专利名称：霍乱弧菌的实时荧光pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于检验检疫领域，涉及霍乱弧菌的实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，具体涉及一种应用免疫磁珠技术进行霍乱弧菌检测的方法。
背景技术：
霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholera，VC)引起的烈性肠道传病，该病起病急、传播快、涉及范围广，属国际检疫传染病，在我国被列为甲类传染病之一，是主要食源性致病微生物之一，时时威胁着人类并给人类带来危害。人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或饮食经口传染。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过粘膜表面的粘液层，通过菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便急骤发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血液，在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌，从而患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”并含大量弧菌，此为本病典型的特征。目前，该菌是多数进出口水产品必检的致病菌之一。目前检测食品中致病微生物的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定方法，该方法所需时间长，一般情况下需要5 7天，有时达到10 15天，很难满足快速鉴定的需要；实时荧光PCR (RT-PCR)技术是近几年发展起来的基于检测遗传物质的技术，该技术已经应用在微生物检测、基因表达、新生物医药的筛选等领域，该技术具有高特异性、高灵敏度的特点，所需检测时间短，整个PCR过程只需2个小时左右，经大量的科研实践证明，在检测特异性和灵敏度方面，实 时荧光PCR技术与传统方法相当，但是极大地缩短了检测时间，整个检测过程从5 7天时间，缩短到2 3天，节约了时间，缩短了货物在口岸的停留时间，最根本的保护了广大消费者的利益。纳米磁珠是运用纳米技术，在传统生物学和现代分子生物技术的基础上，开展生物科学、医学等方面的研究。在分子、细胞和个体水平上为食源性致病菌检测和疾病的诊断等方面提供新材料、新技术和新方法。纳米磁珠在生物样品的分离分析中有着重要应用价值:(1)高效富集:纳米磁珠比表面积大，显著增加反应界面能够高效富集生物样品；(2)非常有效的去除PCR反应中的抑制剂:以现在的检测方法，不同种的致病微生物采用不同的增菌液，增菌液中的添加剂往往对PCR反应有较强的抑制作用，采用磁珠分离的方法可以非常有效的去除抑制剂；(3)可操作性:纳米磁珠具有超顺磁效应，外加磁场能够快速对其进行移动和分离；(4)标记性质:生物分子标记方法简单、可靠。抗体是一类重要的生物活性材料，广泛应用于检验检疫、疾病诊断、药物筛选、国防、航天、司法鉴定、食品卫生、环境监测及军事侦检等领域，已成为发展新型免疫检测技术和推动检测检疫产业快速发展的重要资源。本发明应用与抗霍乱弧菌单克隆抗体偶联的纳米磁珠，即免疫磁珠(Immunomagnetic Beads, IMB),其具有选择性好,特异性强，能起到富集浓缩细菌的作用，有效避免或减少漏检，且可去除食品样品中抑制PCR反应的成分。将免疫磁珠分离(Immunomagnetic separation, IMS)与 RT-PCR 技术相结合，建立 IMS-RT-PCR 检测方法，可以极大地提高检测效率。并由此开发了霍乱弧菌MS-RT-PCR检测试剂盒，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测霍乱弧菌的RT-PCR寡核苷酸。本发明要解决的第二个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的霍乱弧菌的RT-PCR检测试剂盒。本发明要解决的第三个技术问题是提供一种霍乱弧菌的IMS-RT-PCR检测方法。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:本发明提·供了一组检测霍乱弧菌的寡核苷酸，是依据NCBI收录号DQ772779(DnaA)对应的基因序列设计的，由序列表SEQ ID N0.1至序列表SEQ ID N0.3所不喊基序列组成；其中序列SEQ ID N0.1为正义引物(P1)，序列SEQ ID N0.2为反义引物(P2)，序列SEQ ID N0.3为荧光探针(P)，探针的5’端标记报告荧光基团为FAM (6-羧基荧光素)，3’端标记淬灭荧光基团为TAMRA。详见表I。表1引物序列
权利要求
1.一组检测霍乱弧菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQ ID N0.1至序列表SEQ ID N0.3所示；其中序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2分别为检测霍乱弧菌的正义引物和反义引物，序列SEQ ID N0.3为检测霍乱弧菌的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的检测霍乱弧菌的寡核苷酸，其特征在于，所述荧光探针序列SEQ ID NO:3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。
3.权利要求1或2所述的检测霍乱弧菌的寡核苷酸在制备检测霍乱弧菌试剂盒中的应用。
4.一种霍乱弧菌的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下物质: (O偶联有抗霍乱弧菌单克隆抗体的免疫磁珠； (2)RT-PCR反应液，其包括:序列表SEQID N0.1所示的正义引物，序列表SEQ ID N0.2所示的反义引物，序列表SEQ ID N0.3所示的荧光探针； (3)阴性对照； (4)阳性对照。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述抗霍乱弧菌单克隆抗体为保藏编号为CGMCC N0.6754的杂交瘤细胞株分泌产生的霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液还包括TaqManGene Expression Master Mix 溶液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液中各种成分的使用终浓度为 IXTaqMan Gene Expression Master Mix 溶液、0.4 μ M 正义引物、0.4 μ M 反义弓丨物、0.4μ M荧光探针。
8.一种霍乱弧菌的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: O免疫磁珠富集菌体； 2)提取菌体的DNA； 3)进行RT-PCR反应，其中，使用序列表SEQID N0.1所示的正义引物，序列表SEQ IDN0.2所示的反义引物，序列表SEQ ID N0.3所示的荧光探针，所述荧光探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA ； 4)根据实时荧光RT-PCR反应体系的荧光强度进行结果判定。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(I)中，所述免疫磁珠为偶联有抗霍乱弧菌单克隆抗体的免疫磁珠。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述抗霍乱弧菌单克隆抗体为保藏编号为CGMCC N0.6754的杂交瘤细胞株分泌产生的霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种霍乱弧菌的实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，具体涉及一组检测霍乱弧菌的寡核苷酸，其具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.3所示的序列，及含有这些寡核苷酸的试剂盒及其检测方法，本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便。
文档编号C12N15/11GK103160605SQ20131011960
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月8日 优先权日2013年4月8日
发明者曾静, 张西萌, 张琳, 张蕾, 魏海燕, 马丹 申请人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心