专利名称：一种异戊二烯生产方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种异戊二烯的生产方法。
背景技术：
异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是一种高挥发性的共轭二烯烃，是合成橡胶的主要单体，其用量占异戊二烯总产量的95%，主要用于合成异戊橡胶，其产量仅次于丁苯橡胶和顺丁橡胶而居合成橡胶第三位，还可用于合成树脂、液体聚异戊二烯橡胶等。近年来，人们用异戊二烯合成里那醇、角鲨烯等，从而进一步合成香料、药品、农药等。异戊二烯还是天然产物萜类化合物的前体物质。目前工业上有多种生产异戊二烯的方法，除C5馏分分离得异戊二烯外，工业上还可采用合成法生产。由于各国原料价格和供应情况不同，不同国家采取的合成方法也有所不同，但更多的异戊二烯还是直接来自碳五馏分分离。由于现在采用的异戊二烯的生产方法主要是依赖于不可再生的化石燃料石油，尽管合成和分离技术不断成熟，但是原材料终将会成为制约异戊二烯产业发展的关键因素，此外生产中还存在着高能耗、高污染的问题。因此，采用生物学等清洁方法来生产异戊二烯就成为研究热点，但目前已有的生产方法还是存在生产效率低下等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种异戊二烯生产方法，是将一种异戊二烯合成酶突变体基因转化入毕赤酵母中，构建得到能重组表达异源异戊二烯合成酶突变体的工程菌株，进而高效发酵生产异戊二烯。本发明首先提供一种异戊二烯合成酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1 ;其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。本发明另一个方面提供上述异戊二烯合成酶突变体的应用，即转化入毕赤酵母中来代谢生成更多的异戊二烯；具体就是将携带有异戊二烯合成酶突变体基因的重组表达载体转入毕赤酵母中。本发明另一方面提供了一种生产异戊二烯的巴斯德毕赤酵母GSMISPS(Pichiapastoris GSMISPS)，其携带有能表达上述异戊二烯合成酶突变体基因的表达载体，该重组菌株已于2013年5月14日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为 CCTCC N0:M2013202o本发明获得的异戊二烯合成酶突变体，相比于没有改造前的酶具有更好的活性。而且，本发明提供的异戊二烯生产方法简单、可靠、环保，构建得到的巴斯德毕赤酵母工程菌能高产异戊二烯，可广泛应用于异戊二烯的发酵生产，提高异戊二烯的产量。
图1:本发明所用到的载体pPIC3.5-MIsps的遗传图谱；
图2:本发明代谢合成的异戊二烯检测的气相色谱图，其中A为含有野生型异戊二烯合成酶的毕赤酵母菌的顶空气体；B为毕赤酵母工程菌CCTCC NO:M2013202的顶空气体。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明所用到的实验材料和试剂如下:1、菌株与载体大肠杆菌菌株DH5a,毕赤酵母,载体pPIC3.5,均购自Invitrogen公司。2、酶与试剂盒PCR酶，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒等购自上海生工公司。3、培养基大肠杆菌培养基为LB (I %蛋白胨，0.5 %酵母提取物，I % NaCl，pH7.0)。LB-Amp为LB培养基加lOOug/mL氨苄青霉素。酵母培养基为YPD(1 %酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)；酵母培养基BMGY(1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% YNB,0.00004% BiotinU%甘油(V/V))；诱导培养基BMMY(1 % 酵母提取物、2% 蛋白胨、1.34% YNB, 0.00004 % Biotin、
`0.5% 甲醇(V/V)) ο但对于上述的试剂或材料，本领域的技术人员可以根据其所实现的功能在市场上出售的产品中进行选择，而不仅限于本说明书实施例的具体记载。实施例1异戊二烯合成酶突变体MIsps和pPIC3.5-MIsps表达载体的构建来自葛藤(Pueraria montana var.1obata)的异戍二烯合成酶(Isps)的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其编码核苷酸序列为SEQ ID N0:4。通过对该酶的氨基酸序列和分子结构等性质的分析，发现将异戊二烯合成酶活性中心的个别氨基酸进行替换能够有效提高其酶活力，进而增加异戊二烯的产量。申请人发现将408位的Ser替换为Asp能使得酶活力增强，突变后的异戊二烯合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO:2 (MIsps)o设计引物，利用融合PCR方法构建MIsps，并在两端加入限制性酶切位点EcoRI和NotI οMIsps引物设计如下:MIsps-Fl:5’ -CCGGAATTCATGTGTGCTACTTCCTCC-3’MIsps-Rl:5，_CAACAAAGCAACACCATCGGAGGAAACGGAAGC_3，MIsps-F2:5’ -GCTTCCGTTTCCTCCGATGGTGTTGCTTTGTTG-3’MIsps-R2:5’ -ATTTGCGGCCGCTTAAACGTACATCAACTG-3’首先，分别PCR扩增出上下游片段MIsps-1和MIsps-2。