一种提高植物耐旱能力的方法

一种提高植物耐旱能力的方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高植物耐旱能力的方法。揭示了一种TRAF-like家族基因，其可在不影响植物正常生长发育的前提下，减少植物在缺水情况下的蒸腾速率，从而提高了抗旱性。本发明的基因可极好地应用于植物品种的改良，提高植物对于逆境的抵抗力。本发明为运用转基因等分子育种技术培育耐旱的农作物新品种，提供了非常有价值的基因资源。
【专利说明】一种提高植物耐旱能力的方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，更特别地，本发明涉及一种提高植物耐旱能力的 方法。

【背景技术】
[0002] 近年来，缺水引起的干旱导致全球范围内粮食大量减产甚至绝收，农产品匮乏致 使价格飙升是地区不稳定诱因之一。利用现代基因工程手段改造现有农作物提高其对干旱 的耐受性是未来农业的必由选择。寻找具有潜在使用价值的抗逆基因，探索其在农业生产 上的可能用途，是现代农业的迫切需求也是植物分子生物学家的使命。
[0003] 随着植物分子生物学的快速发展，大量物种的基因组得到测序，从而为反向遗传 学的开展铺平了道路，但是由于基因众多，明确功能的只是冰山一角。因此，本领域需要鉴 定和分离对抗干旱环境的基因，并深入研究其抗逆境机制，更重要地是切实地将之应用于 生产实践，为育种上提供更好的抗旱新型基因。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种提高植物耐旱能力的方法。
[0005] 在本发明的第一方面，提供一种DOSl多肽或其编码基因的用途，用于提高植物耐 旱能力。
[0006] 在一个优选例中，所述DOSl多肽还用于：
[0007] 提高植物在干旱条件下的存活率；
[0008] 降低植物（如植物叶片）的失水速率；
[0009] 减小植物的气孔开度；或
[0010] 降低植物在缺水情况下的蒸腾速率。
[0011] 在另一优选例中，所述DOSl多肽是：
[0012] (a)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白；或
[0013] (b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个（如1-20个；较佳地1-10 个；更佳地1-5个）氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物耐旱能力功 能的由（a)衍生的蛋白。
[0014] 在另一优选例中，所述的DOSl多肽来源于十字花科植物。
[0015] 在另一优选例中，所述的DOSl多肽来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0016] 在另一优选例中，所述的植物包括：禾本科植物（包括稻属，山羊草属，冰草属，燕 麦草属，燕麦属，薏苡属，稗属，披碱草属，偃麦草属，旱禾属，旱麦草属，大麦属，黑麦草属， 黍属，黑麦属，高粱属，小麦属），十字花科植物（包括鼠耳芥属，芸薹属，萝卜属，荠属，独行 菜属，菘蓝属，薄菜属，糖芥属）。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种提高植物耐旱能力的方法，所述方法包括：提高植 物中DOSl多肽的表达或活性。
[0018] 在一个优选例中，所述的方法包括：将DOSl多肽的编码基因转入植物中。
[0019] 在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
[0020] (i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有DOSl多肽的编码基因；
[0021] (ii)将植物细胞、组织或器官与步骤（i)中的农杆菌接触，从而使所述DOSl多肽 的编码基因转入植物。
[0022] 在另一优选例中，所述方法还包括：
[0023] (iii)选择出转入了 DOSl多的编码基因的植物细胞、组织、器官；以及
[0024] (iv)将步骤（iii)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物。
[0025] 在本发明的另一方面，提供一种转基因作物，利用所述的方法制备，并且相对未表 达转基因的野生型作物其抗旱能力得到提高。
[0026] 在本发明的另一方面，提供一种DOSl多肽或其编码基因的用途，用作鉴定植物的 耐旱能力的分子标记物。
[0027] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。

