一种固氮基因簇及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种固氮基因簇，包含nifB，nifH，nifD，nifK，nifE，nifN，nifX，moeB，nifV9个基因，是目前发现的较小的能够完成固氮功能的基因簇。本发明还提供了含有上述固氮基因簇基因的表达载体及含有该载体的基因工程菌，本发明的固氮基因簇可以在大肠杆菌中完成固氮过程，得到的基因工程菌具有较高的固氮能力，且能够解除铵氧对固氮影响。本发明提供的固氮基因簇可用于制备转基因农作物，提高农作物的生物固氮能力。
【专利说明】一种固氮基因簇及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地，涉及一种具有固氮能力的固氮基因簇nifBHDKENXV moeB 及其应用。
【背景技术】
[0002]氮是生物生存所必需的重要元素之一。在生物界动物、植物不能直接利用大气中的氮气，只能利用化合态氮。但某些微生物可以直接利用占大气近80 %的氮气，具有将氮气转化成氨的能力即生物固氮。它们能通过体内一种具有特殊催化能力的蛋白质即固氮酶的活动，把空气中的氮转化为植物能吸收利用的含氮化合物。植物从土壤中吸取这些养料用以合成蛋白质，动物又从植物那里摄取蛋白质和其他必需的成分来延续自己的生命活动。由此可见，世界上各种含氮化合物包括蛋白质在内，其最初来源都是空气中的氮，而且都是通过微生物的固氮活动把它转变为有效氮素。所以生物固氮构成了自然界整个氮素循环的重要环节，并直接关系到植物、动物以至人类的生存。
[0003]生物固氮是个十分复杂的生理生化过程，涉及到固氮酶的生物合成、组装、酶催化、调控等等一系列生化过成。固氮酶系统在结构上和催化机理方面都是相当复杂的，要形成一个具有活性的固氮酶复合体，需要许多基因来编码。肺炎克氏杆菌(Klebesielapneumoniae) 21个固氮基因在染色体上以基因簇的形式存在，全长大约24kb。21个基因构成 8 个转录单位:nifJC, nifHDKTY, nifENX, nifUSVff, nifZM, nifF, nifLA 和 nifBQ。固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) A1501染色体上有56个与固氮相关基因以基因簇的形式存在，棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的nif基因位于两个不相邻的基因族，nifHDKTYENXUSVffZMF 和 nifLABQ。巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)固氮相关基因主要分布在两个基因簇:一个主要nif簇含有nifHDK、nifY、nifE、nifUS、nifff和fixABCX,另外一个nif基因簇由nifA和nifB基因组成。这些G-固氮菌的nif启动子均属于O 54型启动子，其转录严格根`据铵和氧浓度受转录激活蛋白NifA的调控。螺旋杆菌(Heliobacterium)有 I 个 10kb、含 11 个基因的固氮基因族:nifll nif 12 nifH nifD nifKnifE nifN nifX fdx nifB nifV,丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)固氮基因族由 9 个基因组成:nifH nifll nif 12 nifD nifK nifE nifN-B nifVw nifVa ;贝氏梭状芽胞杆菌固氮基因族有 14个基因:nifH nifll nif 12 nifD nifK nifE nifN-B fdxA nirjl nirJ2 nirDnirH nifVw nifVa ;巴氏芽抱梭菌(C.pasteurianum)固氮基因族有10个基因:nifH2 nifHlnifD nifK nifE nifN-B modA modB nifVw nifVa。
[0004]固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus)目前报道有17个固氮菌种，其抗逆力强、耐贮藏，很多菌株除了有固氮能力外还有促生，抗生等多种能力，其具有独特的基因类型、不一样的固氮调控机理以及潜在的应用价值，因此研究其固氮基因簇有利于研究固氮调节机理，对得到更好、更多的转基因材料具有重要的研究意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一株具有固氮基因簇的芽孢杆菌。
[0006]本发明的另一目的在于提供含有上述固氮基因簇的表达载体。
[0007]本发明的再一目的在于提供上述固氮基因簇的应用。
[0008]本发明提供的一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) 18WLY，其含有固氮基因簇nifBHDKENXV moeB。该菌株已于2013年6月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为Paenibacillus sp.，保藏号为CGMCC N0.7724。
