可利用五碳糖及六碳糖生产乳酸的酵母菌的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种酿酒酵母菌(Saccharomyces?cerevisiae)的生物纯培养物，其培养物具有可高量生产乳酸的特征性质。本发明亦提供一种包含制备所述生物纯培养物的方法，及一种用于产生乳酸的方法。
【专利说明】可利用五碳糖及六碳糖生产乳酸的酵母菌
【技术领域】
[0001]本发明关于乳酸的生产技术，详细的，关于用于高量生产乳酸的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及方法。
【背景技术】
[0002]传统乳酸生产是使用乳酸菌(Lactobacillus spp.)发酵而得,但乳酸菌的培养须使用复合式培养基，所述复合式培养基的成本高，除了增加发酵过程的成本外，亦增加自发酵液中分离纯化乳酸的成本。然而，若欲应用以乳酸为单体所聚合成的聚乳酸于日用塑料中，生产乳酸的成本必须降低，因此，许多研究开始尝试改良菌种，例如使用酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)进行微生物发酵以生成乳酸。酿酒酵母菌的原生菌株无法进行乳酸发酵，因此在1994年Dequin等人透过基因工程，于酿酒酵母菌的细胞内表现外源乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)，使酿酒酵母菌可利用葡萄糖发酵生产乳酸(B1technology (New York), Feb.1994,12:ρ.173-177),此为利用酵母菌生产乳酸的第一篇报导文献。
[0003]可做为发酵碳源的生质原料来源相当广泛,包含糖质(sugar)、淀粉(starch)及木质纤维素(Iignocellulose),其中利用糖质或淀粉原料做为发酵碳源以生产乳酸、有机酸或酒精等生质能源与材料的技术已十分成熟，然而，因粮食供给压力与谷物成本上涨，利用糖质或淀粉原料生产生质能源或材料并不经济且不符期待，因此产业界积极投入发展以木质纤维素做为碳源而生产生质材料或能源。
[0004]五碳醣是半纤维素的主要组成之一，在植物纤维中含量可达到30%，因此，有效利用木醣并转化为目标产物是使用木质纤维素为碳源的重要关键。以纤维素酒精工业发展为例，酒精工业上最广为应用的原生酿酒酵母无法代谢五碳醣，因此从80年代开始科学家便利用基因工程技术或是驯化菌株方法改善酵母菌或细菌来发酵木醣等五碳醣生产酒精，其中以Nancy Ho等人最早揭露制备酿酒酵母菌的方法(美国实用专利第5789210号)，解决了培养成本以及使用混合碳源的问题，Nancy Ho等人利用基因转殖技术，使酵母菌带有并表现木醣还原酶(xylose reductase,XR)、木醣醇脱氢酶(xylose dehydrogenase,XDH)以及木酮醣激酶(xylulokinase，XKS)基因，此种重组酵母菌株可将木醣发酵为酒精。
[0005]于2001 及 2002 年，Nature Works LLC(美国实用专利第 7109010 及 7141410 号)分别揭露使用基因转殖技术，让原生菌株可代谢木醣的酵母菌Kluyveromyces marxianus以及Candida sonorensis表现外源乳酸脱氢酶，使其可将木醣发酵生成乳酸，但其产率低，约仅有5%至34%。至2004年Cargill Inc (美国实用专利第7943366号)揭露藉由剔除Kluyveromyces marxianus及Candida sonorensis原本的五碳醣代谢基因木醣还原酶(xylose reductase, XR)及木醣醇脱氢酶(xylose dehydrogenase, XDH),转而表现木酮醣激酶(xylulokinase, XKS)以及外源木醣异构酶(xylose isomerase, XI),以提升所述酵母菌利用木醣发酵生成乳酸的能力，产率可达79 %。此技术虽然提升乳酸的产率，但Kluyveromyces marxianus 及 Candida sonorensis 并非一般常用的发酵菌种。
