miRNA检测方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种miRNA检测方法及应用。具体地，本发明提供了一种检测miRNA的新方法(称为aLHCD)，该方法包括：(a)将含miRNA的样品与双发夹核酸杂交探针进行液相杂交，从而形成含“miRNA-杂交探针”的第一复合物的液相混合物；(b)对第一复合物，用限制性内切酶进行消化，形成一端保留发夹结构区的第二复合物；(c)用单链外切酶对第二复合物进行消化，形成第三复合物；(d)以经双重消化的核酸探针为模板，用引物进行PCR扩增；(e)检测PCR扩增产物的存在与否和/或数量，得出待测miRNA的检测结果。本发明方法具有高特异、高灵敏和便利性等特点，不仅可同时检测多种miRNA，还可区分miRNA及其前体。本发明方法可应用于生物学检测和临床医学。
【专利说明】miRNA检测方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地涉及一种检测miRNA的新方法（称为aLHCD)、及 其在生物学检测和临床医学中的应用。
【背景技术】
[0002] miRNA是约22个碱基长的微型非编码RNA，它的产生是一个梯级的过程。RNA 聚合酶II或III转录产生的长非编码RNA(称为pri-miRNAs)，首先由RNA酶DR0SHA剪 切，产生约60-70bp长的前体分子（称为pre-miRNAs)，再经由DICER剪切，产生成熟的 miRNA[D.P.Bartel,Cell,116 (2), 281(2004),K.Okamura,WileyInterdiscipRevRNA, 3(3)，351 (2011)】。
[0003] 现今，业已证明miRNA是基因表达调控的一个关键子，它可影响几乎每个细胞 生物学事件，并能参与大部分的人类疾病【Y.Huang,X.J.Shen，Q.Zouetal.，JPhysiol Biochem，67(1)，129(2010)】。
[0004] 由于miRNA如此重要，对其研究呈爆炸性的增长，但miRNA检测方法的研究明显滞 后于miRNA自身的研究。
[0005]MiRNA检测方法明显滞后的原因，主要是由miRNA自身独特的特点所决定的 【K.A.Cissell，S.Shrestha，andS.K.Deo,AnalyticalChemistry79 (13)，4754 (2007) ;M.de Planell-SaguerandM.C.Rodicio,AnalChimActa699 (2), 134 (2011)]：一是miRNA分子喊 基序列特别短，杂交时的退火温度低，从而影响杂交的严紧性；二是miRNA与其家族成员仅 有几个碱基乃至单个碱基的区别，与其多个靶基因也有相似的序列，与其前体更是有完全 相同的序列【P.ChughandD.P.Dittmer,WileyInterdiscipRevRNA3 (5) ,601 (2012) ;H. Zhou,M.L.Arcila,Z.Lietal.,NucleicAcidsRes40 (13), 5864 (2012) ;M.Thomas,J. Lieberman,andA.Lai,NatStructMolBioll7(10), 1169(2010)】，这对miRNA的检测特异 性提出了极大的挑战；三是miRNA没有poly-A尾巴和5'帽子，这阻止了常规方法对其特异 性的纯化，从而影响检测的灵敏度和特异性；四是miRNA极短的碱基序列也使引物的设计 十分困难，从而影响PCR方法的运用；五是不同的GC含量需要不同的退火温度，特别是对 miRNA这样很小的分子而言更为明显，这就严重影响了多个miRNA的同时检测。
[0006] 尽管困难重重，各种各样的miRNA检测方法也涌现出来【K.A.Cisselland S.K.Deo,AnalBioanalChem394 (4), 1109 (2009) ;S.TakadaandH.Asahara,Mod Rheumatol(2012)】。目前为止，常用的miRNA检测方法主要有三大类，其中Northern blotting被看成是检测单个miRNA的金标准，PCR适合高灵敏的检测，芯片适合高通量 的分析【P.ChughandD.P.Dittmer,WileyInterdiscipRevRNA3 (5) ,601 (2012) ;M.de Planell-SaguerandM.C.Rodicio,AnalChimActa699 (2), 134 (2011);E.vanRooij,Circ Resl08 (2), 219 (2011)】。但是Northernblotting方法操作复杂，费时费力，灵敏度低，不 适合高通量分析。stemloop-PCR因为引物的设计有很大的困难限制了它的应用。芯片虽 然可用于多通量的分析，但特异性和可重复性低。
