专利名称：鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单抗可变区基因及用途的制作方法
鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单抗可变区基因及用途技术领域
本发明属生物技术，主要涉及鼠抗人活化T细胞新抗原ZCH-2B8a (简称2B8a)单克隆抗体(单抗)可变区基因的克隆、测序及其在再生障碍性贫血等免疫相关疾病诊治中的用途。
背景技术：
机体免疫系统有免疫防御、免疫监视和免疫自稳的功能，T细胞在上述过程中起着举足轻重的作用。T细胞根据其分化状态和功能可分为初始、效应和记忆T细胞。初始T细胞必须先经过活化转变为效应T细胞才能在免疫应答中发挥作用。T细胞活化的正向和负向调控的平衡对免疫系统的稳定至关重要，任何一方的绝对优势都将引起疾病的发生。如T细胞在再次免疫应该过程中反应过强可以出现超敏反应引起组织损伤；体内存在针对自身抗原的自身反应性T细胞可以导致多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病；抑制性T细胞的功能过亢、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤抗原不能识别或T细胞信 号转导的缺陷可以导致肿瘤的发生；T细胞对同种异型抗原的识别是发生移植物抗宿主病(GVHD)的基础[1]。因此，T细胞的稳态是维持机体健康的基础，对于诸多免疫相关性疾病，纠正T细胞失衡的状态则有望治愈疾病。例如，在类风湿性关节炎、炎症性肠病、GVHD等病灶部位都可以发现0X40 + T细胞及0X40L+细胞的浸润[2]。因此，靶向0X40可能可以减少自身抗原反应性的T细胞，对上述疾病具有潜在的治疗价值。0X40靶向治疗主要是采用0X40L抗体或0X40Ig阻滞0X40-0X401 ]，也有采用0X40耦联免疫毒素清除0X40 + T细胞[4]，均在实验性自身免疫性脑脊髓炎等动物模型中取得了一定的疗效。利用单克隆抗体及其免疫毒素靶向杀伤活化T细胞以治疗免疫相关性疾病的理念已在临床研究中广泛开展。目前在进行I期和II期临床试验的就包括抗⑶3、⑶5、⑶7及IL-2R的单抗及其免疫毒素，针对T细胞活化分子VLA-4、CD40L、0X40等的单抗在临床前研究中也显示了良好的应用前景[5]。
在儿童血液系统疾病中，再生障碍性贫血(AA)、噬血细胞综合征(HLH)等疾病的发生均与T细胞的过度活化、免疫失调密切相关。在AA，免疫抑制剂的治疗效果已非常肯定，可以使70%的患儿得到基本治愈[6]。但一般治疗过程需要数年，药物的毒副作用也非常大，况且仍有30%左右的病人治疗反应不佳。而HLH则是由于自身的免疫缺陷致病原体难以清除，导致T细胞过度活化和细胞因子风暴而损伤脏器，该病进展迅速、死亡率非常高，基本的治疗手段也是通过激素、环孢素及依托泊苷等药物抑制或杀灭T细胞而使疾病缓解[7]。我们在研究中也发现，上述病人的外周血T细胞表面T细胞活化分子呈高表达，这也为利用靶向活化分子杀伤活化的T细胞提供了理论基础。
ZCH(Zhejiang Children’s Hospital)_2B8a (简称 2B8a)是鼠抗人造血细胞分化抗原的单克隆杂交瘤细胞株，以分化早期的CD34+白血病细胞KGla作为免疫原，采用经典杂交瘤技术制备而成。经三次亚克隆培养，建立了能稳定分泌2B8a抗体的杂交瘤细胞系。该抗体经递交第8届国际人类白细胞分化抗原协作组会议(8th International Workshopand Conference on Human Differentiation Antigens, HLDA8)鉴定后认为该抗体识别的抗原性质不明，属国际上尚未认识的造血细胞膜新的分化抗原或新的CD分子。研究表明，该抗体与正常外周血静止期T细胞不反应，但与活化的T细胞反应强烈，可能识别新的活化T细胞分子。因此，2B8a抗体具有开发成为靶向杀伤活化T细胞的大分子药物的临床应用前景。发明内容
本发明的目的是提供一种鼠抗人活化T细胞抗原(ZCH-6_2B8a单抗，简称2B8a单抗)单抗的重链和轻链可变区基因，该单抗的重链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO I所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示；该单抗的轻链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
