利用确定的细胞因子组合促进成纤维细胞转分化为脂肪细胞的制作方法
【专利摘要】本发明公开了利用确定的细胞因子组合促进成纤维细胞转分化为脂肪细胞。组合物的起效因子为表皮生长因子、肝细胞生长因子、地塞米松、胰岛素和PPARγ激动剂。本发明探索出了用于诱导非脂肪前体细胞的成纤维细胞转分化为脂肪细胞的细胞因子组合，为了研究脂肪细胞分化提供了新的平台，表明体内的脂肪细胞来源可能不仅有脂肪前体细胞。本发明方法诱导过程简单，可以有效地将成纤维细胞诱导为脂肪细胞。
【专利说明】利用确定的细胞因子组合促进成纤维细胞转分化为脂肪细胞
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞转分化诱导细胞因子组合物及细胞转分化的培养方法，特别促进成纤维细胞转分化为脂肪细胞确定的细胞因子组合物以及使用该组合物促进成纤维细胞转分化为脂肪细胞培养方法。
【背景技术】
[0002]肥胖发生的原因是当体内能量失衡，摄入的能量大于消耗的能量时，过多的能量主要以脂肪的形式储存起来，脂肪的重量增加从而导致肥胖的发生。脂肪主要储存在机体的脂肪组织内，脂肪组织的增多主要表现为脂肪细胞的体积变大和脂肪细胞数目的增加。但是脂肪细胞的体积是有一定限度的，不可能无限的变大，所以过多的能量储存主要是依靠更多的新生的脂肪细胞。因此，脂肪细胞的分化便成为抑制肥胖的主要关注热点。
[0003]小鼠的3T3-L1细胞系是目前运用最广泛的脂肪细胞分化研究体系，公认的脂肪前体细胞系。在成脂因子IBMX，DEX和Insulin刺激下，绝大多数细胞都能够被诱导分化为脂肪细胞。根据多年的研究，过氧化物酶体增生物激活受体Y (PPARy)是最关键的脂肪细胞分化转录因子，PPARY的敲除小鼠是胚胎致死的，由脂肪组织的缺陷造成。此外，脂肪前体细胞只需添加PPAR Y的配体也可促进其分化为脂肪细胞。CCAAT/增强子结合蛋白家族(C/EBPs)也在脂肪细胞分化中起着重要作用。C/ΕΒΡβ和C/ΕΒΡδ在分化早期能够促进PPARy的表达，而C/ΕΒΡα能够维持PPAR Y的表达。C/EBP a和PPAR Y —起可以直接激活许多脂肪细胞分化后的相关基因。近些年，除了 C/EBPa和PPARy外，还有很多其他的促进脂肪细胞分化的转录激活因子被发现，像CREB，SREBP等等。
[0004]通常认为脂肪细胞是由脂肪前体细胞分化而来，脂肪前体细胞也被认为主要存在于脂肪组织的组织干细胞微环境中，当需要新的脂肪细胞生成时，这些脂肪前体细胞便会分化为脂肪细胞，如同肌肉前体细胞，肝脏前体细胞等存在于肌肉和肝脏中。但是脂肪前体细胞的标志基因到目前为止尚未有定论，因此也一直无法完美的从体内分离出真正的脂肪前体细胞进行研究。此外，在正常动物和人类的机体内，脂肪组织主要存在于腹腔内和腹部的皮下内。但是肥胖发生后，机体各个部位都会出现脂肪组织，肾脏周围，肠系膜周围，各个部位的皮下内等等，同时腹腔内的脂肪组织也会急剧增重。这些证据说明可能分化为脂肪细胞的细胞可能不仅有脂肪前体细胞，在一些特定条件下，一些非脂肪前体细胞的成纤维细胞也能够分化为脂肪细胞。
[0005]通过将非脂肪前体细胞，如成纤维细胞转分化为脂肪细胞，可以更为清楚地了解脂肪细胞的转分化机制，进而指导抑制肥胖药物的开发。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于本发明所采取的技术方案是: 一种促进细胞转分化的组合物，其起效因子为A、B、C、D和E，其在培养液中的终浓度分别为:
A:表皮生长因子，终浓度10?30ng/ml ；
B:肝细胞生长因子，终浓度10?30ng/ml ；
C:地塞米松，终浓度100?200nM ；
D:胰岛素，I?10 μ g/ml ；
E:PPAR Y激动剂，终浓度为0.5?2 μ M。
[0007]作为本发明的进一步改进，Α、Β、C、D、E在培养液中的终浓度分别为:
A:表皮生长因子，终浓度20?30ng/ml ；
B:肝细胞生长因子，终浓度20?30ng/ml ；
C:地塞米松，终浓度150?200nM ；
