专利名称：Sr48692在制备抗胶质瘤的药物或保健品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及SR48692在药物和保健品制备领域的新用途。
背景技术：
胶质瘤是目前我国最常见的一种原发恶性脑肿瘤。据国内多家医院统计资料显示，胶质瘤占颅内肿瘤的35.269Γ60.96%，平均44.69%，且近年来发病率呈逐年增加的趋势。由于胶质瘤的侵袭性生长方式，与周围的正常脑组织界限模糊，很难通过手术彻底清除。目前针对术后残留的胶质瘤细胞，主要采用放疗、化疗等措施来加以杀灭，然而这些术后残留病变对放疗、化疗等措施表现出显著的抵抗性，往往导致肿瘤复发，患者预后不佳。近10年来，尽管胶质瘤的综合治疗如手术、放疗、化疗、生物治疗等方面取得了一系列进展，但治疗效果尚不令人满意，胶质瘤患者的平均生存期仍然较短，2年生存率不足30%，5年生存率不足5%。因此，新的有效治疗策略和治疗药物的研究将对恶性胶质瘤的治疗产生积极影响。神经紧张素(NTS)通过与神经紧张素受体(NTSR)结合，在中枢和外周神经系统中起神经递质和神经调节的作用。SR48692是首个非肽类的神经紧张素受体I (NTSRl)拮抗齐U，化学名为2- ([1- (7-氯-4-喹啉基)-5- (2，6- 二甲氧基苯基)-1H-吡咯-3-羰基]氨基)金刚烷-2-羧酸，目前作为一种科学研究试剂，主要用于探索大脑中NTS与其它神经传导物质之间的相互作用。部分动物实验结果显示，SR48692具有镇静、反药物依赖和记忆减退的作用。既往研究还发现，在乳腺癌的前期临床肿瘤模型中，SR48692具有一定的抗癌效果。但迄今为止 ，SR48692对恶性胶质瘤的作用仍然未知。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供SR48692在制备抗胶质瘤的药物或保健品中的应用。肿瘤细胞的最主要特征是持续不断地增殖和迁移。本发明首次发现SR48692具有能够抵抗恶性胶质瘤的新功能，主要通过阻断ERK和MET/AKT信号通路，进而抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移，在进一步的胶质瘤动物模型实验中也证实了上述结论，表明SR48692可以用于制备抗胶质瘤的药物或保健品。本发明的有益效果在于，本发明公开了 NTSRl拮抗剂SR48692在药物和保健品制备领域的新用途，不仅扩大了 SR48692的应用范围，提高了其应用价值，给恶性胶质瘤的治疗带来了新的希望，还有助于进一步开发新的药物或保健品，以SR48692为先导化合物，通过结构修饰或改造，有望进一步提高其活性或降低副作用。本发明受国家自然科学基金青年基金项目(N0.30901538)、国家自然科学基金青年-面上连续资助项目(N0.81270039)和家蚕基因组生物学国家重点实验室开放课题(N0.20120014)资助。
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明:
图1显示了 SR48692能够有效抑制胶质瘤细胞的增殖，A为CCK-8法检测细胞增殖结果，B为BrdU标记法检测细胞增殖结果；图中SR表示SR48692，*表示与对照组(control)比较 P < 0.01。图2显示了 SR48692能够有效抑制胶质瘤细胞的迁移，A为Transwell穿孔实验结果，B为免疫印迹实验结果；图中SR表示SR48692，NTS-NA表示NTS中和抗体，*表示与对照组比较P < 0.01 ;#表示与IOnM NTS组比较P < 0.01。图3显示了 SR48692在胶质瘤原位接种的鼠模型上具有抑制胶质瘤生长和迁移的功能，A为小鼠生存曲线，B为死亡小鼠的大脑，C为死亡小鼠大脑的HE染色结果，图中SR表示 SR48692。
具体实施例方式下面将结合附图，对SR48692抑制胶质瘤细胞增殖和迁移的作用及其效果进行详细的描述。一、SR48692能够有效抑制胶质瘤细胞的增殖