【专利附图】

【附图说明】
[0028] 图1、拟南芥DOSl基因的鉴定。
[0029] a. DOSl与拟南芥SINAT家族的氨基酸序列比较；
[0030] b.在酵母中DOSl蛋白与自身和其他SINA家族蛋白之间的相互作用；
[0031] C.在烟草细胞中DOSl自身相互作用的BIFC分析。
[0032] 图2、AtDOSl的表达模式分析。
[0033] a-b.D0Sl基因在拟南芥各器官中的表达水平。St，茎（stem) ;F1，花（flower) ;CL， 莖生叶（cauline leaf) ;RL，莲座叶（rosette leaf) ;R，根（root) ;Co,子叶（cotyledon); YL，嫩叶（young leaf) ;ML，成熟叶（mature leaf) ;ES，早期衰老叶（黄叶面积小于25%); LS，晚期衰老叶（黄叶面积大于50%)。c-k. proDOSl-GUS转基因拟南芥的⑶S染色。
[0034] c.萌发1天的种子；
[0035] d. 3天的幼苗；
[0036] e. 5天的幼苗；
[0037] f. 14天的幼苗；
[0038] g. 21天植株上的莲座叶；
[0039] h.保卫细胞；
[0040] i_k.花和果荚；
[0041] 1.莲座叶中⑶S的表达伴随叶片年龄的增加而逐渐增强。
[0042] 图3 :ABA处理和干旱条件下DOSl的组织表达模式。
[0043] a.定量PCR分析结果，横坐标表示水处理、ABA处理、干旱处理的时间（小时）；
[0044] b.⑶S染色分析结果。
[0045] 图4、DOSl的亚细胞定位。
[0046] a_b.在转基因拟南芥的子叶（a)和下胚轴（b)中的稳定表达；
[0047] c.在烟草叶片表皮细胞中的瞬时表达；
[0048] d.在拟南芥原生质体中的瞬时表达。
[0049] 图5、拟南芥dosl突变体的鉴定和干旱敏感性分析。
[0050] a. dosl-Ι和dosl-2突变体中T-DNA插入位点的分析。
[0051] b-d.拟南芥野生型（Col-O)、突变体和gDOSl回补dosl-Ι突变体中的DOSl基因 表达RT-PCR分析（b)、干旱耐受性分析（c)和失水率测定（d)。
[0052] 图6、DOSl的过表达增强抗旱性和对ABA反应的气孔开度。
[0053] a.野生型和4个独立的转基因株系中DOSl基因的RT-PCR分析。
[0054] b.不同植物材料在干旱条件下的生长表型。
[0055] c.不同植物材料干旱处理后的存活率统计。
[0056] d.不同植物材料叶片失水率测定。
[0057] e_f.不同植物材料中ABA诱导的气孔开度的比较（e)和测量（f)。
[0058] 图7、ABA缺失突变体或ABA信号突变体中DOSl基因的表达模式改变。Col-O :拟 南芥野生型；abal，aba2 :ABA缺失突变体；abil-lC，abi2_l :ABA信号突变体。
[0059] 图8、AREBs和ABF3蛋白活化DOSl的转录。
[0060] a.各种ABA信号突变体中DOSl的mRNA水平。
[0061] b.在areblareb2abf3三缺突变体中ABA诱导的DOSl的表达被阻断。
[0062] c-d. DOS I: : LUC的瞬时表达检测。
[0063] 图9、在水稻中异源过表达AtDOSl基因提高水稻抗旱性。
[0064] A.转基因水稻的PCR鉴定。M，DNA marker ;P，质粒正对照；N，负对照；WT，野生型 水稻；1-16,不同的转基因株系。
[0065] B.转基因株系的⑶S染色。
[0066] C.转基因水稻中AtDOSl基因的表达水平分析。
[0067] D. PEG(20%处理15天）模拟干旱条件下的转基因水稻与野生型的抗旱差异。D4、 D12、D13为C中相应的三个转基因株系。