[0007] 总之，目前的方法很难做到对miRNA高特异、高灵敏和便利性的检测【P.Chugh andD.P.Dittmer,ffileyInterdiscipRevRNA3 (5), 601 (2012);K.A.Cisselland S.K.Deo,AnalBioanalChem394(4), 1109(2009)】。因此，本领域迫切需要开发高特异、高 灵敏和便利性的、可同时检测多种miRNA的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的就是提供一种高特异、高灵敏和便利性的、可同时检测多种miRNA 的方法。
[0009] 在本发明的第一方面，提供了一种miRNA检测方法，包括步骤：
[0010] (a)将含miRNA的样品与核酸杂交探针进行液相杂交，从而形成含"miRNA-杂交探 针"的第一复合物的液相混合物，其中所述的核酸杂交探针为双发夹核酸探针，并且所述的 双发夹核酸探针具有：
[0011] (i)位于5'端的第一发夹结构区；
[0012] (ii)位于3'端的第二发夹结构区；以及
[0013] (iii)位于所述第一发夹结构区和第二发夹结构区之间的、与待检测的miRNA互 补的互补结合区；
[0014] (b)对所述的"miRNA-杂交探针"第一复合物，用限制性内切酶进行消化，从而从 所述第一复合物中切除第一发夹结构区或第二发夹结构区，形成一端保留发夹结构区的、 经酶切的第二复合物，其中所述的限制性内切酶仅切除第一发夹结构区或第二发夹结构区 而不切割第一复合物的其他区域；
[0015] (c)用单链外切酶对所述第二复合物进行消化，从而切除所述第二复合物中在步 骤（b)中切除发夹结构区所暴露出的核酸单链，形成第三复合物，并同时切除多余的未杂 交探针，其中所述第三复合物由经双重消化后的核酸探针和miRNA构成；
[0016] ⑷以所述的经双重消化的核酸探针为模板，用引物进行PCR扩增，从而获得PCR 扩增产物，其中所述扩增产物含有对应于所述待测miRNA序列的核酸序列区；
[0017] (e)检测所述PCR扩增产物的存在与否和/或数量，从而得出待测miRNA的检测结 果。
[0018] 在另一优选例中，所述的检测结果为定性或定量结果。
[0019] 在另一优选例中，所述的互补是完全互补。
[0020] 在另一优选例中，在步骤（d)中，所述的PCR扩增为桥接PCR扩增。
[0021] 在另一优选例中，在步骤（d)中，在所述的桥接PCR扩增中同时使用桥接引物对和 通用引物对，其中，桥接引物对特异性结合于所述的经双重消化的核酸探针，而所述通用引 物对特异性结合于所述桥接引物对的外侧。
[0022] 在另一优选例中，所述的桥接引物对由第一桥接引物和第二桥接引物构成，其中 第一桥接引物特异性结合于所述经双重消化的核酸探针中残留的发夹结构区，而第二桥接 引物特异性结合于所述经双重消化的核酸探针中互补结合区。
[0023] 在另一优选例中，在步骤（d)中，通过亲和素_生物素复合物信号放大技术，检测 所述PCR扩增产物。
[0024] 在另一优选例中，所述的通用引物对的部分或全部引物带有生物素标记；
[0025] 或者所述的通用引物对的上游引物和/或下游引物带有生物素标记。
[0026] 在步骤（d)中，通过亲和素_生物素复合物信号放大技术，检测所述PCR扩增产 物。
[0027] 在另一优选例中，在步骤（e)中，通过标记酶显色进行显色判读；或通过印迹法或 macroarray方法进行检测。
[0028] 在另一优选例中，所述的限制性内切酶是识别6个碱基的限制性内切酶；
[0029] 而所述的单链外切酶为3'到5'的外切酶。
[0030] 在另一优选例中，所述的限制性内切酶为BamHI;和/或单链外切酶为Exol。
[0031] 在另一优选例中，所述的限制性内切酶在所述的第一复合物上仅具有一个对应的 酶切位点，且所述酶切位点位于第一或第二发夹结构区的配对区。
[0032] 在另一优选例中，所述方法具有选自下组的一个或多个特征：
[0033] ?第一发夹结构区具有双链的第一茎部区和单链的第一茎环区（loop);
[0034] ?第二发夹结构区具有双链的第二茎部区和单链的第二茎环区（loop);
[0035] ?所述各茎部区的长度为6_12bp，较佳地7-10bp;
