抗炎蛋白tipe2在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了新型抗炎蛋白（免疫调控分子）TIPE2在制备治疗动脉粥样硬化性相关疾病的药物中的应用。本发明还公开了一种表达TIPE2的重组腺病毒。本发明利用TIPE2的重组腺病毒实现在ApoE-/-小鼠体内高效稳定持续表达TIPE2抗炎蛋白，发挥抑制动脉粥样斑块的形成作用，对以动脉粥样硬化为病理学基础的急性冠脉综合征、心绞痛、脑中风、血栓形成、血管闭塞、脑缺血等疾病起到有效的预防与治疗作用，有效改善患者的生存质量及疾病预后，为临床上有效防治动脉粥样硬化的形成及相关性疾病开辟了一条前景非常广阔的新途径，同时为以动脉粥样硬化斑块形成为病理学基础的相关疾病的新药开发提供了新的方向及依据。
【专利说明】抗炎蛋白TIPE2在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用 【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高表达新型抗炎蛋白TIPE2的重组腺病毒及其应用，特别是涉及TIPE2作为新型的防治动脉粥样硬化治疗药物的应用。
【背景技术】
[0002] 急性心肌梗死、心源性粹死等急性冠脉综合症(acute coronary syndromes, ACS)是严重危害人类生命健康的世界性疾病，且发病率逐年增高，其病理生理基础是动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)斑块的形成与破裂。动脉粥样硬化是一种病因复杂、病变发展缓慢、以局部或全身性炎症和免疫反应为特点的慢性疾病。包括单核/巨噬细胞、淋巴细胞、平滑肌细胞等在内的大量与免疫相关的细胞参与并形成了一系列免疫反应机制，破坏了免疫系统的稳态，导致动脉粥样硬化的发生【参见:1.[Peter Libby, Paul M.Ridkerand Attilio Maser1.1nflammation and Atherosclerosis.Circulation.2002;105:1135-1143.2.Guido Stoll and Martin Bendszus.1nflammation and Atherosclerosis:NovelInsights Into Plaque Formation and Destabilization.Stroke.2006;37:1923-1932.3.Goran K.Hansson.1nflammation，Atherosclerosis, and Coronary Artery Disease.NEngl J Med.2005;352:1685-1695.】。因而目前研究认为，炎症反应贯穿于动脉粥样硬化的整个病变过程，包括动脉粥样硬化斑块的形成、发展及破裂【参见LibbyP，OkamotoYj RochaVZj Folco E.1nflammation in atherosclerosis: transition from theory to practice.Circulation Journal.2010;74 (2):213 - 220.van Leuven SI，Franssen R，KasteleinJJj Levi M，Stroes ESGj Tak PP.Systemic inflammation as a risk factor foratherothrombosis.Rheumatology.2008; 47 (I): 3 - 7.】。针对免疫反应的抗炎策略是防治动脉硬化形成与发展、干预疾病转归的有效方案。
[0003]TIPE2，即肿瘤坏死因子 α 诱导蛋白 8-2 (Tumor Necrosis Factor- a InducedProtein-8-like 2，TNFAIP8L-2)，2002 年从实验性自身免疫脑脊髓炎(ExperimentalAutoimmune Encephalomyelitis, EAE)小鼠模型的异常表达基因中筛选而出，并由本申请发明人所在课题组主要研究人员、以及长期合作伙伴宾西法尼亚大学的陈有海教授实验室于2008年研究鉴定其为新型免疫负调控分子【1.Carmodyj R.J.，etal.Genomic scaleprofiling of autoimmune inflammation in the central nervous system:the nervousresponse to inf lammation[J].J Neuroimmuno1.2002，133 (1-2):95-107.2.Sun, H.