[0009]本发明提供的固氮基因簇，其为nifBHDKENXV moeB，核苷酸序列为:
[0010](I)SEQ ID N0.10 所示，包含 nifB，nifH, nifD, nifK, nifE, nifN, nifX, moeB,nifV9个基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1_9所示；*(2)SEQ ID N0.10所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或(3)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0011]所述严格条件为在0.1XSSC (成分为NaC10.015M，柠檬酸钠0.0015M，PH7.0)，
0.1%SDS的溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。
[0012]序列表中SEQ ID N0.1是由15 01个碱基对组成，编码产物参与FeMoco辅因子的合成。SEQ ID N0.2是由867个碱基对组成，编码固氮酶的Fe蛋白。SEQ ID N0.3是由1449个碱基对组成，编码固氮酶的钥铁蛋白的a亚基。SEQ ID N0.4是由1449个碱基对组成，编码固氮酶钥铁蛋白的P亚基。SEQ ID N0.5是由1362个碱基对组成，编码产物参与FeMoco辅因子的合成。SEQ ID N0.6是由1212个碱基对组成，编码产物参与FeMoco辅因子的合成。SEQ ID N0.7是由390个碱基对组成，编码产物参与FeMoco辅因子的合成。SEQ ID N0.8是由1147个碱基对组成，编码产物参与高柠檬酸铁的合成。SEQ ID N0.9是由894个碱基对组成，编码产物参与FeMoco辅因子的合成。SEQ ID N0.10是基因簇在整个基因组中的序列，由11039bp的核苷酸对组成。
[0013]此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明固氮基因簇基因基因还包括由SEQ ID N0.1-9所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码固氮相关的核苷酸序列。
[0014]可将本发明基因簇与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本发明有固氮能力的基因工程菌。
[0015]本发明提供了含有上述固氮基因簇nifBHDKENXV moeB的表达载体。
[0016]在本发明实施例中，分别将固氮基因簇插入到表达载体pUC18，pHY300PLK和pET28b上构建得到重组表达载体pUC18-l、pHY300PLK-2、pET28b-3，其质粒图谱如图7a、图7b、图7c所示。进一步，将这些表达载体导入到E.coli (JM109)中获得具有固氮能力的工程菌株。因此本发明还包括含有上述表达载体的宿主细胞或宿主菌。
[0017]上述重组表达载体pUC18-l、pHY300PLK-2、pET28b_3分别通过以下方法构建得到: [0018]I)分别以S3和S4、SI和S2或S5和S6为引物，固氮芽孢杆菌Paenibacillussp.18WLY基因组为模板，PCR扩增固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB在目的片段；[0019]2)分别将表达载体pUC18、pHY300PLK或pET28b和步骤I)的目的片段分别用XbaI和HindII1、XbaI和BamH1、BamHI和HindIII分别双酶切，回收酶切产物；
[0020]3)在10 ill反应体系中分别加入酶切后的表达载体pUC18、pHY300PLK或pET28bl ii I 和 7.1 目的片段(摩尔比约为 1:6)，IOXligase bufferl U 1，T4DNAIigase0.5 iil，混匀；16°C水浴连接16h，转化感受态细胞；
[0021]4)筛选阳性克隆子，得到含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的质粒pUC18-l、pHY300PLK-2、pET28b-3。
[0022]在本发明的一个实施例中，利用载体PHY300PLK-2通过基因工程的方法构建得到大肠杆菌基因工程菌株78-7，其通过如下方法构建得到:
[0023]I)以SI和S2为引物，固氮芽孢杆菌Paenibacillus sp.18WLY基因组为模板，PCR扩增带有自身启动子的固氮基因簇nifBHDKENXV moeB在目的片段；所述SI的序列为:GCTCTAGAGCGGAGACTATTTCCCAAAAT ；S2 序列为 TGCGGATCCGCGTGTAATGGTTATATGAAT ；
[0024]2)将表达载体pHY300PLK和步骤I)的目的片段分别用XbaI和BamHI分别双酶切，回收酶切产物；
