小附红细胞体mpg1基因、蛋白及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小附红细胞体基因，该基因为MPG1基因，其编码的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有98.2％以上同源性。本发明还公开了上述基因编码的小附红细胞体MPG1蛋白。本发明的小附红细胞体MPG1基因和蛋白，在小附红细胞体入侵宿主红细胞，完成病原体的生活史中具有重要作用，对于开发防治猪的附红细胞体病的新药或疫苗具有较高的应用价值。
【专利说明】小附红细胞体MPG1基因、蛋白及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程【技术领域】，尤其涉及一种小附红细胞体MPG1基因、蛋白及应 用。
【背景技术】
[0002] 目前已经命名的附红细胞体主要有绵羊附红细胞体（Mycoplasma ovis)、温氏附 红细胞体（M.wenyonii)、猪附红细胞体（M.suis)、小附红细胞体（M.parvum)等。在诸多 的附红细胞体种类中，仅有猪附红细胞体和小附红细胞体能够感染猪（Watanabe et al.， 2011)。猪附红细胞体引起的临床症状有多种，急性感染的早期，通常母猪表现为贫血、黄 疸及厌食，新生仔猪及断奶仔猪表现为严重贫血（Henry, 1979 ;Henderson et al.，1997)。 慢性感染通常表现为母猪的生殖障碍，育肥猪的体重下降等（Zinn et al.，1983)。猪附红 细胞体在一定程度上有宿主特异性，但是国内已有人感染猪附红细胞体的相关报道（Yuan et al.，2009)，表明猪附红细胞体病是一种人兽共患病。有关小附红细胞体的致病性研究， 国内外鲜有报道，但有研究发现它可以导致去脾猪的严重贫血，并伴有发热症状（Barnett， 1963)。国内尚未见猪感染小附红细胞体病的相关报道。
[0003] 猪附红细胞体3-磷酸甘油醛脱氢酶样蛋白1(M. suis glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-like protein 1，MSG1)存在于猪附红细 胞体表面，具有 3_ 憐酸甘油醒脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)活性，参与感染机体内的糖酵解活动，在附红细胞体粘附宿主红细胞的过程中起重 要作用。用重组表达的MSG1蛋白免疫猪，在体内产生了很强的免疫反应（Hoelzle et al.， 2009)。目前，尚未见小附红细胞体3-磷酸甘油醛脱氢酶样蛋白l(M.parvum GAPDH-like protein 1，MPG1)的报道，GenBank中也尚无 MPG1基因序列。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种小附红细胞体MPG1基因和蛋白，该MPG1基 因在小附红细胞体入侵宿主红细胞，完成病原体的生活史中具有重要作用，对于开发猪附 红细胞体病的疫苗具有较高的应用价值。
[0005] 此外，还需要提供一种小附红细胞体MPG1基因和蛋白的应用。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0007] 在本发明的一个方面，提供了一种小附红细胞体基因，该基因为MPG1基因，其编 码的氨基酸序列与SEQ ID NO. 1所示序列具有98. 2%以上同源性。
[0008] 优选的，所述MPG1基因编码的氨基酸序列选自SEQ ID N0. 3?13中的任一序列。
[0009] 优选的，所述MPG1基因的核苷酸序列与SEQ ID N0. 2所示序列具有96. 6%以上同 源性。
[0010] 更优选的，所述MPG1基因的核苷酸序列选自SEQ ID N0. 14?24中的任一序列。
[0011] 在本发明的另一方面，提供了一种小附红细胞体蛋白，该蛋白为MPG1蛋白，其编 码的氨基酸序列与SEQ ID NO. 1所示序列具有98. 2%以上同源性。
[0012] 优选的，所述MPG1蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID N0. 3?13中的任一序列。
[0013] 在本发明的另一方面，还提供了一种重组载体，包含编码SEQ ID N0. 3?13中任 一氨基酸序列的核苷酸序列。
[0014] 在本发明的另一方面，还提供了一种宿主细胞，包含上述重组载体。
[0015] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述小附红细胞体基因在制备诊断猪的附红 细胞体病的产品或制备预防猪的附红细胞体病的疫苗中的应用。
[0016] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述小附红细胞体蛋白在制备诊断猪的附红 细胞体病的产品或制备预防猪的附红细胞体病的疫苗中的应用。
