一种鱼类鳞被相关基因的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一个鳞被相关基因及其功能分析，属于生物【技术领域】。其特征在于：该基因CDS长度为516bp，编码171个氨基酸。应用基因克隆、整体原位杂交和冷冻切片技术，研究该基因在鲤鱼鳞被起始发育过程中特异表达，为鱼类鳞被相关基因。该基因的克隆及功能分析扩大了鱼类鳞被相关研究的基因资源，为运用基因工程技术研究鱼类甚至人类毛发方面的研究，提供了更加丰富的优良候选基因。
【专利说明】一种鱼类鳞被相关基因
【技术领域】
[0001]本发明是鲤鱼鳞被相关的一个基因及其功能分析，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]在鱼类的养殖过程中，鳞被的特征是比较容易发现的。目前，对鳞被的研究很少，尤其在鲤鱼方面。长期的研究结果发现，镜鲤在肉质、生长速度等方面都显著优于普通鲤鱼，而二者最明显的性状在于皮肤表面覆盖的鳞被，而且鳞被在鱼类的抗病性研究中具有不可忽视的作用，并且有研究表明鱼类的鳞被与哺乳动物皮肤表面附属物，如毛发、汗腺甚至牙齿等有共同的进化祖先，因此从鲤鱼的鳞被入手。通过差异筛选出鳞被发育相关因子，本发明选取其中一个基因，进行克隆测序和功能分析，为应用基因工程技术提高鱼类尤其是哺乳动物毛发、汗腺等的研究，提供了更加丰富的优良候选基因。
【发明内容】
[0003]本发明克隆了鲤鱼鳞被相关的一个基因TPTl的⑶S全长。该基因⑶S长度为561bp，编码170个氨基酸。并通过整体原位杂交和冷冻切片技术，观察到在鳞被起始着生处发现该基因的特异表达。
【专利附图】
【附图说明】
[0004]图1为TPTl在镜鲤各个组织中的表达情况。
[0005]图2为整体原位杂交检测TPTl在鲤鱼胚胎和幼鱼发育时期的表达。
[0006]图3为整体原位杂交检测TPTl在鲤鱼鳞被和鳍条的表达情况。
[0007]图4为冷冻切片原位杂交检测TPTl在鲤鱼中的表达情况。
【具体实施方式】
[0008]按照INVITROGEN Trizol说明书提取鲤鱼皮肤RNA，测浓度并调节至lPg/^L，按照东洋纺RNA反转试剂盒的说明合成第一链cDNA。设计上游引物5，-TCCCCAGACACAATCCAACA-3，和下游引物5，-GCACAGCAAATGAGAAGCCA -3，进行鳞被相关基因TPTI的PCR扩增。PCR反应体系如下:10M-L 2xTaq Star mix with loading dye, IKL上游引物(1Mmol.L_1 )，IKL下游引物(lOMmol.1~1),7μ? 无菌 ddH20。PCR 反应条件如下，94°C变性 2min，94°C 30sec,60°C 30sec，72°C lmin，72°C 1min0在对PCR产物进行胶回收纯化后，连接T载体转化测序。
[0009]提取镜鲤的各个组织(心脏、肾脏、鳃、肌肉、肝脏、皮肤)的RNA，并按照上述方法进行反转录，以反转录的cDNA为模板，进行PCR，为消除cDNA、引物的污染问题，选择水做模板为阴性对照，看家基因β-actin做模板为阳性对照，扩增程序如上所述。
[0010]通过整体原位杂交检测鳞被相关基因TPTl在鳞片起始部位的表达情况。首先制备地高辛标记的探针(探针制备上游引物5，- TTGACTTCCGTGAGGATGGCGTC _3，和下游引物5，- ATCCTTTCCATCANGACCAGAGGC _3，)，实验材料选取不同发育时期的鲤鱼胚胎和长鳞前后的个体，冰上致死后，多聚甲醛(PFA)于4度冰箱中固定过夜，然后过渡到甲醇中于-20度脱水至少24h后进行原位杂交，检测TPTl在鲤鱼鳞被的发育过程中的表达情况。
[0011]进一步进行冷冻切片，并做原杂，从结构上观察该基因在鳞被形成过程中的表达情况。
[0012]通过对镜鲤的各个组织的RT-PCR可以看出该基因在皮肤中的表达量明显高于其他组织。将克隆得到的鳞被相关因子TPTl序列在DNAMAN中与其他物种进行比对，结果表明该基因编码的氨基酸序列在鱼类中的同源性达到75%，而动物与植物间的同源性还不足30%，此类基因在鳞被发育中的作用未见报道。我们的上述实验证明该基因在鳞被的其实过程中特异表达，是一种新的鳞被发育相关因子。该基因的克隆扩大了鱼类鳞被研究的基因资源，为运用基因工程技术提高鱼类育种尤其是哺乳动物毛发、汗腺等的研究，提供了更加丰富的优良候选基因。
【权利要求】
1.一种鱼类鳞被相关基因，其特征在于，具有SEQ N0.1所示的核苷酸序列。
【文档编号】C12N15/12GK104342443SQ201310317669
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月25日 优先权日:2013年7月25日
【发明者】蒋丽, 程安达, 王阳阳, 张保勇 申请人:中国水产科学研究院