利用原生质体转化构建黑根霉cpr基因工程菌的方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用原生质体转化技术对黑根霉（Rhizopus?nigericans）进行外源基因的遗传转化方法：利用真菌细胞壁降解酶对黑根霉（Rhizopus?nigericans）的细胞壁进行处理，得到原生质体并进行纯化，以潮霉素B作为选择标记，首次将来自米根霉NADPH-细胞色素P450还原酶CYPOR（缩写：CPR基因）基因采用原生质体转化方法导入黑根霉中，获得工程菌。本发明的有益效果体现在：可以用于黑根霉的分子生物学研究，如研究该菌P450酶系基因对甾体化合物羟化作用的分子机制等；可以用来对黑根霉实施基因工程从而进行遗传改良育种，提高黑根霉对甾体底物羟化转化率。
【专利说明】利用原生质体转化构建黑根霉CPR基因工程菌的方法
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用原生质体转化构建黑根霉CPR基因工程菌的方法。
(二)【背景技术】
[0002]黑根霉(Rhizopus nigricans)对留体具有Cll α -羟基化反应能力。羟基化生物转化反应通常是Ρ450酶系介导的，细胞色素Ρ450氧化还原酶(NADPH-cytochromeP450reductase, CPR，E.C.1.6.2.4)能将电子从NADPH传递到细胞色素P450、细胞色素C、细胞色素b5以及血红素氧化酶等血红素蛋白。
[0003]目前，改进生物转化体系的方法大体可归纳为三类:增加底物溶解性，解除底物(产物)抑制，改变细胞膜(细胞壁)通透性，已遇到一程度上的瓶颈。随着分子技术水平的发展，将P450单加氧酶(CYP)和P450还原酶(CPR)基因在酵母或大肠杆菌等模式菌株中进行克隆表达，在转录水平调控、酶活分析、药物代谢等方面不断迈向新的领域。但关于构建黑根霉CPR基因工程菌并应用于留体羟化转化上的应用未见报道。
[0004]自 1973年首先在粗糙脉胞菌建立DNA转化系统，1983年建立构巢曲霉DNA转化系统以来，迄今已在30多种丝状真菌中建立了 DNA转化系统。丝状真菌遗传转化方法包括电击转化法、基因枪转化法、农杆菌介导转化法、原生质体转化法、醋酸锂转化法等。并已成功应用于赤霉菌、毛霉、绿色木霉等丝状真菌中。但尚未有采用原生质体转化法应用于黑根霉的报道。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种利用PEG-CaCl2介导原生质体转化技术构建黑根霉CPR基因工程菌的遗传转化方法，并找到转化效率高的转化参数组合，可用于黑根霉工程菌育种以及分子生物学研究等领域，并为其他丝状真菌遗传转化提供借鉴。
[0006]本发明采用的技术方案是:
[0007]—种利用原生质体转化构建黑根霉CPR基因工程菌的方法，所述方法包括:
[0008](I)从米根霉克隆得到其CPR基因，克隆至质粒pCB1004_pgpd，得
[0009]到表达质粒pCB1004-pgpd_CPR ；
[0010]具体步骤如下:根据NCBI数据库上所报道的米根霉CPR基因序列设计引物，并根据pCB1004-pgpd质粒上的MCS序列选出适合的酶切位点，然后提取米根霉总RNA，利用RT-PCR扩增得到CPR目的基因片段；经过T-A克隆，得到重组子经测序正确后，用限制性内切酶酶切得到目的片段并将其克隆至pCB1004-pgpd上MCS上相应的酶切位点，转化至大肠杆菌得到重组子并测序；测序正确后，从大肠杆菌中提取pCB1004-pgpd-CPR质粒，备用。
[0011]目前真菌绝大多数用潮霉素筛选，所述的pCB1004-pgpd质粒上的潮霉素(hygromycin)抗性基因(hph)由 Aspergillus nidulans 的 ptrpC 启动子调控,MCS 序列上游由强启动子pgpd A调控；
[0012](2)将黑根霉孢子原生质体用lmol/L的山梨醇溶液悬浮，调节原生[0013]质体浓度为IO7~IO8个/mL，得到原生质体溶液；所述山梨醇溶液组成如下:lmol/L山梨醇，10mmol/L Tris-Cl，CaCl250mmol/L，溶剂为水，pH7.0 ;所述米根霉和黑根霉采用常规市购菌株即可；
[0014](3)将构建的表达质粒pCB1004-pgpd_CPR经限制性内切酶酶切，酶切产物纯化后溶于无菌去离子水至浓度为10~15 μ g/mL，得到线性化质粒溶液；