[0006]于2006 年，Takahashi 等人将 Saccharomyces cerevisiae 的原生 F1DCl 以及H)C5基因置换成LDH，让酵母菌株可代谢葡萄醣生成乳酸，其产率虽可达81.5%，但此种菌株生长慢，且发酵速率慢，需时200小时才可达到最高产率(B1sci B1technolB1chem.2006May ；70(5):1148-53)，并不符合快速生产的要求。综上，习知技术利用菌种改良所开发出的乳酸生产技术，其产率或生产过程虽已有提升，惟用于量产时，可使用的碳源仍受限，故开发出一种可以产生更高乳酸产量的菌株，以及可以产生更高乳酸产量的低成本生产方式仍有其需求。
【发明内容】
[0007]本发明提供一可高量生产乳酸的酵母菌，由于酿酒酵母菌具有培养容易且发酵能力强等许多优势，本发明利用基因改质方式，使酿酒酵母菌可利用木醣发酵生成乳酸，且提高产率至约80%。
[0008]本发明提供一种微生物菌株的生物纯培养物，其中所述微生物菌株源自酿酒酵母菌FENC-05并包含至少一套数的外源乳酸脱氢酶基因；及所述微生物菌株利用碳源生产乳酸的产率为大于约75%，其中所述碳源包含五碳糖及六碳糖；及所述酿酒酵母菌FENC-05根据布达佩斯条约寄存于德国微生物菌种保藏中心，寄存编号为DSM25508。
[0009]本发明亦提供一种制备根据前述的生物纯培养物的方法，其包含将所述外源乳酸脱氢酶基因转型入酿酒酵母菌FENC-05，并筛选利用碳源生产乳酸的产率大于约75%的微生物菌株，其中所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
[0010]本发明再提供一种生产乳酸的方法，其特征在于一培养基中培养根据前述的微生物菌株的生物纯培养物，并自所述生物纯培养物获得乳酸，其中所述培养基包含碳源，且所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
[0011]在以下部分中详细描述本发明。可在以下【【具体实施方式】】及权利要求书中容易地发现本发明的其它特征、目的及优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1显示pFENC-ΟΙ的质体图谱。
[0013]图2显示pFENC-LOl的质体图谱。
[0014]图3显示pFENC-Cre的质体图谱。
[0015]图4显示pFENC-L02的质体图谱。
[0016]图5显示FENC-Sc5dPL_4LK的乳酸脱氢酶蛋白质的蛋白质电泳图及西方墨点法结果图。
【具体实施方式】
[0017]参考以下对本发明的各方面、实例及伴随相关描述的化学图式及表格的详细描述，可更容易地了解本发明。在揭示与描述本发明的化合物、组合物和/或方法之前，应了解，除非由权利要求书另外特别地指出，否则本发明不受限于特定制备方法、载剂或调配物或将本发明化合物调配成用于局部、经口或非经肠投予的产物或组合物的特定模式，这是由于所属领域的一般技术人员非常清楚这些事情是可以加以变化的。还应了解，本文所用的术语仅用于描述特定方面的目的而不意在用于限制本发明的范围。
[0018]除非另外指出，否则如本发明所用的以下术语应解释为具有以下含义。
[0019]如本文所用的术语「乳酸」是指2-羟基丙酸，其是多种生物化学过程中重要的化合物。乳酸为含有羟基的羧酸，其分子式为c3h603。乳酸有两种旋光异构体，一个为L_(+)_乳酸或(S)-乳酸，另一个为D-(-)-乳酸或(R)-乳酸。于本发明的优选具体例中，乳酸指L- (+)-乳酸或(S)-乳酸。
[0020]本发明所言的「纯培养物」乙词指只有一种微生物的培养物，如果某一培养物是由单一微生物细胞繁殖产生的，就称为所述微生物的纯培养物。
[0021]范围在本文中通常表述为「约」一个特定值及/或至「约」另一个特定值。当表述此类范围时，一态样为包括一个特定值及/或至另一个特定值的范围。类似地，当值藉由使用字「约」表述为近似值时，应了解特定值可形成另一态样。另外应了解，每一范围的各端点皆有显著性，一端点与另一端点既有相关性，亦彼此独立。
[0022]「视情况」或「视情况地」意谓随后所述的事件或状况可能发生或可能不发生，且所述描述包括所述事件或状况发生的情况及其未发生的情况。举例而言，「视情况包含试剂」意谓所述试剂可能存在或可能不存在。
