新型PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白及其制备方法，该新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白穿透细胞膜的效率非常高，从而使原本不能通过细胞膜的Cu，Zn-SOD转导至细胞膜发挥生物学功能，大大提高了SOD催化超氧化物阴离子自由基(O2-·)发生歧化反应的效率，使细胞免受O2-·的氧化损伤；同时PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白利用具有高穿膜作用的PTD4提高Cu，Zn-SOD穿透细胞膜的方法简单、高效、安全，不仅不会影响Cu，Zn-SOD的生物活性，而且融合蛋白可以优化天然蛋白结构、产生新的功能，和天然蛋白相比具有很多优越性。
【专利说明】新型PTD4-Cu, Zn-SOD融合蛋白及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种融合蛋白，具体涉及一种新型PTD4-CU, Zn-SOD融合蛋白；本发明还涉及这种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]氧自由基是细胞正常代谢过程中产生的副产物，正常情况下，氧自由基的产生和清除基本平衡，当机体氧自由基生成明显增多或抗氧化系统功能障碍时，堆积在体内的大量氧自由基会攻击机体，造成氧化应激反应。超氧化物歧化酶(SOD)能够催化超氧化物阴离子自由基(02_.)发生歧化反应，从而有效地清除02_，使细胞免受02_.的氧化损伤。但由于自由基的产生和作用主要是在胞内进行的，任何外源的抗氧化剂都需要首先进入细胞，才能发挥其作用。所以SOD必须进入细胞内甚至是线粒体内才能起到抗氧化损伤的作用。然而SOD分子没有特异性受体，很难直接穿过细胞膜，其临床作用受到很大的限制。HIV-1编码的反式激活蛋白(TAT)中的蛋白转导结构域(PTD)是一种能够把生理状态下不能进入细胞发挥生物学效应的物质带入细胞内的载体工具。现已证明PTD与其他蛋白融合表达，可以使生物大分子以非受体依赖方式进入细胞，且具有转导蛋白广谱以及外源蛋白质生物活性不受影响等优点。然而现有PTD存在转导效率相对低下和潜在的细胞毒性等缺陷。针对此问题，现研究发现了一种新型的蛋白转导结构域PTD4，其通过化学合成法把其中的3个精氨酸、2个赖氨 酸和I个甘氨酸均用丙氨酸(Ala)替换，使其a-螺旋结构更加稳定，核心序列是YARAAARQARA，PTD4肽在二级结构上是一个双亲结构，双亲结构的亲水部分有利于精氨酸中带正电荷的胍基和细胞表面结合，其疏水部分更有利于穿透细胞膜，被证明具有高于TAT-PTD 32倍的转运蛋白质进入细胞内的效率。同时现有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白制备方法并不成熟和完善，融合基因的构建、蛋白的分离及纯化工艺过程复杂，尤其是诱导融合蛋白大量表达的条件众说纷纭，并没有摸索清楚。
【发明内容】
[0003]本发明的主要目的是提供一种新型PTD4-CU，Zn-SOD融合蛋白，利用PTD4的高穿膜功能和低细胞毒性将原本不能通过细胞膜的Cu，Zn-SOD转导至细胞膜发挥生物学功能，解决现有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白存在的转导效率相对低下以及潜在的细胞毒性问题。
[0004]本发明的另一个目的是提供所述新型PTD4-CU，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，解决现有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白制备方法融合基因的构建、蛋白的分离和纯化工艺过程复杂以及诱导融合蛋白表达量少的缺陷。
[0005]本发明构建PTD4-Cu，Zn-SOD重组基因，该重组基因由PTD4基因、Cu，Zn-SOD基因设计合成。
[0006]PTD4基因 序列如SEQID NO:1所示，具体序列如下:
[0007]tatgcgcgtg cggcagcgcg tcaggctcgt gcc33
[0008]Cu，Zn-SOD基因序列如SEQID NO:2所示，具体序列如下:
【权利要求】
1.一种新型PTD4-CU，Zn-SOD融合蛋白，其特征在于，编码该融合蛋白的基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括有以下步骤: 1)分别设计Cu，Zn-SOD特异性引物和PTD4寡核苷酸序列； 2)通过PCR反应扩增Cu，Zn-SODcDNA片段； 3)PCR反应产物和pET16b载体分别经双酶切、胶回收后进行连接反应； 4)连接产物转化到DHlOB大肠杆菌并提取质粒，经酶切、测序鉴定命名为pET16b-Cu，Zn-SOD 质粒； 5)将PTD4两条寡核苷酸链煮沸复性； 6)分别双酶切pET16b-Cu，Zn-SOD质粒和煮沸复性的PTD4两条寡核苷酸链，胶回收后进行连接反应，连接产物转化到DHlOB大肠杆菌并提取质粒，经酶切、测序鉴定命名为pET16b-PTD4-Cu, Zn-SOD 质粒； 7)将pET16b-PTD4-Cu，Zn-SOD重组质粒转化到E.coli BL21 (DE3)大肠杆菌中，然后加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行摇床振荡培养，诱导PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白表达； 8)取经溶菌酶加超声裂解法处理诱导表达后菌体的上清溶液，利用N1-NTA亲和层析柱在天然条件下，依次加入咪唑结合缓冲液、咪唑漂洗缓冲液缓和咪唑洗脱缓冲液，纯化PTD4-Cu, Zn-SOD 融合蛋白。
3.如权利要求2所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述Cu，Zn-SOD特异性引物包括如SEQ ID NO:4所示的上游引物以及如SEQ ID Ν0:5所示的下游引物，其中上游引物5'端加有Xho I限制性内切酶位点，下游引物5'端加有BamHI限制性内切酶切位点，且含终止密码子ΤΤΑ。
4.如权利要求2所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白，其特征在于，所述PTD4寡核苷酸序列包括如SEQ ID NO:6所示的正链以及如SEQ ID NO:7所示的负链，其中正链的 端加有Nde I限制性内切酶位点，且含起始密码子ATG，负链的5'端加有Xho I限制性内切酶位点。
5.如权利要求3所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述经PCR反应扩增的Cu，Zn-SOD cDNA片段和pET16b载体分别经Xho I和BamH I限制性内切酶切位点进行双酶切。
6.如权利要求4所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述pET16b-Cu，Zn-SOD质粒和煮沸复性的PTD4两条寡核苷酸链分别经Nde I和Xho I两个限制性内切酶位点进行双酶切。
7.如权利要求5或6所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述pET16b-PTD4-Cu，Zn-SOD重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达时，摇床震荡频率为160-220rpm/min、温度20-37°C, IPTG终浓度为0.2-1.0mM，诱导时间1-6小时。
8.如权利要求7所 述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述结合缓冲液咪唑浓度为10mM，漂洗缓冲液咪唑浓度为20mM，洗脱缓冲液咪唑浓度为50_500mM。
【文档编号】C12N15/70GK103789278SQ201310317554
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年7月26日 优先权日:2013年7月26日
【发明者】薛荣亮, 党莎杰 申请人:薛荣亮