通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及免疫治疗领域，具体涉及通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括：a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。
【专利说明】通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫治疗领域，具体涉及通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法。【背景技术】
[0002]过继性细胞免疫治疗是经体外刺激培养淋巴细胞后回输给肿瘤病人，进行肿瘤治疗的方法。自20世纪80年代，细胞因子IL-2对肿瘤的治疗作用被发现，细胞免疫治疗在临床上的应用迅速扩展，人们先后培养出淋巴因子激活的杀伤性细胞(LAK)，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，细胞因子激活的杀伤性细胞(CIK)。2000年，Yamazaki T等人在柳叶刀杂志(TheLancet)报道了体外扩增活化自体淋巴细胞预防肝癌术后肿瘤复发的随机对照临床实验研究。结果表明这种非特异性免疫治疗极大延长了肝癌患者术后无复发生存时间，而且回输细胞量和杀伤性能与疗效有一定相关性，是一种很有前景的肿瘤治疗方法。
[0003]在淋巴细胞体外扩增培养中，不同的扩增步骤、不同的培养基以及是否添加血清对于扩增效果具有不同影响，而是否添加血清对提高淋巴细胞的扩增能力和排除临床使用的潜在安全风险至关重要。
[0004]本领域需要一种安全、高效、产品稳定性好、适宜于大规模生产的通过无血清培养来扩增活化淋巴细胞的方法。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括:
[0006](a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；
[0007](b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血
清培养基，进一步培养1-3天；
[0008](c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；
[0009](d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；
[0010](e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和
[0011](f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。
[0012]在一些实施方案中，本发明的方法中使用的淋巴细胞活化剂是抗CD3抗体。
[0013]在一些实施方案中，本发明的方法中步骤(a)-(e)使用相同的无血清培养基。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的无血清培养基含有细胞因子。所述细胞因子可以包括IL-2、IL-7以及INF--。本发明的方法使用的培养基中，IL-2的浓度可以是750-1500U/ml，例如 1000U/ml ;IL_7 的浓度可以是 l_30U/ml，例如 20U/ml ；INF-Y 的浓度可以是750-1500U/ml，例如1000U/ml。优选地，本发明的方法中使用的无血清培养基是X-VIV015,TexMACS或MSFlOO培养基。更优选地，所使用的无血清培养基为MSF100培养基。
[0014]使用本发明的扩增活化淋巴细胞的方法，所述生物学样品中的淋巴细胞可被扩增100至1000倍。优选地，其中扩增后的细胞主要为⑶8+T细胞，例如，所扩增的活化淋巴细胞中，CD8+T细胞可>50%。优选地，所扩增的活化淋巴细胞的活力可保持12小时。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1示出扩增活化淋巴细胞的方法流程图。
[0016]图2示出扩增的活化淋巴细胞活力时间变化曲线图。
[0017]图3示出五种培养基扩增性能比较和统计学分析。
[0018]图4示出不同培养基扩增后的细胞表型百分比和统计学分析。
【具体实施方式】
[0019]本发明提供了一种高效扩增活化淋巴细胞的方法，其使用无血清培养基进行培养，安全、高效、产品稳定性好且适宜于大规模生产。
[0020]优化的培养/扩增步骤
[0021]本发明提供了一种扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括以下步骤:
[0022](a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；