，eta1.TIPE2，a negative regulator of innate and adaptive immunity that maintainsimmune homeostasis [J].Cell.2008，133(3):415-26.】。研究发现，TIPE2 属于肿瘤坏死因子 α 诱导蛋白 8 (Tumor necrosis factor- a -1nduced protein-8，TNFAIP8，ΤΙΡΕ)家族，选择性表达于胸腺、脾脏、淋巴结等淋巴组织及炎症组织，及具有分泌功能的组织细胞、泌尿生殖细胞等【参见:Zhang，G.，et al.Tissue-specific expression of TIPE2 providesinsights into its function [J].Mol Immunol.2010，47 (15): 2435-42.】。进一步研究发现，TIPE2 通过抑制 MAPK (Mitogen-activated protein kinase)和 NF-κ B (Nuclearfactor-kappa B)信号通路的活化发挥负性调控固有免疫和适应性免疫，是一个新型的抗炎蛋白[参见:Sun, H.，et al.TIPE2, a negative regulator of innate and adaptiveimmunity that maintains immune homeostasis[J].Cell.2008，133(3):415-26.】。TIPE2基因缺失在小鼠表现为渐进性多器官炎症【参见:Sun，H.，et al.TIPE2, a negativeregulator of innate and adaptive immunity that maintains immune homeostasis[J].Cell.2008, 133(3):415-26.】，在人类组织细胞内的表达异常与乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染、自身免疫性疾病有关【参见1:Xi，W.，et al.Roles of TIPE2 in Hepatitis BVirus-1nduced Hepatic Inflammation in Humans and Mice.Mol Immunol, 2011;48 (9-10):1203-1208.2:LiD.，et al.Down-regulation of TIPE2 mRNA expression in peripheralblood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus.Clinical Immunology 2009;133:422-427.】。本发明以炎症为切入点，以动物模型、细胞模型系统地研究了 TIPE2在动脉粥样硬化发生中的作用与机制，发现TIPE2通过抑制巨噬细胞介导的炎症反应发挥抗动脉粥样斑块形成作用，继而采用高表达TIPE2的重组腺病毒研究了 TIPE2对动脉斑块形成的治疗作用。 [0004]腺病毒载体应用于基因治疗的载体，具有明显的优越性:宿主范围广，不整合到宿主基因组中，无插入突变，只感染分裂期细胞，对人的安全性高；能进行有效增殖，体外扩增可以获得高滴度的重组病毒，是目前基因治疗的最佳工具。本发明经过研究证实，炎症反应贯穿于动脉粥样硬化斑块的形成、发展与破裂的整个过程，而TIPE2作为一种新型抗炎蛋白，具有抑制动脉粥样斑块形成的作用，因此本研究利用重组腺病毒实现TIPE2蛋白在体内的持续高表达表达，从而发挥抑制动脉粥样硬化斑块形成的作用。
【发明内容】
[0005]针对上述现有技术，针对炎症反应在动脉粥样硬化形成中的重要作用，本发明要解决的主要问题是提供一种能够有效抑制动脉粥样硬化斑块形成的重组腺病毒介导的TIPE2抗炎蛋白，并且进一步提供了该抗炎蛋白作为有效防治动脉粥样硬化斑块形成的治疗药物的应用。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]免疫负调控分子(抗炎蛋白)TIPE2,即TNFAIP8L2 (tumor necrosis factoralpha-1nduced protein 8_like2, GeneID:69769),其 CDS 序列[NM-027206]如下所不:
[0008]Atggctggtcggtccgtggcgcatctctttatcgacgagaccagcagcgaggtgctagacgagctttaccgcgtgtccaaagaatacacgcacagccggcccaaggcacagcgggtgatcaaagacctcatcaaggtagcggttaaagtggctgtgctgcaccgcagtggctgctttggccctggggagctggctctggctacacgatttcgtcagaagctacggcagggcgccatgaccgcacttagcttcggtgaggtggacttcacctttgaggctgccgtgctagcaggtctgctcgtcgagtgccgggacattctgctggagctggtggagcaccacctcacacccaagtcacatgaccgcatcaggcacgtgtttgatcactactctgaccccgacctgctggctgccctctatgggcctgacttcactcagcaccttggcaagatctgtgatgggctccggaagctgctggacgagggcaagctctga,如序列表中序列 I 所示。
[0009]本发明所述的TIPE2基因编码翻译的氨基酸序列[NP-081482]如下:
[0010]MesfsskslalqaekkllskmagrsvahlfidetssevldelyrvskeythsrpkaqrvikdlikvavkvavlhrsgcfgpgeIalatrfrqklrqgamtalsfgevdftfeaavlaglIvecrdi IIelvehhltpkshdrirhvfdhysdpdllaalygpdftqhlgkicdglrklIdegkl,如序列表中序列 2 所不。
[0011]构建TIPE2重组腺病毒的详细描述:
[0012]根据GeneID:69769提供的基因序列设计引物，PCR扩增TIPE2全长cDNA，两端设计BamHI和XhoI酶切位点，回收载体和目的片段，酶连获得pRK5_TIPE2质粒，测序证实连接正确(测序结果图2)。
[0013]BamHI 和 XhoI 双酶切 pRK5_TIPE2 质粒及 pShuttle_GFP_CMV 穿梭质粒(该质粒是现有技术中已有的常规质粒)，回收TIPE2目的片段及穿梭载体，酶连获得pShuttle-GFP-CMV-TIPE2质粒；之后用限制性内切酶1-Ceu I和1-Sce I双酶切pADxsi骨架质粒(该质粒是现有技术中已有的常规质粒)与pShuttle-GFP-CMV-TIPE2质粒，并将目的片段与PADxsi酶连，产物转化DH5CI进行细菌内同源重组，筛选后的阳性克隆大量扩增获得pADxs1-GFP-CMV-TIPE2重组腺病毒质粒。
[0014]PacI酶切线性化重组腺病毒质粒后，用Lipofectamine2000脂质体转染覆盖率80%左右的包装细胞HEK293细胞，3-5d后，出现明显噬斑。待大约90%的细胞出现细胞病变时，收集细胞，反复冻融3次后离心收集上清，继续感染HEK293细胞，扩增病毒，收集病毒液纯化后于液氮保存。TCID 50法测定病毒滴度【参见=Vedtofte L，Bodvarsdottir T B, Karlsen A E, et al.Developmental biology of the Psammomysobesus pancreas: cloning and expression of the Neurogenin-3 gene [J].JHistochemCytochem，2007，55(l):97 — 104.】。
[0015]上述TIPE2重组腺病毒具有双CMV启动子，可同时独立高效表达TIPE2蛋白和GFP,既可以通过检测GFP荧光强度评判TIPE2的表达情况及观察疗效，又不影响TIPE2蛋白的生物学活性。
[0016]动物实验表明，上述高表达TIPE2蛋白的重组腺病毒能够有效抑制小鼠动脉粥样硬化斑块的形成并对动脉粥样硬化起到有效治疗作用。因此，免疫调控分子TIPE2有望开发为防治动脉粥样硬化斑块形成并在斑块形成后发挥治疗作用的新药物。
[0017]上述高表达TIPE2蛋白的重组腺病毒作为其它以动脉粥样硬化斑块形成为病理学基础的心脑血管疾病的预防和治疗性药物应用，如急性冠脉综合征、心绞痛、脑中风、血栓形成、血管闭塞、脑缺血等疾病。
[0018]进一步地，本发明推广到TIPE2蛋白、由TIPE2衍生的肽等一切与TIPE2相关的产物在上述所述疾病中的应用。
[0019]药理实验及结果证明:
[0020]实验用小鼠为SPF级ApoE+，8-10周龄，体重18_22g，饲养环境严格按照SPF级执行。
[0021]治疗实验方案1.TIPE2预防ApoE+小鼠模型动脉粥样斑块形成的实验