[0023]根据本发明中乳酸的产率测定可为一般的测定方法，具体来说，可利用高效率液相层析仪(HPLC)定量。于下文中所言的乳酸产量是将酸酵后所得的样品，经离心过滤，所得的滤液再经HPLC定量所得的数值。HPLC进行分析的条件为:管柱为TranSgen0miCS87Hcolumn,管柱温度设定为65°C,移动相则为5mM H2SO4J^速为0.6mL/min。
[0024]必须指出，除非上下文另外清楚规定，否则如本说明书及随附申请专利范围中所用的单数形式「一」及「所述」包括复数个所指标的物。因此，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
[0025]本发明提供一种微生物菌株的生物纯培养物，其中所述微生物菌株源自酿酒酵母菌FENC-05并包含至少一套数的外源乳酸脱氢酶基因；及所述微生物菌株利用碳源生产乳酸的产率为大于约75%，优选为约75%至约80% ;及所述酿酒酵母菌FENC-05根据布达佩斯条约寄存于德国微生物菌种保藏中心，寄存编号为DSM25508。
[0026]本发明所言的「外源」乙词指来源并非酿酒酵母菌野生种，亦即自然界不存在于酿酒酵母菌中。
[0027]本发明所言的「乳酸脱氢酶基因」乙词指其编码的产物为具有乳酸脱氢酶活性，其中乳酸脱氢酶具有催化丙酮酸与乳酸间的转换能力，或具催化还原型烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸与其氧化型之间的转换能力。因乳酸具有L- (+)-乳酸以及D-(-)-乳酸两种旋光异构体，L_(+)_乳酸由L-乳酸脱氢酶生成，D-(-)_乳酸由D-乳酸脱氢酶生成，优选地，所述乳酸脱氢酶为由L-乳酸脱氢酶基因所编码。
[0028]根据本发明的外源乳酸脱氢酶基因可为已经译码或未经译码的完整基因或其功能性片段。于本发明的一优选具体实施例中，所述外源乳酸脱氢酶基因源自牛。
[0029]由于每个物种进行胺基酸序列转译时，都有其惯用的核酸密码子(codon)，因此，如欲于细胞内表现外源基因时，若直接使用原始物种基因序列，会因为密码子无法被宿主细胞辨识而无法转录、转译成蛋白质，因此于本发明的一优选具体实施例中，所述外源乳酸脱氢酶是以小牛(bovine)的乳酸脱氢酶基因编码为模板，经过人工最适化处理，比对物种惯用密码子数据库(http://www.kazusa.0r.jp/codon/),将来自牛的乳酸脱氢酶基因编码修改成易于酵母菌细胞辨识的人造序列(artificial sequence),并示于SEQ ID N0.11,使此段基因编码可以在酵母菌细胞内表现有酵素功能的乳酸脱氢酶蛋白质。
[0030]根据本发明的所述外源乳酸脱氢酶基因可由酿酒酵母菌固有的启动子启动，或为外源启动子所启动。优选地，所述外源乳酸脱氢酶是由酿酒酵母菌固有的启动子启动；由于所述外源乳酸脱氢酶与碳源的利用相关，故更优选地，所述外源乳酸脱氢酶由与碳源利用相关的酿酒酵母菌固有的启动子启动；尤优选地，所述外源乳酸脱氢酶是经丙酮酸脱羧酶I启动子所调控。
[0031]于本发明的优选具体实施例中，所述外源乳酸脱氢酶基因取代酿酒酵母菌中原生的丙酮酸脱羧酶I 结构基因，并由完整的丙酮酸脱羧酶I启动子所调控。
[0032]于本发明的一优选具体实施例中，所述微生物菌株为酿酒酵母菌，另包含至少一套数的五碳醣代谢基因。优选地，所述五碳醣代谢基因是选自由木醣还原酶、木醣醇脱氢酶、木酮醣激酶及木醣异构酶所组成的群。
[0033]于本发明的一优选具体实施例中，所述生物纯培养物包含酿酒酵母菌FENC-Sc5dPL-4LK,根据布达佩斯条约寄存于德国微生物菌种保藏中心，寄存编号为DSM26705。
[0034]FENC-Sc5dPL-4LK菌株相较于母株FENC-05，其使用包含五碳糖及六碳糖的碳源发酵时，酒精转换率只剩下10%，而乳酸产率可达到80%。
[0035]本发明亦提供一种制备根据前述的生物纯培养物的方法，其包含将所述外源乳酸脱氢酶基因转型入酿酒酵母菌FENC-05，并筛选利用碳源生产乳酸的产率大于约75%的微生物菌株，其中所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
[0036]于本发明的一优选具体实施例中，所述方法包含剔除酿酒酵母菌的丙酮酸脱羧酶1，并使所述外源乳酸脱氢酶基因经丙酮酸脱羧酶I启动子所调控。