[0036] ?所述各茎环区的长度为4-12bp，较佳地4-10bp，更佳地4-8bp;
[0037] ?所述的互补结合区与所述第一发夹结构区和/或第二发夹结构区之间存在 〇-3bp的间隔区；较佳地，间隔区的长度为l_2bp;
[0038] ?所述互补结合区的长度与待检测的miRNA的长度一致，为18_30bp。
[0039] 在本发明的第二方面，提供了一种用于检测miRNA的试剂盒，所述试剂盒含有：
[0040] (a)用于与miRNA进行杂交的核酸杂交探针，其中所述的核酸杂交探针为双发夹 核酸探针，并且所述的双发夹核酸探针具有：
[0041] (i)位于5'端的第一发夹结构区；
[0042] (ii)位于3'端的第二发夹结构区；以及
[0043] (iii)位于所述第一发夹结构区和第二发夹结构区之间的、与待检测的miRNA互 补的互补结合区；
[0044] (b)使用说明书。
[0045] 在另一优选例中，所述的试剂盒还含有一种或多种以下组分：
[0046]?用于扩增反应的试剂；
[0047]?用于酶切反应的试剂；
[0048] ?用于显色反应的试剂。
[0049] 在另一优选例中，所述的用于酶切反应的试剂包括限制性内切酶和/或单链外切 酶。
[0050] 在另一优选例中，所述试剂盒中含有二种或多种针对不同miRNA的核酸杂交探 针。
[0051] 在本发明的第三方面，提供了一种用于与miRNA进行杂交的核酸杂交探针，所述 的核酸杂交探针为双发夹核酸探针，并且所述的双发夹核酸探针具有：
[0052] (i)位于5'端的第一发夹结构区；
[0053] (ii)位于3'端的第二发夹结构区；以及
[0054] (iii)位于所述第一发夹结构区和第二发夹结构区之间的、与待检测的miRNA互 补的互补结合区。
[0055] 在另一优选例中，所述的核酸杂交探针具有选自下组的一个或多个特征 ：
[0056] ?第一发夹结构区具有双链的第一茎部区和单链的第一茎环区（loop);
[0057] ?第二发夹结构区具有双链的第二茎部区和单链的第二茎环区（loop);
[0058] ?所述各茎部区的长度为6_12bp，较佳地7-10bp ;
[0059] ?所述各茎环区的长度为4-12bp，较佳地4-10bp，更佳地4-8bp;
[0060] ?所述互补结合区的长度与待检测的miRNA的长度一致，为18-30bp。
[0061] 所述的互补结合区与所述第一发夹结构区和/或第二发夹结构区之间存在〇_3bp 的间隔区；较佳地，间隔区的长度为l_2bp。
[0062] 在另一优选例中，所述第一发夹结构区的序列为 5'-ACGTGCGAAAACGCGCGAT-3'（SEQIDN0. :1)。
[0063] 在另一优选例中，所述第二发夹结构区的序列为5'-TTTATAGGATCCAATAAAAATTGGA TCCTATAC-3'（SEQIDN0. :2)。
[0064] 在本发明的第四方面，提供了一种探针组合，所述组合包括二种或多种针对不同 miRNA的、本发明第三方面中所述的核酸杂交探针。
[0065] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0066] 图1显示了本发明方法的流程示意图。
[0067] 图2显示了本发明一个实例中所用核酸杂交探针和引物的序列，其中包括探针的 发夹结构区序列、PCR搭桥序列、BIOTIN标记的PCR通用引物；
[0068] 图3显示了本发明方法与常规northernblotting方法对比，本方法的检测灵敏 度。其中，本发明方法显示的是线性动力学范围内的灵敏度，即单独用PCR，可达到lamol水 平（fg级水平）；本发明方法显示的显色反应，即PCR后再用ABC检测放大信号，显色灵敏 度至少为20zmol(ag级水平）。图3A显示了PCR反应的线性动力学范围；图3B显示了PCR 反应的线性相关及相关系数；图3C显了显色反应不同条件下的检测灵敏度。图3D显示了 现有技术中，常规Northernblotting法（即Northern印迹法）检测miR-65的灵敏度。 其中显示常规northernblotting的检测灵敏度仅为lfmol(pg级水平）。其中，按图中所 不量的Rn〇-miR-65寡聚脱氧核苷酸及其5pmol反义探针通过传统的基于放射性同位素的 Northern印迹法在42°C下杂交。放射自显影时间为12小时。图中，Rno表示大鼠。