本发明的另一个目的是提供一种鼠抗人活化T细胞抗原(ZCH-6_2B8a单抗，简称2B8a单抗)单抗的重链和轻链可变区基因在制备靶向治疗活化T细胞介导的免疫相关性疾病药物中的应用，所述的免疫相关性疾病包括再生障碍性贫血、噬血细胞综合征、类风湿性关节炎等疾病。用于制备药物的是如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的重链可变区及如SEQ ID N04所示的氨基酸序列的轻链可变区的免疫球蛋白。
研究表明，2B8a单抗能够有效识别人体内的活化T细胞，对于再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、噬血细胞综合征等由T细胞过度活化介导发病的免疫性疾病具有靶向治疗的应用前景。
采用单克隆抗体及其免疫制剂(如免疫毒素)靶向杀伤活化T细胞以期达到治疗免疫相关疾病的基本条件包括以下几方面:1.该抗体的反应谱窄，在人体的其他组织器官表面不表达或极低表达，以免在治疗过程中造成“脱靶效应”，对正常的组织器官产生毒副作用。2.该抗体识别的抗原在活化T细胞表面稳定表达。3.该抗体可以介导补体依赖的细胞毒作用(CDC)或抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC);或者当抗体偶联化学制剂如免疫毒素或放射性物质时，该抗体可有效介导内化。
本研究组采用免疫组化技术观察了 2B8a单抗与人体组织芯片的反应情况。结果表明，2B8a抗原仅在扁桃体、淋巴结、胸腺、脾脏和骨髓等含淋巴系统的组织中表达，而在大脑、小脑、垂体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、唾液腺、咽部、食道、胃、小肠、大肠、直肠、肺、心脏、肝脏、胰腺、肾脏、膀胱、前列腺、子宫内膜、宫颈、乳腺、卵巢、睾丸、皮肤、骨骼肌等20余种脏器中均不表达。
2B8a抗体在T细胞受PHA (植物凝集素)刺激后12h内即可表达于胞膜上，后表达强度逐渐增强，并于72 96h达高峰，之后仍呈持续高表达，提示它是一个早期稳定的T细胞活化分子。在再生障碍性贫血(AA)等免疫相关性疾病病人的血液标本的T细胞表面，2B8a抗原的表达明显上调，提示该抗体可能可用于AA等活化T细胞介导的疾病的治疗。
此外，2B8a抗体可以快速内化进入细胞内，在4°C和37°C均可以快速“内化”。2B8a抗体能激活补体，介导补体依赖的 细胞毒作用杀伤Raji细胞，而对2B8a抗原阴性的细胞基本无杀伤作用。
以上研究表明，2B8a抗体与血液淋巴组织之外的组织器官不存在交叉反应、与PHA刺激的活化T细胞及再障等免疫相关疾病的外周血T细胞具有良好的反应性，并且可以介导快速内化和免疫杀伤，具有治疗再障、噬血细胞综合症等活化T细胞介导的免疫相关性疾病的潜在应用价值。
目前，鼠源性单克隆抗体、人鼠嵌合抗体和完全的人源化抗体在临床上具有应用价值。2012年的销售额最高的10大生物药品中单克隆抗体制剂占据了 6席，其中前三位都是治疗自身免疫性疾病类风湿性关节炎的，年销售额均在80亿美元以上[8]。但是该类药物价格昂贵，而国内尚未见治疗活化T细胞介导的免疫相关疾病的生物制剂的开发的报道。因此，针对免疫相关性疾病的单克隆靶向药物的开发具有开阔的临床应用前景和良好的社会和经济效益，将极大地降低有关疾病的治疗成本。
图1 是；pGEM -T Easy/VH2B8a 和pGEM -T Easy/VL2B8a 酶切鉴定电泳图。
图2是鼠抗人T细胞抗原ZCH_2B8a单克隆抗体的可变区重链基因(VH2B8a)序列(两个黑色箭头之间的序列)。序列位置:76-435，共360bp。
图3是鼠抗人T细胞抗原ZCH_2B8a单克隆抗体的的可变区轻链基因(VL2B8a)序列(两个黑色箭头之间的序列)。序列位置:622-960，共339bp。
图4是2B8a单克隆抗体与人组织芯片的反应性。
图5是2B8a抗原在PHA活化的T细胞上的表达随时间变化情况。
图6是2B8a荧光抗体在木瓜酶酶切后阳性率的变化。
图7是2B8a抗体介导补体依赖的细胞毒(⑶C)作用。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例，作进一步的说明。
实施例一
本发明2个基因的核苷酸序列及氨基酸序列:
(l)2B8a单抗重链可变区基因(VH2B8a)具有SEQ ID NO I的核苷酸序列，编码SEQID NO 3的氨基酸序列。