[0037]根据本发明的方法，筛选生产乳酸的产率大于约75%的微生物菌株的方法，可直接测定乳酸的产率或筛选外源乳酸脱氢酶基因套数较多的微生物菌株，优选筛选外源乳酸脱氢酶基因套数较多的微生物菌株，于本发明的一优选具体实施例中，可利用含碳酸钙的培养基进行筛选。因乳酸脱氢酶基因套数较多的微生物菌株可产生较多乳酸，且乳酸会与碳酸钙反应，形成溶解度较碳酸钙高的乳酸钙，故在可产生乳酸的微生物菌落周围，原本呈现白色的含碳酸钙培养基会变成透明，形成一透明圈。因此，藉由挑选透明圈较大的微生物菌株，可得到乳酸产率较高的微生物菌株。另一方面，其中所述筛选方法可为同时转殖一报导基因，并藉由测定所述报导基因的表现而测定。于本发明的一优选具体例中，所述报导基因为一抗药性基因。
[0038]于本发明的具体实施例中，剔除酿酒酵母菌株FENC-05的原生丙酮酸脱羧酶1，并同时以外源乳酸脱氢酶基因取代原本丙酮酸脱羧酶基因的位置，使得乳酸脱氢酶表现受到原本丙酮酸脱羧酶I启动子的调控，得到重组酵母菌株FENC-5dPLK。接着以Cre/loxp系统，移除菌株的抗药性基因，得到FENC-5dPL使得菌株可以再次进行外源乳酸脱氢酶转殖，让外源乳酸脱氢酶伴随抗药性基因以随机的方式，插入酵母菌基因体中，接着以含有高抗生素浓度的培养基筛选出抗药性较高的菌株，以挑选出含有较多乳酸脱氢酶套数的酵母菌株，即为 FENC-Sc5dPL-4LK。
[0039]本发明再提供一种生产乳酸的方法,其特征在于一培养基中培养根据前述的微生物菌株的生物纯培养物，并自所述生物纯培养物获得乳酸，其中所述培养基包含碳源，且所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
[0040]于本发明的优选具体例中，所述六碳糖是选自由葡萄糖、果糖(Fructose)、半乳糖(Galactose)及甘露糖(Mannose)所组成的群。
[0041]另一方面，于本发明的优选具体例中，所述五碳糖是选自由木糖及阿拉伯糖所组成的群。
[0042]根据本发明的方法可以本发明所属【技术领域】中具通常知识者熟知的方式进行酸酵。培养优选为批次培养或馈料批次培养。其具体培养基的调配及培养条件的决定为本发明所属【技术领域】中具通常知识者基于本发明说明书的揭示而可决定者。
[0043]根据本发明，乳酸存在于微生物中或培养基中。本发明的方法进一步包含自液体培养基中回收乳酸的步骤。可以一般本发明所属【技术领域】中具通常知识者熟知的方式进行回收。
[0044]以下的非限制性的实例有助于本发明所属【技术领域】中具通常知识者实施本发明。所述等实例不应视为过度地限制本发明。本发明所属【技术领域】中具有通常知识者可在不背离本发明的精神或范畴的情况下对本文所讨论的实施例进行修改及变化，而仍属于本发明的范围。
[0045]SM
[0046]木醣代谢相关基因选殖及重组质体建构
[0047]本实例中木醣代谢相关基因选殖工作是利用聚合酶连锁反应(Polymerase chainreact1n, PCR)进行。首先以 SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4 的引子组合，并以酿酒酵母菌BCRC22743所提取的基因库为模板，选殖出pGK启动子及pGK终结子；以 SEQ ID N0.5/SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7/SEQ ID N0.8 的引子组合，从 Pichiastipitis细胞中，选殖出木醣还原酶(XR)、木醣醇脱氢酶(XDH)基因；&SEQ ID N0.9/SEQID N0.10引子组合，并以酿酒酵母菌BCRC22743所提取的基因库为模板，以PCR选殖木酮醣激酶(XKS)基因，将以上核酸片段以适当的限制酶切位共同构筑至PAUR101质体中，即完成木醣相关基因重组载体的建构，所得的质体为pFENC-01 (如图1所示)。
[0048]建构可将roci基因置换成乳酸脱氢酶基因(LDH)的质体pFENC_L01
[0049]将Takahashi等人的方式稍做修改,建立基因转殖载体,将LDH基因表现卡匣插入酵母菌染色体上 PDCl 的位置(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROB1LOGY, Apr.2005，p.1964-1970)，做法如下:
