生产L-乳酸。
2.根据权利要求1所述的L-赖氨酸联产L-乳酸的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的L-赖氨酸生产菌为常规使用的谷氨酸棒杆菌。
3.根据权利要求1所述的L-赖氨酸联产L-乳酸的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的好氧培养条件为: 好氧培养基包括如下组分:葡萄糖80g/L, K2HPO4.3Η201.0g/L, KH2PO4L Og/L,MgSO4.7Η200.25g/L, (NH4) 2S0440g/L, Mn2+、Fe2+0.02g/L, ZnCl2lmg/L, CuSO40.2mg/L,生物素100 μ g/L, VB1200 μ g/L, CaC0330g/L, pH 为 7.0 ;培养温度:28 34°C ; 通气比:0.5 1.5v/vm。
4.根据权利要求1所述的L-赖氨酸联产L-乳酸的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的厌氧发酵培养基包括如下组分:葡萄糖40 80g/L，K2HPO4.3H200.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4.7Η200.5g/L,Mn2+、Fe2+0.02g/L,生物素 100 μ g/L，维生素 B1200 μ g/L，初始 ρΗ7.0。
5.根据权利要求1所述的L-赖氨酸联产L-乳酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，使用碳酸盐、氨水和碱液中的任意一种或几种的组合维持厌氧发酵液的pH在6.5 7.5。
全文摘要
本发明公开了一种L-赖氨酸联产L-乳酸的方法，该方法包括如下步骤(1)将L-赖氨酸生产菌好氧培养48～72h发酵生产L-赖氨酸；(2)离心收集好氧培养后的菌体，厌氧发酵培养基重悬该菌泥，然后转入发酵罐中，通入N2气体维持罐内正压，28～34℃下，搅拌培养24～40小时，并维持厌氧发酵液的pH在6.5～7.5，发酵生产L-乳酸。对发酵后的产品进行分析，在好氧条件下谷氨酸棒杆菌能够很好的积累L-赖氨酸，厌氧条件下积累大量L-乳酸。
文档编号C12R1/15GK103184247SQ201310119660
公开日2013年7月3日 申请日期2013年4月8日 优先权日2013年4月8日
发明者孟虎 申请人:绍兴市安杰生物科技有限公司