一种非病毒基因载体材料及其制备方法和应用、脑靶向基因传输系统及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种非病毒基因载体材料及其制备方法和应用。该非病毒基因载体材料以可生物降解的聚谷氨酸作骨架，连接富含氨基的树状聚丙烯亚胺分子，具有低毒、转染率高、可生物降解且生物相容性好的特点，可应用于制备治疗中枢神经系统原发性退行性变性疾病治疗工具。本发明还提供了由该非病毒基因载体材料偶联乳铁蛋白组成的脑靶向基因传输系统及其制备方法和应用，可应用于制备治疗中枢神经系统原发性退行性变性疾病治疗工具。
【专利说明】一种非病毒基因载体材料及其制备方法和应用、脑靶向基因传输系统及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种非病毒基因载体材料及其制备方法和应用、脑靶向基因传输系统及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种强有效的基因沉默工具，已被广泛应用于基因功能、细胞信号转导通路、药物靶点的筛选、基因治疗等研究领域。
[0003]阿尔茨海默病(Alzheimer，s disease, AD, Alzheimer病)是一种中枢神经系统原发性退行性变性疾病，主要临床相为痴呆综合症，致残致死率极高。随着基因治疗技术的发展，对AD采用RNA干扰手段以抑制脑内代谢异常并减少β淀粉样蛋白(Αβ)的生成是一个薪新的思路。但如何将针对祀点的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)安全有效地穿过血脑屏障(blood-braid barrier, BBB)及如何使治疗基因在脑内保持长期的高表达而达到治疗目的，是目前RNA干扰技术中面临的一个难点，也是基因治疗能否在临床应用的关键所在。
[0004]阳离子聚合物是近年来发展起来的一类非病毒基因载体，主要有聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖(chitosan)、鱼精蛋白(protamine)和树状聚合物(dendrimer)等。聚丙烯亚胺(Poly(propylenimine) ,PPI)树状聚合物1993年首次被合成出来,该聚合物以二胺为引发剂，以丙烯腈为结构单元，通过反复的Michael加成和腈的还原得到不同代数的树状大分子，PPI树状大分子的大小由代数来标明，并随代数增加而增加。PPI含有100%可质子化的氮,生理pH条件下能够被质子化带上正电荷,通过与SiRNA或DNA链上负电性的聚电解质(磷酸根) 的静电作用缔合成复合物，内部的氨基使其具有较强的缓冲能力。这些树状聚合物形态是均一的，它们在介导基因转染方面具有明显优势。
[0005]与DNA的结合能力是PPI发挥转染作用的先决条件，研究发现，随着代数的增加，PPI与DNA的结合能力增强，第一代PPI并不能有效的结合DNA，第二代PPI在N/P比较高的情况下可结合部分DNA，第三代以上的PPI可有效地结合DNA。Hollins AJ等(PharmRes, 2004, 21 (3):458-466)研究表明，较低代数的PPI如第二代、第三代表面分别含有8到16个氨基，可介导反义寡脱氧核苷酸转染A431表皮样细胞。一般来讲PPI的毒性会随着代数的增加而急剧增加，这大概是目前为止PPI没有像PAMAM —样被广泛研究的原因之一。
[0006]开发或构建低毒、安全实用同时具有较高转染率、靶向、可生物降解且生物相容性好的新型基因载体材料及靶向基因传输系统是RNAi技术成功应用的途径之一，仅有一些相关内容供参考，例如，Koppu 等(J.Control Release, 2010, 143(2):215-221)将第三代PPI连接上转铁蛋白(Tf )，使其可通过肿瘤细胞上存在的Tf受体介导的内吞作用进入到肿瘤细胞中，研究表明具有明显的肿瘤靶向性，且未表现出明显的毒性。
【发明内容】
[0007]为解决上述问题，本发明第一方面旨在提供一种非病毒基因载体材料的制备方法，该非病毒基因载体材料低毒、转染率高、可生物降解且生物相容性好。本发明第二方面旨在提供该非病毒基因载体材料。本发明第三方面旨在提供该非病毒基因载体材料在制备治疗中枢神经系统原发性退行性变性疾病治疗工具中的应用。本发明第四方面旨在提供由该非病毒基因载体材料偶联乳铁蛋白组成的脑靶向基因传输系统的制备方法。本发明第五方面旨在提供由该非病毒基因载体材料偶联乳铁蛋白组成的脑靶向基因传输系统。本发明第六方面旨在提供脑靶向基因传输系统在制备治疗中枢神经系统原发性退行性变性疾病治疗工具中的应用。
[0008]第一方面，本发明提供了一种非病毒基因载体材料的制备方法，包括以下步骤:
[0009]( I)将第一聚丙烯亚胺、L-谷氨酸苄酯N-羧基环内酸酐在第一有机溶剂中混合，在O?40°C温度下搅拌反应48?96h，蒸除部分第一有机溶剂，加入温度为O?20°C的无水乙醚，搅拌后静置，将静置得到的沉淀抽滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，制得分枝状的聚谷氨酸节酯；
[0010]所述第一聚丙烯亚胺如式A?式F中任一结构式所示，第一有机溶剂为卤代烷有机溶剂或环醚类有机溶剂，所述第一聚丙烯亚胺与L-谷氨酸苄酯N-羧基环内酸酐的摩尔比为1:8?300 ;
[0011](2)将第二聚丙烯亚胺在2-羟基吡啶存在下溶解于第二有机溶剂中，搅拌下加入步骤(I)中制得的所述分枝状的聚谷氨酸苄酯，30?80°C温度下搅拌反应24?72h，加入去离子水，搅拌，将经过搅拌后的混合溶液透析，冻干，制得非病毒基因载体材料；