通过CCK-8法和BrdU标记法检测胶质瘤细胞系GL261的增殖能力，了解SR48692对GL261增殖的影响。CCK-8法:将GL261细胞以 密度为2X IO3个/孔接种于96孔细胞培养板，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基100 μ 1，37°C培养过夜，次日将培养基更换为无血清DMEM/F12培养基，继续培养12小时后，分为四组(实验组1、2、3和对照组，每组设3个复孔)，实验组I加入终浓度为5nM的NTS，实验组2加入终浓度为5nM的NTS和终浓度为5 μ M的SR48692，实验组3加入终浓度为5ηΜ的NTS和终浓度为10 μ M的SR48692，对照组加入用于配制SR48692溶液的溶剂DMS0，各组分别于处理后第0、24、48、72、96、120小时加入CCK-8溶液(Ce 11 Counting Kit_8)，用酶标仪测定在波长450nm处的吸光值(0D值)，绘制各组OD值随时间的变化曲线(即细胞生长曲线)，以检测各组细胞的增殖能力。BrdU标记法:将预先经多聚赖氨酸包被的圆形玻片即爬片用75%乙醇消毒，自然晾干之后置于24孔细胞培养板的孔底部，将GL261细胞以密度为2 X IO4 /ml接种于爬片上，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基100 μ 1，37°C培养过夜，次日将培养基更换为无血清DMEM/F12培养基，继续培养12小时后，分为四组(实验组1、2、3和对照组)，实验组I加入终浓度为5nM的NTS，实验组2加入终浓度为5nM的NTS和终浓度为5 μ M的SR48692，实验组3加入终浓度为5ηΜ的NTS和终浓度为10 μ M的SR48692，对照组加入用于配制SR48692溶液的溶剂DMS0，处理48小时后各组加入终浓度为30 μ g/L的BrdU，37°C孵育40分钟，弃去培养液，PBS洗涤3次(每次5分钟)，加入4%多聚甲醛固定15分钟，用含
0.3%Triton X-100的PBS洗涤3次以增加细胞膜通透性，再加入10%山羊血清室温封闭30分钟，PBS洗涤3次，再加入一抗即抗大鼠BrdU单抗(工作浓度1:100)，4°C孵育过夜，PBS洗涤3次，再加入二抗即Cy3标记山羊抗大鼠抗体(工作浓度1:500)，室温孵育2小时，PBS洗涤3次，再加入DAPI染液处理15分钟，PBS洗涤3次，最后取出爬片，用抗荧光淬灭剂封于载玻片，在激光共聚焦显微镜下随机计数这四组爬片中10个20倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，统计每组的BrdU阳性率。结果见图1。CCK-8法检测细胞增殖结果显示，SR48692对胶质瘤细胞系GL261的增殖具有明显的抑制作用，并呈现剂量依赖效应；在SR48692分别对GL261细胞处理24、48、72、96、120小时的情况下，相比于对照组，5 μ M和10 μ M浓度的SR48692均能够明显地抑制胶质瘤细胞的增殖，而随着SR48692浓度的增加，对胶质瘤细胞增殖的抑制效果逐步增强(图1Α)。BrdU标记法检测细胞增殖结果显示，同对照组相比，胶质瘤细胞经过5μΜ浓度的SR48692处理48小时后，BrdU阳性率明显降低；经过10 μ M浓度的SR48692处理48小时后，胶质瘤细胞无肉眼可见的BrdU阳性信号，表明10 μ M浓度的SR48692能够明显地抑制胶质瘤细胞的增殖(图1Β)。二、SR48692能够有效抑制胶质瘤细胞的迁移
通过transwell穿孔实验、划痕愈合实验和免疫印迹实验检测胶质瘤细胞系GL261的迁移能力，了解SR48692对GL261迁移的影响。Transwell穿孔实验:设置实验组1、2和对照组，各组将GL261细胞以密度为
IX IO6个/ml铺在Transwell小室底部的上室面(孔径为8 μ m)，再将小室置24孔细胞培养板中，用无血清DMEM/12培养基培养，然后，实验组I加入终浓度为5nM的NTS和终浓度为5 μ M的SR48692，实验组2加入终浓度为5ηΜ的NTS和终浓度为2ng/ml的NTS中和抗体，对照组加入终浓度为5nM的NTS，处理3小时后取出小室，用棉签反复擦拭除去小室上室内的细胞，用4%多聚甲醛溶液固定小室下室内的细胞15分钟，再用结晶紫染色液对小室下室内的细胞进行染色，最后取出小室在倒置显微镜下观察拍照，染色细胞即代表发生迁移的细胞。