[0022]8-10周龄的ApoE+先高脂喂养I周后，随机分为实验组和对照组:实验组每只小鼠尾静脉注射I X IO9Pfu重组TIPE2腺病毒，对照组则注射表达GPF的对照腺病毒，每间隔2周重复一次给药，连续给药4次，整个过程中均高脂喂养，即高脂喂养9周后，过量戊巴比妥钠麻醉处死小鼠，灌洗固定后分离主动脉 根部及腹主动脉。主动脉根部用于制作5 μ m冰冻切片进行HE染色、油红O染色，腹主动脉用于大体油红O染色，以检测TIPE2对动脉粥样斑块形成的抑制作用。[0023]治疗实验方案2.TIPE2重组腺病毒对已形成的ApoE+小鼠动脉粥样斑块的抑制作用
[0024]8-10周龄的ApoE+先高脂喂养I周后，0.8%戊巴比妥钠麻醉小鼠，取仰卧位固定小鼠四肢及头部，碘伏消毒后颈正中矢状切口，小心分离颌下腺，暴露出左侧颈动脉。用玻璃针小心分离附着其上的迷走神经，之后取左侧颈动脉外放置外鞘管(外鞘管以硅胶管为原料，置于75%酒精中消毒灭菌，内径0.30mm，长约3mm)，手术线扎住防止外鞘管脱落。颌下腺复位后缝合切口。小鼠于SPF级环境继续饲养，并持续高脂喂养。
[0025]构建小鼠动脉粥样硬化斑块形成模型6周(高脂喂养第7周)后，将小鼠随机分为实验组和对照组:向实验组小鼠尾静脉注射I X IO9Pfu的TIPE2重组腺病毒，对照组则注射表达GPF的对照腺病毒，并在2周后(高脂喂养第9周)加强给药一次，高脂喂养第10周处理小鼠取材:过量戊巴比妥钠处死小鼠，灌洗固定后分离左侧颈动脉、主动脉根部及腹主动脉。颈动脉及主动脉根部制作5 μπι冰冻切片进行HE染色、油红O染色，腹主动脉进行大体油红O染色以检测ΤΙΡΕ2对动脉粥样硬化的治疗效果。
[0026]利用本发明所述的高表达ΤΙΡΕ2的重组腺病毒及治疗实验方案I的结果表明:本发明所述的ΤΙΡΕ2重组腺病毒可以在小鼠体内高表达(见图7，图13)，并能有效抑制ApoE+小鼠动脉粥样硬化斑块的形成，延缓脂质在主动脉根部、主动脉弓、腹主动脉的堆积，即对斑块的形成有很好的预防效果；治疗实验方案2的结果表明:本发明所述的ΤΙΡΕ2重组腺病毒不仅可以有效预防斑块的形成，而且能够有效抑制已形成的粥样斑块的进一步发展，从而抑制血管闭塞及动脉粥样硬化的进一步恶化。因此，抗炎蛋白ΤΙΡΕ2将在制备防治临床上抑制并治疗动脉粥样硬化的药物中有重大的应用价值，具有极其广阔的开发应用前景。
[0027]本发明利用ΤΙΡΕ2的重组腺病毒实现体内持续高表达ΤΙΡΕ2抗炎蛋白，发挥抑制动脉粥样硬化斑块形成的作用(图4-图9)，同时对已形成的粥样斑块起到有效治疗作用(图10-图17)。本发明为 临床上有效防治动脉粥样硬化相关疾病开辟了一条前景非常广阔的新途径，为新型药物的开发奠定了良好的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1:质粒pRK5的物理图谱。
[0029]图2:小鼠TIPE2基因pRK5表达载体测序图谱，箭头所指为TIPE2序列。
[0030]图3:实验技术路线图。
[0031]图4:治疗实验方案I主动脉根部HE染色结果，其中A为对照组斑块，B为TIPE2治疗后的斑块。
[0032]图5:治疗实验方案I主动脉根部斑块大小统计结果分析。
[0033]图6:治疗实验方案I主动脉根部油红O染色结果，其中A为对照组斑块，B为TIPE2治疗后的斑块。
[0034]图7:治疗实验方案I主动脉根部自发荧光示TIPE2或GFP的表达，其中A为对照组GFP的表达，B为TIPE2治疗组。
[0035]图8:治疗实验方案I主动脉弓、腹主动脉大体油红O染色结果，其中A为对照组斑块，B为TIPE2治疗后的斑块。[0036]图9:治疗实验方案I主动脉弓、腹主动脉大体油红O染色结果统计分析。
[0037]图10:治疗实验方案2主动脉根部HE染色结果，其中A为对照组斑块，B为TIPE2治疗后的斑块。
[0038]图11:治疗实验方案2主动脉根部斑块大小统计结果分析。
[0039]图12:治疗实验方案2主动脉根部油红O染色结果，其中A为对照组斑块，B为TIPE2治疗后的斑块。
[0040]图13:治疗实验方案2主动脉根部自发荧光示TIPE2或GFP的表达，其中A为对照组，B为TIPE2治疗组。
[0041]图14:治疗实验方案2主动脉弓、腹主动脉大体油红O染色结果，其中A为对照组斑块，B为TIPE2治疗后的斑块。
[0042]图15:治疗实验方案2主动脉弓、腹主动脉大体油红O染色结果统计分析
[0043]图16:治疗实验方案2颈动脉HE染色结果，其中A为对照组斑块，B为TIPE2治疗后的斑块。
[0044]图17:治疗实验方案2颈动脉自发荧光情况，其中A为对照组，B为TIPE2治疗组。【具体实施方式】
[0045]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0046]实施例1:小鼠TIPE2基因pRK5表达载体构建