[0025]3)在10 ill反应体系中分别加入酶切后的表达载体pHY300PLKl 和7.5 yl目的片段(摩尔比约为 1:6)，10Xligase bufferl u 1，T4DNA ligase0.5u 1，混匀；16°C水浴连接16h，转化感受态细胞；
[0026]4)筛选阳性克隆子，得到含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的质粒pHY300PLK-2 ；
[0027]5)将含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB 的质粒pHY300PLK-2 电转到E.coli JM109中，得到工程菌株78-7。
[0028]本发明提供了大肠杆菌基因工程菌株78-7在制备生物固氮微生物菌剂或生物有机肥中的应用。
[0029]本发明提供了固氮基因簇nifBHDKENXV moeB在生物固氮中的用途。以及固氮基因簇nifBHDKENXV moeB在制备具有固氮能力转基因农作物中的应用。
[0030]本发明还提供了含有大肠杆菌基因工程菌株78-7的菌剂，及该菌剂在促进植物生长上的应用。本发明提供了含有大肠杆菌基因工程菌株78-7的菌剂在制备生物固氮微生物菌剂或生物有机肥中的应用。含有类芽孢杆菌18WLY的菌剂也属于本发明的保护范围。本发明提供了类芽孢杆菌18WLY在生物固氮中的用途。
[0031]本发明的有益效果主要体现在:提供了一株具有固氮活性的类芽孢杆菌18WLY，其含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB基因，经实验验证将该固氮基因簇在大肠杆菌中表达，可以使非固氮菌株获得固氮能力，并且解除了铵根离子对生物固氮功能的调控，其对提高固氮效率、构建高效固氮工程菌株价值显著，获得的3株具有固氮能力的大肠杆菌78-2(pUC18), 78-7(pHY300PLK), 78-32(pET28b)，乙炔还原法测定其固氮酶活分别为为149.78、298.76、57.69nmolC2H4/ (mg protein h)。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为固氮类芽孢杆菌固氮基因簇的结构图。
[0033]图2是固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的PCR扩增图；其中I为引物SI，S2扩增得到的基因簇电泳条带，2为S3，S4扩增得到的基因簇电泳条带，3为S3，S4扩增得到的基因族电泳条带，M为Ikb ladder marker。
[0034]图3是表达载体pUC18-l，pHY300PLK-2, pET28b_3构建酶切琼脂糖凝胶电泳验证图;其中图 3a 为 pUC18-l 酶切电泳图，I 为 pUC18-78/XbaI+HindI 11,2 为 nif cluser PCRproduct/XbaI+HindIII，3 为 pUC18/XbaI+HindIII ;图 3b 为 pHY300PLK_2 酶切电泳图，I 为nif cluser PCR product/Xbal+BamHI，2 为 pHY300PLK_78/XbaI+BamHI，3 为 pHY300PLK/Xbal+BamHI,图 3c 为pET28b_3酶切电泳图，I 为nif cluser PCRproduct/BamHI+Hindl 11,2为 pET28b-78/BamHI+HindIII，3 为 pET28b/BamHI+HindIII。图 4 是工程菌株 78-2(pUC18)，78-7pHY300PLK)和78-32 (pET28b)的固氮酶活力图，其中图4a为利用乙炔还原法测定，图4b为15N2标记法测定。
[0035]图5是固氮酶活力影响图；图5a和图5b分别是不同氧气浓度和不同铵离子浓度对工程菌株78-7 (pHY300PLK)固氮酶活力影响图。
[0036]图6是高保真实时荧光定量PCR检测的铵氧对工程菌株78-7 (pHY300PLK)固氮基因转录水平的影响图。
[0037]图7是重组载体 图谱，其中图7a为pUC18_l，图7b为pHY300PLK_2，图7c为pET28b-3的图谱；
【具体实施方式】
[0038]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0039]若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0040]实施例1固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB克隆以及序列分析
[0041](I)固氮类芽孢杆菌全基因组序列分析
[0042]本发明完成了几株固氮类芽孢杆菌基因组框架图序列分析，这些固氮类芽孢杆菌株都有共同的比较完整的固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB，如图1所示。信息学分析这9个基因可能是构成一个转录单元，启动子为O 7°，这是目前发现的固氮基因数目较少的天然固氮基因簇,包含6个基本固氮基因nifBHDKEN和另外3个基因nifXVmoeB。