(2)2B8a单抗轻链可变区基因(VL2B8a)具有SEQ ID NO 2的核苷酸序列，编码SEQID NO 4的氨基酸序列。
2个基因的核苷酸序列及氨基酸序列的获取步骤如下:
l、ZCH-6_2B8a单抗的研制:基本按Koller&Milstein报告的鼠-鼠杂交瘤经典方法进行[6]，以急性粒细胞白血病(未分化型)细胞株KGla细胞作为免疫原，将IO7白血病细胞给8周龄雌性Balb/C小鼠作腹腔注射，每周一次，共4次，于第4次注射后第3天，脱臼杀死小鼠，无菌取脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1细胞(美国ATCC产品)按6:1混合，以50%聚乙二醇(PEG，美国Sigma公司，分子量3350道尔顿)溶液作为融合媒介进行细胞融合，于96孔板(美国Falcon公司)中进行选择性培养。于融合后第9 20天，隔日用免疫原细胞对培养上清进行间接免疫荧光法(IIF)筛选。阳性孔细胞经3次克隆化并连续2次100%孔达到阳性，即建立了能持续分泌2B8a单抗的杂交瘤细胞系。经8个多月的连续传代培养和反复冻融，其分泌2B8a单抗的能力稳定。以其腹水(荧光法效价1:3200)或培养上清(荧光法效价1:16)作为2B8a单抗的来源。
2、2B8a重、轻链基因(VH2B8a、VL2B8a)的扩增和克隆
2.1总RNA的抽提和处理:
收集2B8a杂交瘤细胞8X106，以核糖核酸(RNA)抽提试剂盒(TRIZOL液)按说明书步骤抽提总RNA。最后溶于25 μ I DEPC (diethyl-pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)水中，并加入RNasin"(核糖核苷酸酶抑制剂)至终浓度为IU/ μ I (单位/微升)。紫外分光光度计测定Α260、Α280及其比值，I %琼脂糖电泳观察总RNA。进行逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)前，取2 μ I 2B8a总RNA，按照RQl (无RNA酶的DNA酶试剂盒)说明的方法，消化总RNA中污染的基因组DNA。
2.2 总 RNA 的抽提:
(I)计数细胞，共8X IO6个活细胞；
(2)常温下1000转/分钟(rpm)离心15分钟，弃上清；
(3)沉淀中加入无菌生理盐水后在IOOOrpm条件下离心15分钟，重复洗涤2次；
(4)向沉淀中加入8ml TRIZOL (lml/106细胞)，立即用5ml无菌针筒反复抽打剪切数分钟；
(5)将上述TRIZOL溶液按Iml/管转入1.5ml带盖小塑料(印pendorf )管中，室温下静置5分钟；
(6)每管加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温下静置10分钟；
(7)4° C下12000g离心15分钟,将水相转入新的1.5ml的eppendorf管中，每管加入0.5ml异丙醇，立即摇匀，室温下静置10分钟；
(8)4。C 下，12000g 离心 10 分钟;
(9)弃上清，每管加入L 5ml 75%乙醇，混匀，4° C下，7500g离心5分钟，弃上清；
(10)真空干燥机中晾干，每管加入25 μ I无RNA酶的DEPC水溶解沉淀，_80° C冰箱保存。
2.3总RNA浓度的测定:
取出2 μ I新抽提的总RNA，加入98 μ I DEPC水混匀，紫外分光光度计(GeneQuantII)测定260吸光值(Α260)及280吸光值(Α280)，RNA实际浓度用如下公式计算:
LAN 浓度(μ g/ μ I) = A260/24 X 稀释倍数
2.4总RNA凝胶电泳:
取新抽提的总RN A 3μ I加入电泳上样缓冲液5 μ 1，I %琼脂糖凝胶内含溴乙啶(EB)浓度0.5 μ g/ml，经100V直流电压下电泳5分钟，凝胶成像系统观测结果并摄像保存。
2.5 总 RNA 的处理:取总 RNAl μ I +无 RNA 酶的 DNA 酶(RNase-free Dnase) (IU/μ 1)10μ I + RNasin (40υ/μ 1)1 μ 1，总量达 12μ 1，经 37° CXl 小时，90° CX5 分钟孵浴后立即置冰上待用。
2.6 RT-PCR:
按照说明书，将RQl无RNA酶的DNA酶处理过的总RNA进行逆转录(25 μ I体系)，并用DNA纯化试剂盒(QIAquick)纯化mRNA/cDNA杂交双链。取纯化的cDNA 2.5 μ I进行PCR。