[0017] 本发明的小附红细胞体MPG1蛋白可用来制备ELISA诊断试剂，以及用于制备预防 猪的附红细胞体病的疫苗。
[0018] 本发明小附红细胞体MPG1基因高度保守，可建立基于该G1基因的TaqMan实时 荧光定量PCR检测方法，用于特异性地检出感染猪的猪源附红细胞体；其表达的重组蛋白， 可作为抗原用于制备诊断猪的附红细胞体病的免疫学方法检测产品。而且，本发明的小附 红细胞体MPG1基因，在小附红细胞体入侵宿主红细胞，完成病原体的生活史中具有重要作 用，对于开发防治猪附红细胞体病的新药或疫苗具有较高的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0020] 图1是本发明实施例1的小附红细胞体MPG1基因的PCR扩增结果图；
[0021] 图2是本发明实施例3小附红细胞体MPG1基因在线Blastn比对图；
[0022] 图3是本发明实施例3不同株小附红细胞体MPG1基因与MSG1基因的核苷酸序列 比对图；
[0023] 图4是本发明实施例3不同株小附红细胞体MPG1基因与MSG1基因的氨基酸序列 比对图；
[0024] 图5是本发明实施例3小附红细胞体MPG1及MSG1基因序列系统进化树图；
[0025] 图6是本发明实施例4敏感性试验扩增曲线图；
[0026] 图7是本发明实施例4实时荧光定量PCR标准曲线图。
[0027] 图8是本发明实施例4小附红细胞体阳性田间样品TaqMan实时荧光定量PCR扩 增荧光曲线图。
【具体实施方式】
[0028] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验 指南》（J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学 出版社，2002)中所述的方法进行。
[0029] 为了获得小附红细胞体MPG1基因序列数据，分析田间自然感染的小附红细胞体 MPG1基因的遗传变异特点，本发明从上海地区3个屠宰场采集自然感染小附红细胞体的猪 血液，提取基因组DNA，利用常规PCR及实时定量荧光PCR技术检测附红细胞体感染阳性后， 采用Rnase P RNA基因序列分析、16S rRNA基因序列分析及限制性内切酶酶切（PCR-RFLP) 分析，对感染的附红细胞体种类进行鉴定，首次在国内鉴定出了 11株小附红细胞体。在此 基础上，进行MPG1基因的扩增，将扩增产物连接到PMD18-T载体上，进行序列测定和分析， 为进一步了解小附红细胞体MPG1基因结构和功能提供重要依据。
[0030] 实施例1小附红细胞体MPG1基因的PCR扩增
[0031] 1.引物设计与合成
[0032] 鉴于GenBank未登录有MPG1基因的序列，且MSG1基因 （SEQ ID NO. 1)在猪附红细 胞体中高度保守，本实验使用扩增MSG1基因的引物，对小附红细胞体基因组DNA进行MPG1 基因的扩增。引物序列如下：
[0033]
【权利要求】
1. 一种小附红细胞体基因，其特征在于，所述基因为小附红细胞体MPG1基因，其编码 的氨基酸序列与SEQ ID NO. 1所示序列具有98. 2%以上同源性。
2. 根据权利要求1所述的小附红细胞体基因，其特征在于，所述MPG1基因编码的氨基 酸序列选自SEQ ID NO. 3?13中的任一序列。
3. 根据权利要求1或2所述的小附红细胞体基因，其特征在于，所述MPG1基因的核苷 酸序列与SEQ ID NO. 2所示序列具有96. 6%以上同源性。
4. 根据权利要求3所述的小附红细胞体基因，其特征在于，所述MPG1基因的核苷酸序 列选自SEQ ID NO. 14?24中的任一序列。
5. -种小附红细胞体蛋白，其特征在于，所述蛋白为小附红细胞体MPG1蛋白，其编码 的氨基酸序列与SEQ ID NO. 1所示序列具有98. 2%以上同源性。
6. 根据权利要求5所述的小附红细胞体蛋白，其特征在于，所述MPG1蛋白的氨基酸序 列选自SEQ ID NO. 3?13中的任一序列。
7. -种重组载体，其特征在于，包含编码SEQ ID NO. 3?13中任一氨基酸序列的核苷 酸序列。
8. -种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求7所述的重组载体。
9. 权利要求1所述小附红细胞体基因在制备诊断猪的附红细胞体病的产品或制备预 防猪的附红细胞体病的疫苗中的应用。
10. 权利要求5所述小附红细胞体蛋白在制备诊断猪的附红细胞体病的产品或制备预 防猪的附红细胞体病的疫苗中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK104232662SQ201310226924
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月7日 优先权日:2013年6月7日
【发明者】陈兆国, 周鹏, 曹薇, 米荣升, 黄燕, 王向佩 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所