D:胰岛素,5?10 μ g/ml ；
E:PPAR Y激动剂，终浓度为I?2 μ M。
[0008]PPARy激动剂选自噻唑烷二酮类药物，特别的，噻唑烷二酮类药物选自环格列酮、恩格列酮和曲格列酮、吡格列酮、罗格列酮、法格列酮、达格列酮。
[0009]一种成纤维细胞转分化诱导培养液，培养液中添加有上述的组合物。
[0010]一种将成纤维细胞转分化为脂肪细胞的培养方法，包括如下步骤:
1)分离成纤维细胞并培养在培养液中；
2)在培养液中加入上述的组合物，
3)继续培养，得到脂肪细胞。
[0011]本发明的有益效果是:
本发明探索出了用于诱导非脂肪前体细胞的成纤维细胞转分化为脂肪细胞的细胞因子组合，为了研究脂肪细胞分化提供了新的平台，表明体内的脂肪细胞来源可能不仅有脂肪前体细胞。
[0012]本发明方法诱导过程简单，可以有效地将成纤维细胞诱导为脂肪细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是转分化后的脂肪细胞图；
图2是小鼠鼠尾成纤维细胞转分化为脂肪细胞的试验结果；
图3是最低和最高细胞因子浓度的细胞诱导结果图。
【具体实施方式】
[0014]一种促进细胞转分化的组合物，其起效因子为A、B、C、D和E，其在培养液中的终浓度分别为:
A:表皮生长因子，用于激活细胞的STAT5信号通路，终浓度10?30ng/ml ；
B:肝细胞生长因子，用于激活细胞的STAT5信号通路，终浓度10?30ng/ml ；
C:地塞米松，用于C/EBP δ的表达，终浓度100?200ηΜ ；
D:胰岛素，加速脂滴的形成，I?10 μ g/ml ；
E:PPAR Y激动剂，终浓度为0.5?2 μ M。
[0015]下面结实施例及试验数据，进一步说明本发明。
[0016]本发明选用的NIH-3T3细胞系购自美国ATCC公司。
[0017]以下实施例中所用培养基配方如下:
1)细胞生长培养基
高糖DMEM培养基(Hyclone)添加胎牛血清(终浓度为10 % v/v)和双抗(青霉素和链霉素(Gibco)),双抗浓度为(1% ν/ν) ο
[0018]_
2)诱导培养基
添加了细胞转分化促进因子的细胞生长培养基；
3)油红储存液
0.7g油红染料，200mL异丙醇，震荡过夜，使用0.2 μ m过滤器过滤，4°C保存备用。
[0019]脂肪细胞的形态鉴定-油红染色
油红工作液:油红储存液和水以6:4的比例混合,然后再室温下静置20分钟后用0.22Mm滤膜过滤。
[0020]I)将分化后的细胞从培养箱中取出，移除全部的细胞培养液；
2)加入500μ1的10%的福尔马林，在室温下放置5分钟；
3)移除10%的福尔马林，加入500μ1新鲜的福尔马林，在室温下至少孵育I个小时；
4)移除福尔马林，然后加入500μ1的60%异丙醇，移除60%异丙醇，让培养板晾干；
5)加入500μ1油红工作液，孵育10分钟；
6)移除油红工作液，立即用水洗涤，用水洗涤4次
7)移除水，完全晾干，加入100%异丙醇萃取油红，孵育10分钟或者更长；
8)将200μ1萃取后的异丙醇转移到ELISA板中，500nm读数，用于定量分析甘油三酯(TG)含量。
[0021]脂肪细胞的基因表达鉴定
RNA提取:利用Trizol法提取，具体操作如下:
1)将分化后的细胞取出，移除培养基，用PBS洗涤一次，然后加入ImlTrizol，裂解30分钟，然后转移到EP管中；
2)加入200μ I氯仿/ml Trizol,用力振荡混匀15秒，室温放置3分钟，4 °C, 12, 000g离心15分钟；
3)溶液分成三层，品分为三层:无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相，小心吸取上清至新的离心管；
4)加入500μ I异丙醇，轻轻混匀，室温放置10分钟，4 V，12，000 g离心10分钟；
5)小心去除上清，加入Iml75%乙醇(DEPC水配制)，轻轻混匀，悬浮沉淀，4 °C, 7500g离心5分钟；
6)去除上清，自然烘干5分钟左右，加入40μ I DEPC水溶解RNA沉淀；