PCR反应体系反应条件:940C 4min，94°C 30s, 56°C 30s，72。。延伸 1.5min，30 个循环，72°C延伸 7min。用胶回收试剂盒回收PCR产物。采用两步进行融合PCR:第一步，PCR反应体系反应条件为94°C 4min，94°C 30s，72°C延伸5min，10个循环，72°C延伸7min。第二步，以第一步的PCR产物为模板进行融合PCR, PCR 反应体系反应条件为 94°C 4min,94°C 30s, 56°C 30s，72°C延伸 2min，30 个循环，72°C 延伸 7min。用胶回收试剂盒回收PCR产物，用限制酶EcoRl和Notl消化MIsps及载体PPIC3.5，在T4连接酶的作用下，22°C连接。转化大肠杆菌DH5a，用LB-Amp平板筛选得到阳性克隆，测序确定其基因序列的正确性，得到PPIC3.5-MIsps表达载体，质粒图谱如图1所
/Jn ο实施例2pPIC3.5-MIsps转化毕赤酵母和发酵培养利用限制性内切酶SacI或SalI消化pPIC3.5-MIsps,使其线性化，更有利于目的基因同源重组进入毕赤酵母的染色体中。酵母细胞经IM的山梨醇处理后，与纯化后的含有MIsps基因的线性质粒混匀，用电转化仪转化。复苏后的酵母细胞涂布在MD平板上，30°C培养3-4d。分别挑取MD平板上长出的单菌落，接种至25mL BMGY中(250ml摇瓶)，30°C，250-300rpm摇至0D600=2_6 (对数生长，大约16_18h)。室温，1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY重悬细胞至0D600=1.0 (大约100_200ml)，加入0.5%的甲醇，进行诱导表达。在IL摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入摇床继续生长。每24小时，加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。检查培养基的量，确保正确加入甲醇，因为蒸发作用会减少培养基的体积。重组毕赤酵母细胞在摇瓶中诱导表达72_96h后，用密封塞封口，继续培养30min后，将摇瓶在60°C下处理30min，抽取ImL顶空气体进行气相色谱检测，以异戊二烯标准品作为标准。系统采用GC2000型气相色谱仪，色谱柱为CP-Wax58 (FFAP) CB(25mX0.25mmX0.39mm)，检测器为火焰离子化检测器，气化室温度50°C，柱室温度50°C，检测器温度100°C。检测结果如图2所 示，含异戊二烯合成酶突变体的毕赤酵母发酵液顶空气体，异戊二烯产量达到2.6mg/L.发酵尾气，与对照组A(含有野生型异戊二烯合成酶的毕赤酵母菌，异戊二烯产量为2mg/L.发酵尾气)相比，异戊二烯的产量提高了 30%，说明突变后的异戊二烯合成酶的活力增强，从而使得异戊二烯产量增加。多个重组菌的表达产物分析结果也证明了本发明方法的可靠性。从重组菌中筛选异戊二烯产量最高的重组毕赤酵母命名为巴斯德毕赤酵母GSMISPS (Pichia pastoris GSMISPS)，并于2013年5月14日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013202。
权利要求
1.一种异戊二烯合成酶突变体，所述的异戊二烯合成酶突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。
2.一种基因，所述的基因编码权利要求1所述的异戊二烯合成酶突变体。
3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列为SEQID N0:2。
4.权利要求1所述的异戊二烯合成酶突变体在合成异戊二烯中的应用。
5.一种合成异戊二烯的方法，其特征在于，所述的方法是在毕赤酵母中表达权利要求1所述的异戊二烯合成酶突变体，再利用重组的毕赤酵母代谢合成异戊二烯。
6.一种生产异戊二烯的毕赤酵母工程菌株，携带有表达权利要求1所述的异戊二烯合成酶突变体的表 达载体，其保藏编号为CCTCC N0:M2013202。
全文摘要
本发明的目的是提供一种异戊二烯的生产方法，是将一种异戊二烯合成酶突变体基因转化入毕赤酵母中，构建得到能重组表达异源异戊二烯合成酶突变体的毕赤酵母工程菌，进而高效发酵生产异戊二烯。本发明获得的异戊二烯合成酶突变体，相比于没有改造前的酶具有更好的活性。而且，本发明提供的异戊二烯生产方法简单、可靠、环保，构建得到的毕赤酵母工程菌能高产异戊二烯，可广泛应用于异戊二烯的发酵生产，提高异戊二烯的产量。
文档编号C12N15/81GK103232986SQ201310199919
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月27日 优先权日2013年5月27日
发明者王华明, 黄亦钧, 李宾 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司