[0050]乳酸脱氢酶LDH全基因合成
[0051]以小牛(bovine)的LDH基因编码为模板，经过人工最适化处理，比对物种惯用密码子数据库(http://www.kazusa.0r.jp/codon/),将来自牛的LDH基因编码修改成易于酵母菌细胞辨识的人造序列SEQ ID N0.11，使此段基因编码可以在酵母菌细胞内表现有酵素功能的LDH蛋白质。
[0052]依照SEQ ID-1l的序列以PCR进行乳酸脱氢酶的全基因合成。
[0053]建构基因置换质体pFENC-LOl
[0054]分别以SEQ ID N0.12/SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.14/SEQ ID N0.15 以及 SEQ IDN0.16/SEQ ID N0.17为引子组合，酿酒酵母菌BCRC22743所提取的基因库为模板，进行PCR选殖部分roCl启动子片段(400bp) ,PDCl终结子片段以及ENOl终结子；以SEQ ID N0.18/SEQ ID N0.19为引子组合，pFa_KanMX6质体为模板，进行PCR选殖抗G418基因表现卡匣，并使其带有1xp序列。将上述核酸片段与LDH基因片段以及载体pBluescript II KS(-)以适当限制酶切位进行接合，得到基因置换质体pFENC-LOl (如图2所示)。
[0055]建构Cre/1οχρ基因移除系统的重组酶表现质体pFENC-Cre
[0056]将Hegemann等人的方式稍做修改，建立酵母菌基因移除系统(Nucleic AcidsResearch, 1996，Vol.24，N0.132519-2524)，做法如下:
[0057]重组酶Cre全基因合成
[0058]以曬菌体 Pl (Enterobacteria phage Pl, NCBI Reference Sequence:YP_006472.1)的Cre基因编码为模板，经过人工最适化处理，比对物种惯用密码子数据库(http://www.kazusa.0r.jp/c odon/),将来自曬菌体Pl的Cre基因编码修改成易于酵母菌细胞辨识的人造序列SEQ ID N0.20，使此段基因编码可以在酵母菌细胞内表现有酵素功能的Cre蛋白质。依照SEQ ID N0.20的序列以PCR进行Cre的全基因合成。
[0059]建构重组酶Cre诱导表现质体pFENC-Cre
[0060]以SEQ ID N0.21/SEQ ID N0.22 为引子组合，pFa_KanMX6 质体为模板，进行 PCR选殖抗G418基因表现卡匣；以SEQ ID N0.23/SEQ ID N0.24为引子组合，pFa6a_Hyg质体为模版，进行PCR选殖抗Hygromycine基因表现卡匣；以SEQ ID N0.25/SEQ ID N0.26为引子组合，pYDl(Invitrogen)质体为模板，进行PCR选殖GALl启动子片段；分别以SEQ ID N0.16/SEQ ID N0.17为引子组合，酿酒酵母菌BCRC22743所提取的基因库为模板，进行PCR选殖ENOl终结子；以SEQ ID N0.27/SEQ ID N0.28为引子组合，pSosColI (AgilentTeclmologies)质体为模板,进行PCR选殖2u ori片段。将上述核酸片段与Cre基因片段及载体PUC19以适当限制酶切位进行接合，得到重组酶Cre诱导表现质体pFENC-Cre (如图 3 所示)。
[0061]建构乳酸脱氢酶基因LDH表现质体pFENC-L02
[0062]分别以SEQ ID N0.29/SEQ ID N0.30 以及 SEQ ID N0.31/SEQ ID N0.32 为引子组合，酿酒酵母菌BCRC22743所提取的基因库为模板，进行PCR选殖出酵母菌逆转座子(retrotransposon) Delta 序列基因片段；以 SEQ ID N0.33/SEQ ID N0.13 为引子组合，酿酒酵母菌BCRC22743所提取的基因库为模板，进行PCR选殖完整roCl启动子(900bp);以SEQ ID N0.34/SEQ ID N0.35为引子组合，质体pFENC-LOl为模板，进行PCR选殖抗G418基因表现卡匣；以限制酵素Avrll/BamHI对质体pFENC-LOl进行酶切反应，得到LDH-EN01终结子；将上述核酸片段与载体PUC19以适当限制酶切位进行接合，得到质体pFENC-L02(如图4所示)。