[0015](4)每100 μ L原生质体溶液加入10 μ L线性化质粒溶液，并加入I~2μ L步骤(3)所述限制性内切酶，混匀，冰浴30min后，加入20~50 μ L的PEG4000_CaCl2溶液，冰浴10~20min ;再加入400~800 μ L的PEG4000_CaCl2溶液，室温静置10~15min ；所述 PEG4000-CaCl2 溶液终浓度组成如下:PEG400060%，CaCl250mmol/L, lmol/L 山梨醇，Tris-Cl 10mmol/L, ρΗ7.0，溶剂为水；
[0016](5)步骤(4)转化液转移至IOmL MYG液体再生培养基，28°C、80rpm，培养12h后，离心，用无菌去离子水洗涤， 获得菌悬液涂布于含有150 μ g/mL潮霉素B的MYG固体平板，28°C培养；
[0017](6)待固体平板上长出菌丝后，转接到含有150 μ g/mL潮霉素B的MYG固体平板上；转化子在潮霉素B浓度200 μ g/mL的MYG固体平板上继代培养，提取转化子基因组，进行PCR确定目的基因片段是否整合到黑根霉基因组中，鉴定正确后保存。
[0018]所述MYG液体再生培养基组成如下:麦芽糖5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L溶剂为水；所述MYG固体平板组成如下:麦芽糖5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水。
[0019]用于潮霉素B对黑根霉最小抑制浓度测试方法如下:
[0020]将潮霉素B溶液(50mg/mL)加入MYG液体培养基，使终浓度分别为50，100，150，200，250 μ g/mL,并倒平板。取长有黑根霉菌丝的琼脂块接种于抗性平板上，于30°C恒温培养，观察其生长情况，确定潮霉素B的最低抑制浓度。所述MYG液体培养基终浓度为:麦芽糖5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，溶剂为水；
[0021]所述黑根霉孢子原生质体溶液可按如下方法制得:
[0022](I)收集黑根霉菌丝，用无菌去离子水洗涤2次后，再用酶解液洗涤2次，得湿菌体；所述酶解液组成如下:0.5mol/L MgSO4, 50mmol/L DL-Maleate aicd (CP),溶剂为水；
[0023](2)每Iml细胞壁降解酶液加入0.5~1.0g湿菌体，置30°C水浴锅，每20min轻轻摇匀，酶解游离原生质体3~4h，得到原生质体酶解液；细胞壁降解酶液按如下组成配制:Iywallzyme (广东微生物研究所)和Yatalase (Takara)质量比为5:7的混合酶溶解于无菌的 0.5mol/L MgS04、50mmol/L DL-Maleate aicd 溶液中，制成终浓度为 50mg/mL 的细胞壁降解酶液；
[0024](3)将原生质体酶解液用lmol/L山梨醇溶液稀释，过滤除去菌丝残片，5000r/min离心lOmin，得原生质体沉淀，用lmol/L山梨醇溶液悬浮，调节原生质体浓度为IO7~IO8个/mL，得原生质体溶液。
[0025]本发明中，所述CPR基因序列如下:
[0026]ATGACTCGAAACAACTCTCATCATCTGCTTGACACAGTCGATTTGATACTGCTAGGTACCATTGGCCTTGGTACAGTTGCTTGGTTTGCTA GACATCAAATAGCCAATCGACTTTTCAAATCTGATTCTACCAATAAATCTGAAGTTAAGGATGAGGCAAAGACCCCTAAACAAGAACGTAACTTTGTTAAAGTGATGCAGCAACAGGGTCGTCGAGTCATCTTCTTTTATGGTTCTCAGACAGGTACAGCCGAAGACTTTGCTTCTCGTCTTGCAAAAGAATGTACACAAAAATATGGTGTGAGCGCAATGACTGCTGATATTGAACAATATGATTTGAGCTACCTTGATTCAGTTCCCGAAGACTCTTTGGTGTTCTTTATTATGGCAACCTATGGTGAAGGTGAACCTACTGATAACGCTGTTGATTTTTGGGACTTGTTAGCAGAAGAGGTACCTGAGTTCTCTAATGATGATGGTGAGGGAAAGCCATTGCAAAAACTTCGTTATGTAGCCTTTGGTCTTGGTAACAAAACTTATGAGCATTACAATGAGGTCATTAGAAAAGTAGATAACCGTTTACTTTCTTTGGGTGCAAAGAGAATCGGCGAAAGAGGAGAAGGTGATGATGATGGTACACTTGAAGAAGATTTCTTGGCTTGGCAAGAAGAGATGTGGCCTGCTTTTTGTGAAGCTCTTGGTGTAGATGAAAGCAATGCTCACTCTGGACCACGCCAAGCTATTTTCAAAATCGAAGAACTGACTGCATATGACCAAGCAAAGGTCTACCTTGGTGAAATAGGAGAATGGCTTAAGGAAGGAGCCTCTATTGTTTATGATGCTAAACGTCCTTACAATGCACCTATTACTTCAAAGGACATTTTCAAAGCAGGCGATAGACATTGTCTTCATCTTGAAATTGATATTTCTAATACAAACTTGTCTTATCAAACTGGTGACCATGTTGCTATTTGGCCAACAAACAATGAAGTCGAAGTCAACCGTCTTGCTAAACTTCTTGGATTACAAAATAAGTTGGATACAGTCATTCACGTACAATCACTTGACCCTGCTGCTTCCAAAAAATATCCTTTCCCAGTTCCTACAACCTATCGAGCTGTATTCCGTCATTACCTTGACATTTGTTCTGCAGTTCCCCGTCAAGTC TTGATGTCATTGATTGAATATGCTCCTACTGAAGCCTCCAAAGAAGCTCTTAGAAAACTTGCTACTGATAAAGATGAATATCGTGTTCATGTAGGTGATGTCACTCGTAACTTGGGTGAGGTATTACAAATGTTGGCAGAGAGTGAATCTTTGGAGTTAGATGGTGCATTTTCCTCAGTTCCTTTCGATTTAGTTATTGAAAGCATCTCACGTCTTCAACCTCGCTACTACTCCATTTCTTCATCATCAAAAGAAAATCCCAAAAAGATTGCCGTTACTGCAGTCACTCTTCAATACACTCCAGAGCACGGATCTCCTCGTACAGTCTATGGTGTTAATACCAACTATCTTTGGCGTGTTCATGAAGCAGTCAATAACTTAACTCCTAATAGTGTGATCCCTGAATATAACTTGACAGGACCACGTGATTCATTGTTTAGCCAGCAAGGCAAAGTTGCTCGTATTCCTGTTCATGTCCGTCGTTCTCAATTCAAATTGCCTAGAAATCCTACTGTGCCTGTTATCATGATCGGTCCTGGTACTGGTGTTGCACCATTCCGTGGATTTGTTAGAGAACGCGCACTTCAAAAGAAGGAAAATAAACCAGTGGGGCCTACTATCCTCTTCTTTGGTTGTCGTAATAGAGCAGAAGATTTCCTTTATGAAGAAGAATGGCCAGAGTTATTTGAAGTCTTGGGAGGTGATTCTCGTATCATCACAGCATTTTCACGTGAAACTGAAAAAAAGGTTTATGTACAACACCGCTTAATGGAAAATGGCCAAGAGATGTGGAATTTATTGGAAAAGGGCGCTTACGTTTATGTTTGTGGAGATGCAAAGAACATGGCTCGTGATGTTAATCAAACATTTGTACGCTTTGCACAACAGTTTGGCGGAATGGACGAAAATCGATCTCAGGATTACGTGAAGAATTTGAGAAATACGGGTAGATACCAAGAAGATGTTTGGAGTTAA
[0027]所述黑根霉菌丝获得方法如下:
[0028]a.在PDA培养基平板上对`黑根霉进行菌种活化，培养温度28~30°C，所述的PDA培养基终浓度为:马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L，溶剂为水，pH自然；
[0029]b.在PDA斜面上培养3~5天后，用无菌水洗下黑根霉孢子，玻璃珠打散并用无菌纱布过滤制成孢子悬液后接种至MYG液体培养基，至于28~30°C下静置培养14~16h，收集得到黑根霉菌丝。