2.6.1 RT反应体系:取RQl处理过的总RNA 13μ I +寡聚脱氧胸苷[Oligo(dT)]1.5y 1，总量达14 .5yL，经65° C预变性5分钟，立即置冰上，加入以下试剂:DEPC水2.5 μ I + 5倍缓冲液5 μ I + 25mM dNTP (脱氧核苷混合物)0.5 μ I + RNA酶抑制剂1.5μ I +逆转录酶(200υ/μυ μ I至总体积25μ 1，经37° C，30分钟孵浴以合成互补脱氧核糖核苷酸(cDNA)，置95° C 5分钟，然后移至4° C冰浴备用。
2.6.2 PCR 体系
(I) 50 μ I的PCR反应体系:2.5 μ I纯化的2B8a IOpmol的轻链或重链可变区上下游引物各1μ 1，0.5μ I 25mM的dNTP，5y I 10 X高保真PCR缓冲液，0.2 μ I高保真Taq聚合酶(PlaiirmnrK Taq High Fidelity);引物序列如下:
重链可变区5’ 引物序列(SEQ ID NO 5):GAG GTC CAG CTG CAA CAA TCT
重链可变区3’引物序列(SEQ ID NO 6):CCA GGG GCC AGT GGA TAG ACA AGC TTGGGT GTC GTT TT
轻链可变区5’ 引物序列(SEQ ID NO 7):GAC ATT CTG ATG ACC CAG TCT
轻链可变区3’ 引物序列(SEQ ID NO 8):GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC
(2)反应条件:94° C预变性2分钟，94° C变性30秒，57° C退火30秒，72° C延伸30秒，共38个循环；
(3)最后一个循环完成后，加入 I μ I Taq DNA PolymeraseCTaq DNA聚合酶)72。C延伸7分钟；
(4)取5μ I PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，同时加标准分子量标志物，鉴定PCR产物片断大小，分别命名为VH2B8a和VL2B8a基因。结果可观察到350碱基对(bp)左右的VH2B8a条带和325bp左右的VL2B8a条带。将前述阳性条带切胶回收纯化得到VH2B8a和VL2B8a基因。
3.VH2B8a、VL2B8a基因扩增产物的克隆和鉴定将纯化的VH2B8a和VL2B8a基因片段通过连接酶分别与克隆载体pGEM -T Easy连接，获得的连接产物pGEM -T Easy/VH和pGEM -T Easy/VL，通过转化DH5a感受态细菌，得到数十个白色菌落和数个蓝色菌落，分别挑取3个白色菌落进行质粒扩增，抽提后进行核酸限制性内切酶EcoRI酶切鉴定，1%琼脂糖电泳结果均可见360bp左右的目的片段`(图1)。图1中M:核酸标志物，I 4为重组质粒pGEM -T Easy/VL2B8a酶切电泳图:1与3为未酶切质粒，2，4为酶切后条带。在340bp左右可见一片段。5 8为重组质粒pGEM -T Easy/VH2B8a酶切电泳图:5与7为未酶切质粒，6，8为酶切后条带。在360bp左右可见一片断。
4.VH2B8a、VL2B8a基因序列测定和分析
对阳性重组质粒纯化后进行测序，VH2B8a(参见图2)和VL2B8a(参见图3)基因均符合小鼠Ig可变区框架结构。VH2B8a基因全长360bp(见序列SEQ ID NO 1)，编码120个氨基酸(见序列 SEQ ID NO 3),在 IMGT(the international ImMunoGeneTics informationsystem http://www.1mgt.0rg)上进行检索比对,发现此重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白重链可变区基因IGHV1-67*01F的同源性达94.10%，提示该基因归属于小鼠Ig的VH基因。氨基酸序列分析结果显示，重链可变区含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR)，在第22位和第96位为特征性Cys (半胱氨酸)。VH2B8a氨基酸序列结构框架如下:1 25FR1、26 33CDR1、34 50FR2、51 58CDR2、59 96FR3、97 108CDR3、109 120FR4。