[0047](I)小鼠TIPE2基因CDS区获取
[0048]PCR引物设计:
[0049]根据引物设计原则，设计了小鼠TIPE2基因CDS区扩增引物，并分别在引物上下游分别加上BamHl及Xhol的酶切位点，以方便后续质粒构建。另外，在上游引物酶切位点与起始密码子ATG之间添加利于转录的Kozak’ s序列。具体引物序列如下:
[0050]mTIPE2BamHlF:5’ -ATTATTGGATCCGCCACCATGGAGTCCTTCAGCTCAAAGA-3’ ；
[0051]mTIPE2XholR: 5’ -ATTATTCTCGAGTCAGAGCTTGCCCTCGTCCAGC-3’ ；如序列表中序列 3、4所示。
[0052](2)小鼠TIPE2基因CDS区序列扩增
[0053]用2 X TaqPCRMix产品，以逆转录自C57BL/6J小鼠腹腔巨噬细胞总RNA的cDNA为模板，采用PCR扩增法获取小鼠TIPE2基因⑶S区片段，反应体系为50 μ L，如表1所示。
[0054]表1
[0055]
【权利要求】
1.抗炎蛋白TIPE2在制备治疗动脉粥样硬化性疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述动脉粥样硬化性疾病是以动脉粥样硬化斑块形成为病理学基础的心脑血管疾病。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述动脉粥样硬化性疾病包括急性冠脉综合征、心绞痛、脑中风、血栓形成、血管闭塞、脑缺血等疾病。
4.一种表达TIPE2的重组腺病毒，其特征在于:是通过以下制备方法得到的: BamH I and Xho I 双酶切 pRK5_TIPE2 质粒及 pShuttle_GFP_CMV 穿梭质粒，回收TIPE2目的片段及穿梭载体，酶连获得pShuttle-GFP-CMV-TIPE2质粒；之后用限制性内切酶1-Ceu I和1-Sce I双酶切pADxsi骨架质粒与pShuttle-GFP-CMV_TIPE2质粒，并将目的片段与PADxsi酶连，产物转化DH5 α进行细菌内同源重组，筛选后的阳性克隆大量扩增获得pADxs1-GFP-CMV-TIPE2重组腺病毒质粒； Pac I酶切线性化重组腺病毒质粒后，用Lipofectamine 2000脂质体转染覆盖率80%的包装细胞HEK293细胞，3-5d后，出现明显噬斑；待90%的细胞出现细胞病变时，收集细胞上清，反复冻融3次以后离心收集上清，继续感染HEK293细胞，扩增病毒，收集病毒液纯化后于液氮保存。
5.权利要求以4所述的表达TIPE2的重组腺病毒的制备方法，其特征在于:步骤如下: BamH I and Xho I 双酶切 pRK5_TIPE2 质粒及 pShuttle_GFP_CMV 穿梭质粒，回收TIPE2目的片段及穿梭载体，酶连获得pShuttle-GFP-CMV-TIPE2质粒；之后用限制性内切酶1-Ceu I和1-Sce I双酶切pADxsi骨架质粒与pShuttle-GFP-CMV_TIPE2质粒，并将目的片段与PADxsi酶连，产物转化DH5 α进行细菌内同源重组，筛选后的阳性克隆大量扩增获得pADxs1-GFP-CMV-TIPE2重组腺病毒质粒； Pac I酶切线性化重组腺病毒 质粒后，用Lipofectamine 2000脂质体转染覆盖率80%的包装细胞HEK 293细胞，3-5d后，出现明显噬斑；待90%的细胞出现细胞病变时，收集细胞上清，反复冻融3次以后离心收集上清，继续感染HEK 293细胞，扩增病毒，收集病毒液纯化后于液氮保存。
6.权利要求以4所述的表达TIPE2的重组腺病毒在制备预防动脉粥样硬化性疾病的药物中的应用。
7.权利要求以4所述的表达TIPE2的重组腺病毒在制备治疗动脉粥样硬化性疾病的药物中的应用。
8.权利要求以4所述的表达TIPE2的重组腺病毒在制备防治心脑血管疾病的药物中的应用。
9.以权利要求4所述的表达TIPE2的重组腺病毒为基础的TIPE2蛋白、由TIPE2衍生出的一系列肽、基因产物在制备防治心脑血管疾病的药物中的应用。
10.以权利要求4所述的表达TIPE2的重组腺病毒为基础的TIPE2蛋白、由TIPE2衍生出的一系列肽、基因产物在制备治疗以动脉粥样硬化斑块形成为病理学基础的心脑血管疾病中的应用。
【文档编号】C12N15/861GK103463620SQ201310317259
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月25日 优先权日:2013年7月25日
【发明者】刘素侠, 邵洁, 章桂忠 申请人:山东大学