[0063]建构可同时代谢葡萄醣以及木醣的酵母菌株FENC-05
[0064]将pFENC-ΟΙ质体以化学法转殖至工业用酵母菌株(酿酒酵母菌BCRC22743)中(Tranformat1n of yeast by the LiAC/SS carrier DNA/PEG method.Methods inEnzymology,2002,350,p.87-96.)，以含 0.5μ g/L Aureobasidin A 的 YPD 固态培养基(1%酵母萃取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂)筛选转型株，置于30°C培养，从转型株中挑出代谢五碳醣能力优选的酵母菌株FENC-05，FENC-05根据布达佩斯条约寄存于德国微生物菌种保藏中心，寄存编号为DSM25508。
[0065]剔除FENC-05的原生I3DCl基因，并同时在所述基因座位置放入LDH基因，建立菌株 FENC-5dPL
[0066]以电穿孔方式将质体pFENC-LOl酶切片段送入酵母菌FENC-05的细胞中
[0067]以限制酵素BssHII对质体pFENC-LOl进行酶切反应，将所得带有LDH基因编码的核酸片段，以电穿孔方式(1.5kV, 200ohm, 25uF, 2mm cuvette)送入酵母菌细胞内，并且以含300 μ g/mL G418的YPD固态培养基筛选对G418具有抗性的转殖株。
[0068]以碳酸钙培养基筛选出roCl基因被置换成LDH基因的转殖株
[0069]将对G418具有抗性的转殖株转移到含0.5%碳酸钙的YPD固态培养基进行培养，由于BssHII酶切pFENC-LOl片段上只带有部分I3DCl启动子(400bp)，并不足以驱使LDH表现，因此，唯有完成以LDH基因取代原生roCl序列的转殖株，其LDH基因才能受到完整原生roCl启动子序列调控而表现，产生乳酸，并在碳酸钙培养基上产生透明圈(clear zone) 0将会产生透明圈的菌株5dP5LK-10进行产孢培养(sporulat1n);先在YPK培养基(20g/L蛋白胨，10g/L酵母萃取物， 10g/L KAc)中培养16小时，再将菌体移至SPM培养基(10g/LKAc, I g/L酵母萃取物，0.5g/L葡萄糖，0.05g/L腺苷，0.05g/L尿苷，0.1 g/L色胺酸，0.1 g/L亮胺酸，0.1 g/L组胺酸)，30°C培养5-7天进行产孢；将SPM菌液涂在YPD固态培养基上以挑选出单一菌落，将单一菌落转移至含有0.5%碳酸钙的YPD固态培养基进行培养，挑选出透明圈有变大的菌株，表示其基因体上的两套roCl基因皆已置换成LDH基因，所述菌株为5dP5LK-10S8。
[0070]以Cre/loxP系统移除5dP5LK_10S8菌株的抗药性基因，建立菌株FENC_5dPL[0071 ] 以电穿孔方式将质体pFENC-Cre转殖入5dP5LK_10S8中，以含有300 μ g/mLHygromycin的YPD固态培养基筛选转殖成功的菌株，以2% SG固态培养基(20g/L半乳糖，
6.7g/LYNB, 20g/L琼脂)培养转殖株，诱导Cre表现，进行抗G418抗药性基因移除。将从2% SG培养基中长出的菌落分别移至含有300 μ g/mL G418或是300 μ g/mL Hygromycin的YPD固态培养基，确认其无法生长，表示已完成抗药性基因移除以及pFENC-Cre丢失；得到菌株 FENC-5dPL。
[0072]建构高LDH表现量的菌株FENC-Sc5dPL_4LK
[0073]以电穿孔方式将质体pFENC-L02酶切片段送入酵母菌FENC_5dPL细胞中
[0074]以限制酵素XhoI对质体PFENC-L02进行酶切反应，将所得带有LDH基因编码的核酸片段，以电穿孔方式(1.5kV，200ohm，25uF，2mm cuvette)转殖入FENC_5dPL细胞内，并且以含4000 μ g/mL G418的YPD固态培养基筛选对高浓度G418具有抗性的转殖株。
[0075]以碳酸钙培养基筛选出可能具有高LDH表现以及高乳酸产率特性的转殖株