VL2B8a基因全长339bp(见序列SEQ ID NO 2)，编码113个氨基酸(见序列SEQ IDNO 4)，在NCBI上进行检索，发现此轻链可变区基因与小鼠IgK链基因IGKV7-3*01P的同源性81.44%，提示该基因归属于小鼠Ig的Vk基因。氨基酸序列分析结果显示，轻链可变区含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR)，在第23位和第94位为特征性半胱氨酸(Cys)。VL2B8a氨基酸序列框架如下:1 26FR1、27 36CDR1、37 53FR2、54 56CDR2、57 92FR3、93 101CDR3、102 113FR4。
实施例二 2B8a单抗与人组织器官的反应性鉴定
利用免疫组织化学法观察2B8a单抗与人组织芯片的反应性。具体步骤如下:
1.取组织芯片:FDA999a和BN242，烤片2h
2.脱蜡、水化组织切片。
3.抗原修复:将组织切片浸于PH6.0枸橼酸钠缓冲液中，加热高压锅至喷气时，计时lmin40sec后关闭高压锅阀门，自来水下冲洗锅盖至冷却。
4.阻断内源性过氧化物酶:3% H202去离子水孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。结束后蒸馏水洗3分钟X 2次，后PBS5分钟X 3次。
5.封闭:I %牛血清白蛋白(BSA)室温封闭20分钟
6.一抗孵育:分别滴加一抗2B8a 100-200 μ 1，工作浓度分别为1:100。空白对照组加PBS，室温孵育2-3小时或4°C过夜，结束后PBS洗5分钟X 3次。
7.二抗孵育:滴加二抗(兔抗鼠通用型IgG-HRP) 100μ I左右(覆盖切片即可)，37°C孵育40min，结束后PBS洗5分钟X 3次。
8.DAB显色:滴加DAB显色剂100 μ I左右孵育3_10min或镜下控制显色，自来水冲洗终止反应。
9.Harris苏木素液复染细胞核:浸于苏木素液中3_5min,自来水下冲洗。
10.脱水、透明:95% 乙醇(3-5min)-100% 乙醇(5-10min)-100% 苯(3-5min)_ 二甲苯(l_3min)
11.树胶封片，镜下观察。
结果表明，2B8a抗原仅在扁桃体、淋巴结、胸腺、脾脏和骨髓等含淋巴系统的组织中表达(表I及图4)，而在其他等20余种脏器中均不表达。图4从a-c分别为脾脏、淋巴结和胸腺，d-f分别为扁桃体、小肠(淋巴结丛呈阳性)和肝脏(少量枯否氏细胞呈阳性反应)。脾脏、淋巴结、胸腺和扁桃体均呈阳性反应，小肠和肝脏为阴性，但小肠淋巴结丛、肝脏少量枯否氏细胞呈阳性反应。
表I 2B8a抗体与人组织芯片反应性
权利要求
1.一种鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体可变区基因，其重链可变区基因的核苷酸序列为SEQ ID NO 1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 3，其轻链可变区基因的核苷酸序列为SEQ ID NO 2，编码的氨基酸序列为SEQ ID N04。
2.根据权利要求1所述的一种鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体可变区基因在制备靶向治疗活化T细胞介导的免疫相关性疾病药物中的应用，其特征在于，用于制备药物的是如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的重链可变区及如SEQ ID N04所示的氨基酸序列的轻链可变区的免疫球蛋白，所述的免疫相关性疾病为再生障碍性贫血、噬血细胞综合征、类风湿性关节炎。
全文摘要
本发明提供鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单抗可变区基因，ZCH-2B8a单克隆抗体所识别的抗原是一个早期稳定的T细胞活化分子。以该抗体为基础制备的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的2B8a-FITC荧光抗体对于抗原的结合具有高度的敏感性和特异性，同时活性良好，能识别经植物血凝素(PHA)刺激的活化T细胞和再生障碍性贫血等免疫相关性疾病病人外周血中的活化T细胞。因此，该荧光抗体可用于T细胞功能评估的基础研究和临床病例活化T细胞及其亚群的检测，可在制备靶向治疗活化T细胞介导的免疫相关性疾病药物中的应用。
文档编号C12N15/13GK103173459SQ201310130568
公开日2013年6月26日 申请日期2013年4月14日 优先权日2013年4月14日
发明者汤永民, 徐晓军 申请人:浙江大学