7)取5μ I进行电泳检测提取RNA的质量，28S条带亮度是18S条带两倍的RNA是质量较好的RNA,凝胶与电泳缓冲液需新鲜配制；
8)取2 μ I 测定 RNA 浓度，RNA 的浓度=OD260 X 稀释倍数 Χ0.04 μ g/μ L，OD260nm/OD280nm在1.8?2.0视为抽提的RNA的纯度很高。
[0022]RNA逆转录:利用SuperScriptTM II RT逆转录试剂盒合成cDNA ;
荧光实时定量 PCR:采用 Takara 公司 SYBR? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)定量PCR试剂盒，根据说明进行定量PCR反应。
[0023]反应条件:
预变性:95 V 20秒；
变性:95 °C，10秒；
退火:60 °C, 20秒；
孵育:70 °C I秒；
根据基因的表达量重复38?45个循环，65?95 °C做溶解曲线，每0.5 °C读一次板，时间为I秒。
[0024]实施例1 NIH-3T3细胞的转分化 ABCDE 组:
将复苏的NIH-3T3细胞用细胞生长培养基传代培养两次，之后进行诱导分化，以24孔板培养的一孔为例，细胞生长汇聚后，培养基更换为细胞诱导培养基(0.5ml),诱导培养基中，细胞因子的终浓度如下:
A:表皮生长因子，终浓度20ng/ml ；
B:肝细胞生长因子，终浓度20ng/ml ；
C:地塞米松，终浓度10nM ；
D:胰岛素,5 μ g/ml ；
E:罗格列酮，终浓度为I μΜ;
每两天更换一次诱导培养基，培养两周。
[0025]空白对照组:
ΝΙΗ-3Τ3细胞的转分化培养条件同ABCDE组，不同之处在于其未使用细胞诱导培养基，仅使用细胞生长培养基。
[0026]MDIR 诱导组:
ΝΙΗ-3Τ3细胞的转分化培养条件同AB⑶E组，不同之处在于其诱导培养中的中添加的细胞因子如下:
培养条件为在细胞长满后的开始两天的诱导培养基是添加MDIR的生长培养基，在后面的诱导培养基更换为添加IR的生长培养基，每两天换液一次。具体浓度如下:
IBMX (isobutylmethylxanthine, M):终浓度为 0.5mM ；
地塞米松Dexamethasone (D):终浓度为Iym;
胰岛素Insulin (I):终浓度为5 μ g/ml ；
罗格列酮Rosiglitazone (R):终浓度为I μ M。
[0027]试验结果:
培养两周后，转分化的细胞照片如图1 A所示，从图中可以看出，传统的成脂因子MDIR不能促进非脂肪前体细胞的成纤维细胞分化为脂肪细胞(MIDR组)，而本发明的新的细胞因子组合可以促进非脂肪前体细胞的成纤维细胞ΝΙΗ-3Τ3分化为脂肪细胞(AB⑶E组)。如图所示，在添加诱导因子14天约有50%的细胞分化。随着诱导时间的增长，会有更多的细胞分化为脂肪细胞直至100% ； 分别检测不同培养组中细胞中PPARy和aP2 mRNA的相对表达量，结果如图1 B所示，空白对照组和MIDR诱导组中，没有检测到有PPAR Y和aP2表达，在AB⑶E组中，PPAR Y和aP2的表达量较大，说明该组中已经形成了较大量的脂肪细胞；
分别检测不同培养组中细胞中的TG含量，结果如图1 C所示，从图中可以清楚地看出，空白对照组和MIDR诱导组中几乎检测不到TG，仅有ABCDE组中的TG量较多，说明该组中已经形成了较大量的脂肪细胞。
[0028]实施例2小鼠鼠尾成纤维细胞的转分化
鼠尾细胞的分离和培养:室外取小鼠的鼠尾细胞3cm，用75%酒精浸泡30s，然后转移到添加5倍双抗的培养基中，在细胞操作台中，将鼠尾转移到培养板中，然后用手术剪把鼠尾剪碎；加入37摄氏度预热的培养基，5天后，可以看到有细胞贴壁，12天后，将细胞消化，铺板到12孔培养板中，等待细胞汇聚。
[0029]组:
鼠尾成纤维细胞的分化:诱导分化步骤和实施例1的NIH-3T3细胞完全一致，培养5周并观察。
[0030]空白对照组:培养步骤同实施例1的空白对照试验。
[0031]诱导组:诱导分化步骤同实施例1的MDIR诱导试验。