[0069] 图4显示了实际应用中本发明方法（aLHCD)比常规Northern印迹法更灵 敏。其中，来自于JEG-3,MG-63,U-20S，5637和T24细胞的总RNA，使用不同方法分别与 rn〇-mir_29aDNA探针进行杂交。（A)使用传统的基于放射性同位素的Northern印迹法。 (B)使用aLHCD法，PCR扩增进行20个循环。Northern印迹法的起始RNA的20iig，aLHCD 为1iig。Northern印迹法的探针量为5pmol，aLHCD为4pmol。Northern印迹法的杂交温 度为42°C，aLHCD为45°C。放射自显影的时间为12h，使用BCIP/NBT显色时间为2min。
[0070] 图5显色了本发明方法与常规Stem-loop法对比，本方法可有效区分特定类型 miRNA及其前体。其中的特定类型miRNA是指成熟体miRNA位于前体序列的3'末端。图 5A通过展示序列方式显示了这种特定miRNA及其前体都可与常规的RT-Primer匹配结合， 导致无法区分。图5B通过展示序列方式显示了这种特定miRNA可与本发明的特异性探针 匹配结合，miRNA前体不可与本发明的特异性探针匹配结合，从而导致可以有效区分。图5C 用实验证明方式显示，用常规方法（Stem-loopmethod)无法区分miRNA及其前体，而用本 发明方法（LH-PCR)可以对两种miRNA及其前体进行有效区分。
[0071] 图6显示了本发明方法可以有效区分miR-122及其前体。图中，Rno表示大鼠。图 6A通过展示序列方式显示了miR-122前体不能与本发明探针结合，而成熟的miR-122则可 与本发明探针结合。图6B通过实验证明方式显示了对本发明可有效区分miR-122及其前 体。其中，preRNA表示miRNA-122的前体。
[0072] 图7显示本发明方法可在实际样品应用中可以有效区分miR-138及其前体。图 7A通过展示序列方式显示了miR-138前体不能与本发明探针结合，而成熟的miR-138则可 与本发明探针结合。图7B通过实验证明方式显示了本发明可有效区分miR-138及其前体。 其中，pre表示miRNA-138的前体。
[0073] 图8显示了本发明方法可以有效区分同一miRNA家族中的不同成员。图8A通过展 示序列方式显示了miR-200家族中的不同成员中，仅miR-200b可与本发明探针完全匹配。 图8B通过实验证明方式显示了本发明可有效将miR-200b与同一家族中不同成员区分开。 图8C通过序列展示方式显示了miR-29家族中的不同成员中，仅miR-29a可与本发明探针 完全匹配。图8D通过实验证明方式显示了本发明可有效将miR-29a与同一家族中不同成 员区分开。
[0074] 图9显示了用本发明方法对不同组织中多个miRNA的检测结果。
【具体实施方式】
[0075] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种新型的检测miRNA的方法（取 名liquidhybridizationandcolordevelopmentwithsignalamplification,简写为 aLHCD)。该方法采用设计独特的双发夹探针，利用独特的两步特异性酶切，通过独特的桥接 PCR扩增，并与液相杂交显色法（LHCD)系统连接起来，从而构成一个完整的检测系统，实现 了对miRNA的高特异，高灵敏，多通量和便利化检测，使用安全，操作简单。在此基础上完成 了本发明。
[0076]aLHCD方法解决了目前的blotting方法，PCR方法和microarray方法对miRNA检 测的困难，提供了一个可多样化使用的方法，即aLHCD可以根据用户需要变成blotting方 法，PCR方法和macroarray方法，这为miRNA的检测提供了一个高潜能的方法。而且本发 明的aLHCD方法所用的试剂均为商品化中的大众试剂，使用方便安全，实验操作简单，很容 易推广使用。
[0077] 术语
[0078] aLHCD或LH-CD指liquid hybridization and color development with signal amplification,即液相杂交信号放大显色。
[0079]ABC指亲和素-生物素复合物（avidin-biotincomplex)。
[0080] IHC指免疫组化（immunohistochemistry)。
[0081]AP指喊性憐酸酶（alkalinephosphatase)。
[0082]BCIP/NBT指 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸 / 硝基四氮唑蓝（5-brom〇-4-chlor〇-3-indolyl-phosphate/nitrobluetetrazolium)〇