划痕愈合实验:将GL261细胞接种于6孔细胞培养板，分为三组(实验组1、2和对照组)，用含10%胎牛血 清的DMEM/F12培养基培养，待细胞长满之后，将培养基更换为无血清DMEM/F12培养基继续培养，然后，实验组I加入终浓度为5nM的NTS，实验组2加入终浓度为5nM的NTS和终浓度为5 μ M的SR48692，对照组加入用于配制SR48692溶液的溶剂DMS0，各组在培养板底部用10 μ I枪头划痕，72小时后观察划痕愈合情况。免疫印迹实验:将GL261细胞接种于细胞培养板，分为六组(实验组1、2、3、4、5和对照组)，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，待细胞长满之后，将培养基更换为无血清DMEM/F12培养基继续培养，然后，实验组I加入终浓度为5ηΜ的NTS，实验组2加入终浓度为IOnM的NTS，实验组3加入终浓度为IOnM的NTS和终浓度为5 μ M的SR48692，实验组4加入终浓度为5ηΜ的NTS和终浓度为2ng/ml的NTS中和抗体，实验组5加入终浓度为5nM的NTS、终浓度为5 μ M的SR48692和终浓度为2ng/ml的NTS中和抗体，对照组加入用于配制SR48692溶液的溶剂DMS0，培养一定时间后分别收集各组细胞，与pERKl/2抗体和ERK2抗体进行免疫杂交，计算ERKl蛋白的磷酸化水平。结果见图2。Transwell穿孔实验结果显示，在SR48692处理GL261细胞3小时的情况下，5 μ M浓度SR48692处理后的细胞穿过transwell微孔的数量比对照组多了 20%(图2A)。划痕愈合实验结果显示，GL261细胞经过5 μ M浓度SR48692处理72小时后，划痕基本上没有发生变化，而对照组划痕愈合情况良好，间距缩小了 47%。免疫印迹实验结果显示，GL261细胞中ERKl蛋白的磷酸化水平随着SR48692的处理发生了显著的下降(图2Β)，ERKl蛋白是与细胞迁移密切相关的Akt-MET通路的关键蛋白，其磷酸化水平下降直接抑制相应的生物学效应，从而使肿瘤细胞迁移受到抑制。三、SR48692在胶质瘤原位接种的鼠模型上具有抑制胶质瘤生长和迁移的功能 将C57小鼠随机分为4组，每组6只。将所有小鼠颅内原位注射胶质瘤细胞系GL261
(每只注射10万个细胞)，3天后开始给予荷瘤小鼠腹腔注射给药，低、中、高剂量药物处理组分别按2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg的剂量给予SR48692的DMSO溶液，对照组给予等体积的溶剂DMS0，连续给药5天，此后每日观察各组小鼠的生活状态，记录小鼠死亡时间，至最后I只小鼠死亡为止，绘制小鼠生存曲线。然后，将每只死亡小鼠进行解剖，取出整块大脑，肉眼观察外观，再进行HE染色。结果见图3。小鼠生存曲线显不，5mg/kg、10mg/kg SR48692处理组小鼠的生存期较对照组明显延长(图3A)。 死亡小鼠的大脑外观图显示，对照组小鼠的大脑出现水肿，而10mg/kg SR48692处理组小鼠的大脑界限清晰(图3B)。HE染色结果显示，5mg/kg、IOmg/kg SR48692处理组小鼠的大脑中胶质瘤生长和迁移均受到抑制(图3C)。上述结果说明SR48692在胶质瘤动物模型上也具有抑制胶质瘤生长和迁移的功能。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.SR48692在制备抗胶质瘤的药物或保健品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗胶质瘤是抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移 。
全文摘要
本发明公开了神经紧张素受体1拮抗剂SR48692用于制备抗胶质瘤的药物或保健品的新用途，不仅扩大了SR48692的应用范围，提高了其应用价值，给恶性胶质瘤的治疗带来了新的希望，还有助于进一步开发新的药物或保健品，以SR48692为先导化合物，通过结构修饰或改造，有望进一步提高其活性或降低副作用。
文档编号A23L1/29GK103156848SQ20131013114
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月16日 优先权日2013年4月16日
发明者易良, 龚雪阳, 崔红娟, 许民辉, 徐伦山 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院