[0030]本发明的有益效果主要体现在:本发明首次利用原生质体转化法将构建好的含有米根霉CPR基因的pCB1004-pgpd质粒转化至黑根霉，找到了合适的转化参数并优化了参数组合，构建了适用于黑根霉遗传转化系统，可以用于黑根霉的分子生物学研究，如研究该菌对甾体化合物代谢的分子机制以及该菌的生长发育机制等；可以用来对黑根霉实施其他基因工程从而进行遗传改良育种。
(四)【具体实施方式】[0031]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0032]实施例1:利用原生质体转化法对黑根霉进行外源基因pCB1004-pgpd_CPR的遗传转化
[0033]利用
【发明内容】
中所述的方法，将含有CPR目的基因的外源质粒pCB1004-pgpd-CPR导入了黑根霉，通过潮霉素筛选得到稳定转化的工程菌并应用于留体化合物的羟化转化。具体方法如下:
[0034]1、真菌表达质粒构建
[0035]I)根据geneBank上的黑根霉CPR基因序列设计引物:
[0036]CPR-F: 5，-GGATCCATGACTCGAAACAACTCTCATC-3，(下划线为 BamH I 酶切位点)；
[0037]CPR-R:5，-AAGCTTTTAACTCCAAACATCTTCTTGG-3，(下划线为 Hind III 酶切位点)
[0038]按照Takara RNAiso Plus试剂盒说明书提取米根霉(CICC40467)总RNA，然后用PrimeScript RT-PCR Kit反转录得到cDNA。以反转录扩增出的cDNA为模板，CPR-F/CPR-R为引物PCR扩增CPR基因。
[0039]PCR 体系:10XPCR buffer (Takara)5.0 μ L, d NTPs2.0 μ L (IOmM), CPR-F1.0 μ L(IOOmM), CPR-R1.Ομ L (lOOmM)，cDNA 模板 5.0 μ L，TaKaRa Ex Taq HS0.25 μ L (5u/uL),RNase Free dH20 补充至 25yL。
[0040]PCR 程序:94°C预变性 2min ;94°C变性 40s，60°C退火 30s，55°C退火 30s70°C延伸2min (35次循环);72°C延伸5min。经T-A克隆得到重组载体pMD19_T_CPR，转化E.coliDH5a。
[0041]2)分别用 BamH I 和 Hind III 对 pMD19_T_CPR 和质粒 pCB1004_pgpd (质粒由浙江工业大学朱廷恒博士惠赠)双酶切，将获得纯化后的目的基因CPR与质粒pCB1004-pgpd大片段连接，连接产物转化E.coli至DH5 α，涂布于含50 μ g/mL氯霉素抗性的LB平板，筛选含表达质粒pCB1004-pgpd-CPR的转化子。以特异性引物CPR-F/CPR-R进行菌落PCR鉴定后提取质粒，在分别以BamH I和Hind III进行酶切鉴定得到正确结果后，测序。
[0042]测序结果如下:
[0043]真菌表达质粒目的条带CPR测序结果比对:
[0044]自带引物测序结果:
[0045]CPR 引物:
[0046]上游(5’ -3，):GGATCCATGACTCGAAACAACTCTCATC
[0047]Bam HI
[0048]下游(5，-3，):AAGCTTTTAACTCCAAACATCTTCTTGG
[0049]Hind III
[0050]686bp
[0051]AGGGTCGTCGAGTCATCTTCTTTTATGGTTCTCAGACAGGTACAGCCGAAGACTTTGCTT
[0052]I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
[0053]AGGGTCGTCGAGTCATCTTCTTTTATGGTTCTCAGACAGGTACAGCCGAAGACTTTGCTT
[0054]CTCGTCTTGCAAAAGAATGTACACAAAAATATGGTGTGAGCGCAATGACTGCTGATATTG
[0055]I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
【权利要求】