【具体实施方式】
[0068] 本发明人经过广泛的研究，找到一种对于调节植物抗逆境能力（提高植物耐旱的 能力）有用的基因--脱水过度刺激基因 I (Dehydration Over Stimulatedl，D0S1)，其是 TRAF-Iike家族基因，其可在不影响植物正常生长发育的前提下，减少植物在缺水情况下的 蒸腾速率，从而提高了抗旱性。本发明的基因可极好地应用于植物品种的改良，提高植物对 于逆境的抵抗力。本发明为运用转基因等分子育种技术培育耐旱的农作物新品种，提供了 非常有价值的基因资源。
[0069] 本发明中，对于适用于本发明的植物（或作物）没有特别的限制，只要其适合进行 基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是（不限 于）：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。更具体地，所述的植物包括（但不限于）：小麦、 大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、搜桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌 豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西 瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、 胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡 椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。
[0070] 作为一种优选方式，所述的"植物"包括但不限于：禾本科植物（包括稻属，山羊草 属，冰草属，燕麦草属，燕麦属，薏苡属，稗属，披碱草属，偃麦草属，旱禾属，旱麦草属，大麦 属，黑麦草属，黍属，黑麦属，高粱属，小麦属），十字花科植物（包括鼠耳芥属，芸薹属，萝卜 属，荠属，独行菜属，菘蓝属，薄菜属，糖芥属）。
[0071] 本发明的DOSl多肽（蛋白）可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组 多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从植物 细胞中产生。
[0072] 本发明还包括DOSl蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍 生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的DOSl蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。 本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是 由遗传密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或（iii)附 加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽。根据本文的定义这些片段、衍生物和类 似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0073] 在本发明中，术语"D0S1蛋白"指具有提高植物耐旱能力的SEQ ID N0:2序列的 多肽。该术语还包括具有提高植物耐旱能力的、SEQ ID N0:2序列的变异形式。这些变异 形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳 地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/ 或N末端添加或缺失一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以 内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋 白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改 变蛋白质的功能。该术语还包括DOSl蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0074] 多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突 变体、在高或低的严紧度条件下能与DOSl蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提 供了其他多肽，如包含DOSl蛋白或其片段的融合蛋白。
[0075] 本发明还提供DOSl蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然DOSl蛋白的差别可 以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些 多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴 露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物 还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在 的或合成的氨基酸（如β、Y-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例 举的代表性的多肽。
[0076] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨 酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化 了溶解性能的多肽。
[0077] 在本发明中，"D0S1蛋白保守性变异多肽"指与SEQ ID Ν0:2的氨基酸序列相比， 有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近 的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0078] 表 1
[0079]

【权利要求】
1. 一种D0S1多肽或其编码基因的用途，用于提高植物耐旱能力。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述D0S1多肽还用于： 提高植物在干旱条件下的存活率； 降低植物的失水速率； 减小植物的气孔开度；或 降低植物在缺水情况下的蒸腾速率。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述D0S1多肽是： (a) 如SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白；或 (b) 将SEQ ID N0:2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的，且具有提高植物耐旱能力功能的由（a)衍生的蛋白。
4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的植物包括：禾本科植物，十字花科植 物。
5. -种提高植物耐旱能力的方法，所述方法包括：提高植物中D0S1多肽的表达或活 性。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：将D0S1多肽的编码基因 转入植物中。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤： (i) 提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有D0S1多肽的编码基因； (ii) 将植物细胞、组织或器官与步骤（i)中的农杆菌接触，从而使所述D0S1多肽的编 码基因转入植物。
8. -种转基因作物，其特征在于，利用权利要求5-7所述的方法制备，并且相对未表达 转基因的野生型作物其抗旱能力得到提高。
9. 一种D0S1多肽或其编码基因的用途，用作鉴定植物的耐旱能力的分子标记物。
【文档编号】C12N15/84GK104278053SQ201310281850
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月5日 优先权日:2013年7月5日
【发明者】张洪霞, 包岩, 王翠亭 申请人:中国科学院上海生命科学研究院