[0083]TBS指Tris缓冲液（tris-bufferedsaline)。
[0084] 如本文所用，术语"本发明探针"、"双发夹核酸杂交探针"或"具有双发夹结构的核 酸杂交探针"可互换使用，指具有以下结构（区）的双发夹核酸探针：
[0085] (i)位于5'端的第一发夹结构区；
[0086] (ii)位于3'端的第二发夹结构区；以及
[0087] (iii)位于所述第一发夹结构区和第二发夹结构区之间的、与待检测的miRNA互 补的互补结合区。
[0088] 如本文所用，术语"本发明方法"指aLHCD法或其变化形式 LH-PCR，LH_macroarray〇
[0089] 检测方法
[0090] 本发明提供了一种可用于检测微小RNA(miRNA)的新方法（aLHCD)。
[0091] 本发明检测方法是采用创新设计的双发夹DNA探针与提取的RNA进行液相杂交， 然后用BAMHI和EX0I两步酶切后，用引物进行桥接PCR扩增，再进行亲和素生物素复合物 (ABC)信号放大，最后通过标记酶显色进行显色判读。从而形成了一个高特异，高灵敏，多通 量和便利化的新型miRNA检测系统。
[0092] 参见图1。在本发明中，一个典型的miRNA检测方法包括如下基本步骤：
[0093] (1)设计特殊的杂交探针。
[0094] (2)将设计的特殊探针与待检测样品进行液相杂交。
[0095] (3)杂交后的混合液采用特定的酶进行第一次酶切。
[0096] (4)酶切后的杂交液采用另一种酶进行第二次酶切。
[0097](5)酶切后的混合液采用PCR扩增进行信号放大。
[0098](6) PCR反应液采用另一种酶进行第三次酶切。
[0099] (7)第三次酶切的混合液采用亲和素生物素复合物系统（ABC)进行进一步信号放 大。
[0100] (8)最后通过标记酶显色再次进行信号放大及判读。
[0101] 如果aLHCD用作PCR方法，则步骤（6)为用DNA凝胶成像系统检测。
[0102] 在本发明中，核酸杂交探针具有双发夹结构（通常位于两端）。
[0103] 在本发明中，用于第一步酶切的限制性内切酶没有特别限制，代表性的例子包括： 例如BamHI或其他限制性内切酶。
[0104] 在本发明中，用于第二步酶切的单链外切酶没有特别限制，代表性的例子包括：例 如EX0I等能消化DNA单链的酶。
[0105] 较佳地，PCR扩增时，至少包括一对PCR扩增标记引物和一对搭桥引物。
[0106] 在本发明中，用于第三步酶切的单链外切酶没有特别限制，代表性的例子包括：例 如EX0I等能消化DNA单链的酶。
[0107] 在本发明中，可以用常规方法对扩增产物进行检测，例如通过印迹法方法，PCR方 法和macroarray方法。
[0108] -种优选的检测方法是，对第三步酶切后的混合液进行生物素亲合素复合物系统 (ABC)或其它系统进行信号放大，从而进行检测。例如，对上述混合液再进行标记酶显色进 行信号放大和判读。
[0109] 在本发明的一个具体实例中，使用双发夹DNA探针与提取的RNA进行液相杂交， 然后用BAMHI和EX0I两步酶切后，用引物进行桥接PCR扩增，再进行亲和素生物素复合 物（ABC)信号放大，最后通过标记酶显色进行显色判读，例如，通过AP(碱性磷酸酶）或 HRP(辣根过氧化物酶）显色。
[0110] 基本原理
[0111] 本发明的基本原理说明如下：
[0112] (1)探针两端的双发夹结构提供杂交时的空间阻碍，防止miRNA前体与之杂交，同 时这个设计还有利于防止其它核酸分子的非特异杂交，再是为后续步骤的PCR放大信号提 供接头。
[0113] 例如，探针的5'发夹所加序列为：
【权利要求】
1. 一种miRNA检测方法，其特征在于，包括步骤： (a) 将含miRNA的样品与核酸杂交探针进行液相杂交，从而形成含"miRNA-杂交探针" 的第一复合物的液相混合物，其中所述的核酸杂交探针为双发夹核酸探针，并且所述的双 发夹核酸探针具有： (i) 位于5'端的第一发夹结构区； (ii) 位于3'端的第二发夹结构区；以及 (iii) 位于所述第一发夹结构区和第二发夹结构区之间的、与待检测的miRNA互补的 互补结合区； (b) 对所述的"miRNA-杂交探针"第一复合物，用限制性内切酶进行消化，从而从所述 第一复合物中切除第一发夹结构区或第二发夹结构区，形成一端保留发夹结构区的、经酶 切的第二复合物，其中所述的限制性内切酶仅切除第一发夹结构区或第二发夹结构区而不 切割第一复合物的其他区域； (c) 用单链外切酶对所述第二复合物进行消化，从而切除所述第二复合物中在步骤 (b)中切除发夹结构区所暴露出的核酸单链，形成第三复合物，并同时切除多余的未杂交探 针，其中所述第三复合物由经双重消化后的核酸探针和miRNA构成； (d) 以所述的经双重消化的核酸探针为模板，用引物进行PCR扩增，从而获得PCR扩增 产物，其中所述扩增产物含有对应于所述待测miRNA序列的核酸序列区； (e) 检测所述PCR扩增产物的存在与否和/或数量，从而得出待测miRNA的检测结果。