1.一种利用原生质体转化构建黑根霉CPR基因工程菌的方法，所述方法包括: Cl)从米根霉克隆得到其CPR基因，克隆至质粒pCB1004-pgpd，得到表达质粒pCB1004-pgpd-CPR ； (2)将黑根霉孢子原生质体用lmol/L的山梨醇溶液悬浮，调节原生质体浓度为IO7~IO8个/mL,得到原生质体溶液；所述山梨醇溶液组成如下:lmol/L山梨醇，10mmol/LTris-Cl, 50mmol/L CaCl2，溶剂为水，ρΗ7.0 ； (3)将构建的表达质粒pCB1004-pgpd-CPR经限制性内切酶酶切，酶切产物纯化后溶于无菌去离子水至浓度为10~15 μ g/mL，得到线性化质粒溶液； (4)每100μL原生质体溶液加入10μ L线性化质粒溶液，并加入I~2μ L步骤(3)所述限制性内切酶，混匀，冰浴30min后，加入20~50 μ L的PEG4000_CaCl2溶液，冰浴10~20min ;再加入400~800 μ L的PEG4000_CaCl2溶液，室温静置10~15min ;所述 PEG4000_CaCl2 溶液组成如下:PEG400060%，CaCl250mmol/L,山梨醇 lmol/L，Tris-Cl 10mmol/L，溶剂为水，ρΗ7.0 ； (5)步骤(4)转化液转移至IOmLMYG液体再生培养基，28°C、80rpm，培养12h后，离心，用无菌去离子水洗涤，获得菌悬液涂布于含有150 μ g/mL潮霉素B的MYG固体平板，28°C培养; (6)待平板上长出菌丝后，转接到含有150μ g/mL潮霉素B的MYG固体平板上；转化子在潮霉素B浓度200 μ g/mL的MYG固体平板上继代培养，提取转化子基因组，进行PCR确定目的基因片段是否整合到黑根霉基因组中，鉴定正确后保存。
2.如权利要求1所述的方法 ，其特征在于所述黑根霉孢子原生质体溶液按如下方法制得: (1)收集黑根霉菌丝，用无菌去离子水洗涤2次后，再用酶解液洗涤2次，得湿菌体；所述酶解液组成如下:0.5mol/L MgSO4, 50mmol/L DL-Maleate aicd,溶剂为水； (2)每Iml细胞壁降解酶液加入0.5~1.0g湿菌体，置30°C水浴锅，每20min轻轻摇匀，酶解游离原生质体3~4h，得到原生质体酶解液；细胞壁降解酶液按如下组成配制:Iywallzyme和Yatalase质量比为5:7的混合酶溶解于无菌的0.5mol/L MgS04、50mmol/LDL-Maleate aicd溶液中，制成终浓度为50mg/mL的细胞壁降解酶液； (3)将原生质体酶解液用lmol/L山梨醇溶液稀释，过滤除去菌丝残片，5000r/min离心lOmin，得原生质体沉淀，用lmol/L山梨醇溶液悬浮，调节原生质体浓度为IO7~IO8个/mL，得原生质体溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述CPR基因序列如下:
ATGACTCGAAACAACTCTCATCATCTGCTTGACACAGTCGATTTGATACTGCTAGGTACCATTGGCCTTGGTACAGTTGCTTGGTTTGCTAGACATCAAATAGCCAATCGACTTTTCAAATCTGATTCTACCAATAAATCTGAAGTTAAGGATGAGGCAAAGACCCCTAAACAAGAACGTAACTTTGTTAAAGTGATGCAGCAACAGGGTCGTCGAGTCATCTTCTTTTATGGTTCTCAGACAGGTACAGCCGAAGACTTTGCTTCTCGTCTTGCAAAAGAATGTACACAAAAATATGGTGTGAGCGCAATGACTGCTGATATTGAACAATATGATTTGAGCTACCTTGATTCAGTTCCCGAAGACTCTTTGGTGTTCTTTATTATGGCAACCTATGGTGAAGGTGAACCTACTGATAACGCTGTTGATTTTTGGGACTTGTTAGCAGAAGAGGTACCTGAGTTCTCTAATGATGATGGTGAGGGAAAGCCATTGCAAAAACTTCGTTATGTAGCCTTTGGTCTTGGTAACAAAACTTATGAGCATTACAATGAGGTCATTAGAAAAGTAGATAACCGTTTACTTTCTTTGGGTGCAAAGAGAATCGGCGA
【文档编号】C12N15/80GK103695455SQ201310316876
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年7月24日 优先权日:2013年7月24日
【发明者】陈小龙, 顾光志, 朱廷恒, 嘉晓勤, 范永仙, 沈寅初 申请人:浙江工业大学, 台州仙琚药业有限公司