[0032]转分化的细胞照片如图2 A所示，从图中可以看出传统成脂因子MDIR不能促进原代非脂肪前体细胞的成纤维鼠尾细胞分化为脂肪细胞，而本发明的细胞因子组合可以促进其分化为脂肪细胞。在添加诱导因子35天约有30%的细胞分化为脂肪细胞。
[0033]分别检测不同培养组中细胞中PPAR Y mRNA的相对表达量，结果如图2 B所示，空白对照组和MIDR诱导组中，没有检测到有PPAR Y表达，在AB⑶E组中，PPAR Y的表达量较大，说明该组中已经形成了较大量的脂肪细胞；
分别检测不同培养组中细胞中的TG含量，结果如图2 C所示，从图中可以清楚地看出，空白对照组和MIDR诱导组中几乎检测不到TG，仅有ABCDE组中的TG量较多，说明该组中已经形成了较大量的脂肪细胞。
[0034]实施例3
将复苏的NIH-3T3细胞用细胞生长培养基传代培养两次，之后进行诱导分化，以24孔板培养的一孔为例，细胞生长汇聚后，培养基更换为细胞诱导培养基(0.5ml),诱导培养基中，细胞因子的终浓度如下:
A:表皮生长因子，终浓度10 ng/ml ；
B:肝细胞生长因子，终浓度10 ng/ml ；
C:地塞米松，终浓度100 nM ；
D:胰岛素，I μ g/ml ；
E:罗格列酮，终浓度为0.5 μΜ；
每两天更换一次诱导培养基，培养四周。
[0035]实施例4
将复苏的ΝΙΗ-3Τ3细胞用细胞生长培养基传代培养两次，之后进行诱导分化，以24孔板培养的一孔为例，细胞生长汇聚后，培养基更换为细胞诱导培养基(0.5ml),诱导培养基中，细胞因子的终浓度如下: A:表皮生长因子，终浓度30 ng/ml ；
B:肝细胞生长因子，终浓度30 ng/ml ；
C:地塞米松，终浓度200 nM ；
D:胰岛素，10 μ g/ml ；
E:罗格列酮，终浓度为2 μΜ；
每两天更换一次诱导培养基，培养两周。
[0036]实施例3和4诱导培养后的细胞照片如图3所示，从图中可以看出，两实施例中均可以诱导出脂肪细胞。高浓度的细胞因子下，诱导的速率更快；低浓度下，也可以成功地诱导出脂肪细胞。
【权利要求】
1.一种促进细胞转分化的组合物，其起效因子为A、B、C、D和E，其在培养液中的终浓度分别为: A:表皮生长因子，终浓度10?30ng/ml ； B:肝细胞生长因子，终浓度10?30ng/ml ； C:地塞米松，终浓度100?200nM ； D:胰岛素，I?10 μ g/ml ； E:PPAR Y激动剂，终浓度为0.5?2 μ M。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于:Α、B、C、D、E在培养液中的终浓度分别为: A:表皮生长因子，终浓度20?30ng/ml ； B:肝细胞生长因子，终浓度20?30ng/ml ； C:地塞米松，终浓度150?200nM ； D:胰岛素，5?10 μ g/ml ； E:PPAR Y激动剂，终浓度为I?2 μ M。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于=PPARy激动剂选自噻唑烷二酮类药物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于:噻唑烷二酮类药物选自环格列酮、恩格列酮和曲格列酮、吡格列酮、罗格列酮、法格列酮、达格列酮。
5.一种成纤维细胞转分化诱导培养液，其特征在于:所述培养液中添加有权利要求1?4任意一项所述的组合物。
6.一种将成纤维细胞转分化为脂肪细胞的培养方法，包括如下步骤: 1)分离成纤维细胞并培养在培养液中； 2)在培养液中加入权利要求1?4任意一项所述的组合物， 3)继续培养，得到脂肪细胞。
【文档编号】C12N5/077GK104342401SQ201310317410
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月25日 优先权日:2013年7月25日
【发明者】吴东海, 聂涛, 徐爱民, 李鹏 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院