[0076]将对高浓度G418具有抗性的转殖株移至碳酸钙培养基进行培养，挑选出透明圈比 FENC-5dPL 大的转殖株 FENC-Sc5dPL_4LK。
[0077]功效验证:
[0078]FENC-5dPL 发酵测试:
[0079]1.前培养1:挑选单一菌落，以2mL YPD(10g/L酵母萃取物；20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)进行培养7小时，300C，200rpm。
[0080]2.前培养2:将前培养I菌液倒入10mL YPD60 (10g/L酵母萃取物；20g/L蛋白胨，60g/L葡萄糖)中，培养24小时，30°C，200rpm。
[0081]3.菌体制备:将前培养2的菌液以8000rpm离心，去掉培养基，以二次水清洗两次，再以5mL 二次水悬浮菌体，测定0D600。
[0082]4.发酵:发酵液体积100mL(60g/L葡萄糖、35g/L木醣、lg/L尿素)；FENC_5dPL组别另外加入3%碳酸钙。取适量菌体悬浮液，以0D12接种至发酵液中。以水封管封口，30°C，200rpm培养72小时。
[0083]5.发酵液成分分析:
[0084](I)依时间点取ImL发酵液，以13，200rpm离心，取上清液以0.22 μ m/PVDF无菌丢弃式过滤器过滤后，以二次水稀释五倍。
[0085](2) HPLC 分析:Transgenomics87H column65°C, 5mM H2SO4,0.6mL/min。
[0086](3)产率(yield)计算:(产物浓度/起始总醣量)xlOO %,其结果示于表1及表2。
[0087]表1:发酵产物量
[0088]
【权利要求】
1.一种微生物菌株的生物纯培养物，其中所述微生物菌株源自酿酒酵母菌FENC-05并包含至少一套数的外源乳酸脱氢酶基因；及所述微生物菌株利用碳源生产乳酸的产率为大于75%，其中所述碳源包含五碳糖及六碳糖；及所述酿酒酵母菌FENC-05根据布达佩斯条约寄存于德国微生物菌种保藏中心，寄存编号为DSM25508。
2.根据权利要求1所述的生物纯培养物，其中所述外源乳酸脱氢酶基因具有SEQIDN0.11所示的序列。
3.根据权利要求1所述的生物纯培养物，其中所述外源乳酸脱氢酶基因经丙酮酸脱羧酶I启动子所调控。
4.根据权利要求1所述的生物纯培养物，其中所述微生物菌株另包含至少一套数的五碳醣代谢基因。
5.根据权利要求4所述的生物培养物，其中所述五碳醣代谢基因是选自由木醣还原酶、木醣醇脱氢酶、木酮醣激酶及木醣异构酶所组成的群。
6.根据权利要求1所述的生物纯培养物，其中所述微生物菌株为FENC-Sc5dPL-4LK，根据布达佩斯条约寄存于德国微生物菌种保藏中心，寄存编号为DSM26705。
7.一种制备根据权利要求1至6任何一项所述的生物纯培养物的方法，其包含将所述外源乳酸脱氢酶基因转型入酿酒酵母菌FENC-05，并筛选利用碳源生产乳酸的产率大于约75%的微生物菌株，其中所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
8.根据权利要求7所述的方法，其包含剔除酿酒酵母菌的丙酮酸脱羧酶1，并使所述外源乳酸脱氢酶基因经丙酮酸脱羧酶I启动子所调控。
9.一种生产乳酸的方法，其特征在于一培养基中培养根据权利要求1至6任何一项的微生物菌株的生物纯培养物，并自所述生物纯培养物获得乳酸，其中所述培养基包含碳源，且所述碳源包含五碳糖及六碳糖。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述六碳糖是选自由葡萄糖、果糖、半乳糖及甘露糖所组成的群。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述五碳糖是选自由木糖及阿拉伯糖所组成的群。
12.如权利要求9所述的方法，其进一步包含自所述培养基中回收乳酸的步骤。
【文档编号】C12N1/19GK104073448SQ201310288914
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年7月10日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】吕立婷, 黄德仁 申请人:远东新世纪股份有限公司