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（d)中，所述的PCR扩增为桥接PCR 扩增。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（d)中，在所述的桥接PCR扩增中同 时使用桥接引物对和通用引物对，其中，桥接引物对特异性结合于所述的经双重消化的核 酸探针，而所述通用引物对特异性结合于所述桥接引物对的外侧。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的桥接引物对由第一桥接引物和第二 桥接引物构成，其中第一桥接引物特异性结合于所述经双重消化的核酸探针中残留的发夹 结构区，而第二桥接引物特异性结合于所述经双重消化的核酸探针中互补结合区。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（d)中，通过亲和素-生物素复合物 信号放大技术，检测所述PCR扩增产物。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的通用引物对的部分或全部引物带有 生物素标记； 或者所述的通用引物对的上游引物和/或下游引物带有生物素标记。 在步骤（d)中，通过亲和素-生物素复合物信号放大技术，检测所述PCR扩增产物。
7. 如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于，在步骤（e)中，通过标记酶显色进 行显色判读；或通过印迹法或macroarray方法进行检测。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具有选自下组的一个或多个特征： ?第一发夹结构区具有双链的第一茎部区和单链的第一茎环区（loop); ?第二发夹结构区具有双链的第二茎部区和单链的第二茎环区（loop); ?所述各茎部区的长度为6-12bp，较佳地7-10bp ; ?所述各茎环区的长度为4-12bp，较佳地4-10bp，更佳地4-8bp ; ?所述的互补结合区与所述第一发夹结构区和/或第二发夹结构区之间存在〇-3bp的 间隔区；较佳地，间隔区的长度为l_2bp ; ?所述互补结合区的长度与待检测的miRNA的长度一致，为18-30bp。
9. 一种用于检测miRNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有： (a) 用于与miRNA进行杂交的核酸杂交探针，其中所述的核酸杂交探针为双发夹核酸 探针，并且所述的双发夹核酸探针具有： (i) 位于5'端的第一发夹结构区； (ii) 位于3'端的第二发夹结构区；以及 (iii) 位于所述第一发夹结构区和第二发夹结构区之间的、与待检测的miRNA互补的 互补结合区； (b) 使用说明书； 较佳地，所述的核酸杂交探针具有选自下组的一个或多个特征： ?第一发夹结构区具有双链的第一茎部区和单链的第一茎环区（loop); ?第二发夹结构区具有双链的第二茎部区和单链的第二茎环区（loop); ?所述各茎部区的长度为6-12bp，较佳地7-10bp ; ?所述各茎环区的长度为4-12bp，较佳地4-10bp，更佳地4-8bp ; ?所述互补结合区的长度与待检测的miRNA的长度一致，为18-30bp。
10. -种用于与miRNA进行杂交的核酸杂交探针或所述探针的组合，其特征在于，所述 的核酸杂交探针为双发夹核酸探针，并且所述的双发夹核酸探针具有： (i) 位于5'端的第一发夹结构区； (ii) 位于3'端的第二发夹结构区；以及 (iii) 位于所述第一发夹结构区和第二发夹结构区之间的、与待检测的miRNA互补的 互补结合区； 其中，所述组合包括二种或多种针对不同miRNA的所述的核酸杂交探针。
【文档编号】C12Q1/68GK104342486SQ201310326679
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2013年7月30日
【发明者】张永莲, 李湘麒, 倪敏捷, 张朝宝, 马武斌 申请人:中国科学院上海生命科学研究院