[0012]所述第二聚丙烯亚胺如式A?式F中任一结构式所示，第二有机溶剂为非质子型极性溶剂或环醚类有机溶剂，所述第二聚丙烯亚胺与所述分枝状的聚谷氨酸苄酯的摩尔比为 480 ?960:1 ;`
【权利要求】
1.一种非病毒基因载体材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将第一聚丙烯亚胺、L-谷氨酸苄酯N-羧基环内酸酐在第一有机溶剂中混合，在O?40°C温度下搅拌反应48?96h，蒸除部分第一有机溶剂，加入温度为O?20°C的无水乙醚，搅拌后静置，将静置得到的沉淀抽滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，制得分枝状的聚谷氨酸节酯; 所述第一聚丙烯亚胺如式A?式F中任一结构式所示，第一有机溶剂为卤代烷有机溶剂或环醚类有机溶剂，所述第一聚丙烯亚胺与L-谷氨酸苄酯N-羧基环内酸酐的摩尔比为1:8 ?300 ; (2)将第二聚丙烯亚胺在2-羟基吡啶存在下溶解于第二有机溶剂中，搅拌下加入步骤(O中制得的所述分枝状的聚谷氨酸苄酯，30?80°C温度下搅拌反应24?72h，加入去离子水，搅拌，将经过搅拌后的混合溶液透析，冻干，制得非病毒基因载体材料； 所述第二聚丙烯亚胺如式A?式F中任一结构式所示，第二有机溶剂为非质子型极性溶剂或环醚类有机溶剂，所述第二聚丙烯亚胺与所述分枝状的聚谷氨酸苄酯的摩尔比为480?960:1 ; 式A:
2.如权利要求1所述的一种非病毒基因载体材料的制备方法，其特征在于，所述式A、式B和式C中的一种或几种的m为2。
3.如权利要求1所述的一种非病毒基因载体材料的制备方法，其特征在于，步骤(I)中所述第一聚丙烯亚胺与L-谷氨酸苄酯N-羧基环内酸酐的摩尔比为1:50?200。
4.如权利要求1所述的一种非病毒基因载体材料的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃或1，4_环氧六环。
5.如权利要求1所述的一种非病毒基因载体材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述第二聚丙烯亚胺与所述分枝状的聚谷氨酸苄酯的摩尔比为600?800:1。
6.如权利要求1所述的一种非病毒基因载体材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述第二有机溶剂为N’ N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃或1，4-环氧六环。
7.—种非病毒基因载体材料,其特征在于，所述非病毒基因载体材料按如权利要求1?6中任一权利要求所述的制备方法制得。
8.如权利要求7所述的非病毒基因载体材料在制备治疗中枢神经系统原发性退行性变性疾病治疗工具中的应用。
9.一种脑靶向基因传输系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (I)将第一聚丙烯亚胺、L-谷氨酸苄酯N-羧基环内酸酐在第一有机溶剂中混合，在O?40°C温度下搅拌反应48?96h，蒸除部分第一有机溶剂，加入温度为O?20°C的无水乙醚，搅拌后静置，将静置得到的沉淀抽滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，制得分枝状的聚谷氨酸节酯; 所述第一聚丙烯亚胺如式A?式F中任一结构式所示，第一有机溶剂为卤代烷有机溶剂或环醚类有机溶剂，所述第一聚丙烯亚胺与L-谷氨酸苄酯N-羧基环内酸酐的摩尔比为1:8 ?300 ;(2)将第二聚丙烯亚胺在2-羟基吡啶存在下溶解于第二有机溶剂中，搅拌下加入步骤(O中制得的所述分枝状的聚谷氨酸苄酯，30?80°C温度下搅拌反应24?72h，加入去离子水，搅拌，将经过搅拌后的混合溶液透析，冻干，制得非病毒基因载体材料； 所述第二聚丙烯亚胺如式A?式F中任一结构式所示，第二有机溶剂为非质子型极性溶剂或环醚类有机溶剂，所述第二聚丙烯亚胺与所述分枝状的聚谷氨酸苄酯的摩尔比为480 ?960:1 ;
10.如权利要求9所述的一种脑靶向基因传输系统的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述乳铁蛋白与非病毒基因载体材料的摩尔比为1:20或1:40。
11.如权利要求9所述的一种非病毒基因载体材料的制备方法，其特征在于，所述式A、式B和式C中的一种或几种的m为2。
12.如权利要求9所述的一种非病毒基因载体材料的制备方法，其特征在，步骤(I)中所述第一聚丙烯亚胺与L-谷氨酸苄酯N-羧基环内酸酐的摩尔比为1:50?200。
13.如权利要求9所述的一种非病毒基因载体材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述第二聚丙烯亚胺与所述分枝状的聚谷氨酸苄酯的摩尔比为600?800:1。
14.一种脑祀向基因传输系统,其特征在于，所述脑祀向基因传输系统按如权利要求9?13中任一权利要求所述的制备方法制得。
15.如权利要求14所述的脑靶向基因传输系统在制备治疗中枢神经系统原发性退行性变性疾病治疗工具 中的应用。
【文档编号】C12N15/87GK103435814SQ201310288893
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月10日 优先权日:2013年7月10日
【发明者】鹏越峰, 张璇, 蔡青青, 房丽晶, 余再丹, 尚鹏 申请人:中国科学院深圳先进技术研究院, 深圳市精神卫生中心