[0043](2)固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的扩增
[0044]本发明的类芽孢杆菌18WLY分离自北京百望山竹子根系，采用形态观察法和16SrRNA序列测定相结合的方法，将该菌鉴定为类芽孢杆菌。该菌株18WLY于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101 )，保藏编号为CGMCC N0.7724，分类名为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)。
[0045]本发明对分离得到的一个菌株Paenibacillus sp.18WLY的固氮类芽孢杆菌固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB进行了克隆，根据其基因组框架序列分析结果，设计三对引物SI和S2, S3和S4, S5和S6 (见表I),以菌株Paenibacillus sp.18WLY基因组为模板对其固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB及其共用的启动子进行了扩增，得到大小约为Ilkb的片段，序列如SEQ ID N0.10所示。三对引物扩增出的三个片段是一样的，都为9个基因组成的固氮基因簇，不同的是片段的开始和末尾的酶切位点不同。并将此片段进行了胶回收纯化，扩增
【权利要求】
1.一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) 18WLY，其保藏编号为 CGMCC N0.7724。
2.如权利要求1所述的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.) 18WLY,其特征在于,含有一种固氮基因簇，其为nifBHDKENXV moeB。
3.一种固氮基因簇，其为nifBHDKENXV moeB，其核苷酸序列为:
(1)SEQ ID N0.10 所示，包含 nifB，nifH, nifD, nifK, nifE, nifN, nifX, moeB, nifV9个基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1-9所示；或 (2)SEQ ID N0.10所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或 (3)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.含有权利要求3所述固氮基因簇的表达载体。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，其为pHY300PLK-2。
6.含有权利要求4-5任一所述表达载体的宿主细胞或宿主菌。
7.如权利要求6所述的宿主菌，其为大肠杆菌基因工程菌株78-7，其通过如下方法构建得到: (1)以SI和S2为引物，固氮芽孢杆菌Paenibacillussp.18WLY基因组为模板，PCR扩增带有自身启动子的固氮基因簇nifBHDKENXV moeB在目的片段；所述SI的序列为:GCTCTAGAGCGGAGACTATTTCCCA AAAT ；S2 序列为 TGCGGATCCGCGTGTAATGGTTATATGAAT ； (2)将表达载体pHY300PLK和步骤(I)的目的片段分别用XbaI和BamHI分别双酶切，回收酶切产物； (3)在10ill反应体系中分别加入酶切后的表达载体pHY300PLKl 和7.5 目的片段，摩尔比约为 1:6，IOXligase buffer I u 1,T4DNA ligase0.5 yl，混匀；16°C 水浴连接16h，转化感受态细胞； (4)筛选阳性克隆子，得到含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的质粒pHY300PLK_2； (5)将含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的质粒pHY300PLK_2电转到E.coli JM109中，得到工程菌株78-7。
8.大肠杆菌基因工程菌株78-7在制备生物固氮微生物菌剂或生物有机肥中的应用。
9.含有权利要求1所述的类芽孢杆菌18WLY的菌剂。
10.权利要求1所述的类芽孢杆菌18WLY或权利要求3所述的固氮基因簇在生物固氮中的用途。
【文档编号】C12N15/70GK103451130SQ201310317366
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年7月25日 优先权日:2013年7月25日
【发明者】陈三凤, 王莉瑛 申请人:中国农业大学