[0023](b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血
清培养基，进一步培养1-3天；
[0024](c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；
[0025](d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；
[0026](e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和
[0027](f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。
[0028]上述扩增活化淋巴细胞的方法中，培养基添加的次数和体积以及各步骤的培养时间均进行了优化。本发明的方法使得可以使用基本上一致的条件和步骤对不同患者来源的样品进行扩增。对于大量样品而言，扩增可以同步进行，从而实现规模化生产。
[0029]此外，用于扩增的起始细胞原材料一般来自患者外周血，不同性别、年龄和疾病状态的患者会造成培养前细胞差别较大。通过本发明的方法进行扩增后，可获得数量和质量相对一致的细胞，符合统一的质量标准，有利于商业上的应用。
[0030]如实施例1所述，对143例患者的淋巴细胞使用本发明的方法扩增，全部获得了高效扩增，扩增倍数为约100-约1000倍，且培养后细胞数量、细胞表型较培养前的变异系数均有明显降低，降低幅度达62?85%(表5)，也即是说使用本发明的方法可获得质量较一致的细胞制品。
[0031]淋巴细朐[0032]能够使用本发明的方法进行培养和扩增的淋巴细胞可来自外周血淋巴细胞。待扩增的淋巴细胞也可以是其他生物学样品中存在的淋巴细胞，例如上皮淋巴细胞、肿瘤内浸润淋巴细胞、癌性腹水或胸水中的浸润淋巴细胞等。由于外周血中的淋巴细胞分离简便、分离后淋巴细胞生存率高等原因，因此优选地使用分离自新鲜外周血的淋巴细胞。优选地，本发明的方法中所述“含有淋巴细胞的生物学样品”是指分离的外周血单个核细胞(PBMC)。从外周血分离PBMC的方法为本领域技术人员所熟知。本发明的方法中所使用的初始外周血单个核细胞的量可低至I X IO7?4X IO7个细胞，相当于正常人仅约20ml外周血，扩增后却可以获得IX IO9?12X IO9以杀伤性T细胞为主的淋巴细胞。较低的初始细胞量避免了对患者的大量采血。
[0033]活化淋巴细朐
[0034]术语“活化淋巴细胞”是指经特异性抗原或非特异性淋巴细胞刺激剂/分子刺激的淋巴细胞，所述活化淋巴细胞能合成大分子物质(RNA、蛋白质、DNA)及细胞因子。淋巴细胞经活化后进行细胞增殖，并分化为不同功能的子代效应细胞和记忆细胞。
[0035]术语“淋巴细胞活化剂”是指能够刺激淋巴细胞活化的试剂/分子。例如，可以使用抗CD3抗体作为淋巴细胞活化剂，该试剂刺激T细胞表面的CD3分子，通过T细胞受体有效活化T淋巴细胞。淋巴细胞有丝分裂原是另一类有效的淋巴细胞活化剂。这类分子快速活化淋巴细胞，其作用不通过T淋巴细胞受体。
[0036]合适的淋巴细胞活化剂的实例是抗CD3抗体。在本发明的淋巴细胞扩增方法的一个【具体实施方式】中，所述淋巴细胞活化剂是包被(固定化)于培养容器表面的抗CD3抗体。使用固定化的抗CD3抗体是优选的，因为其主要活化具有细胞杀伤功能的CD8+T细胞，这特别有利于提高所扩增的淋巴细胞的抗肿瘤活性。固定化抗CD3抗体的方法是已知的，例如固定化可以如下所述进行。
[0037]将抗CD3抗体固定.化于培养容器时，可将抗CD3抗体以灭菌的磷酸氯化钠缓冲液(PBS)稀释成1-50μ g/ml的浓度使用。不足I μ g/ml的浓度时，T细胞的增殖倾向于不充分，超过50μ g/ml时，T细胞的增殖虽然充分，但没有固定于不溶性载体的、自由的抗CD3抗体倾向于增多。另外，作为稀释液，只要是灭菌的磷酸氯化钠缓冲液等生理溶液即可，不作特别限定，作为保护剂，可加入白蛋白、琼脂糖等。
[0038]将稀释的抗⑶3抗体无菌地平铺于培养瓶的底面。固定时的反应温度为4_40°C，更优选为4-25°C，最优选为4-10°C。不足4°C时，抗CD3抗体的固定化效率倾向于降低，超过40°C时，抗CD3抗体的活性倾向于降低。固定化时的反应时间为30分钟-24小时，优选I小时至24小时。不足30分钟时，抗CD3抗体的固定化量倾向于降低，超过24小时时，固定时间过长，生产效率倾向于降低。
[0039]紧接着上述抗CD3抗体的固定化，除去没被固定的残余的抗CD3抗体稀释液。通过使用磷酸氯化钠缓冲液(PBS)等适当的清洗液清洗没有被固定的抗CD3抗体，使其干燥。干燥方法可以在去除清洗液以后利用4-10°C冷库中的自然干燥、10-40°C的加温干燥、冻干等方法。考虑到抗CD3抗体的活性和稳定性，优选冻干，最优选4-10°C冷库中的自然干燥。如上所述，抗CD3抗体被固定化于培养容器。
[0040]本领域技术人员可以了解，在淋巴细胞活化后的扩增步骤中无需再使用淋巴细胞活化剂。例如，任选地，可以在培养步骤(a)、(b)、(c)或(d)之后将培养物转移至不含有淋巴细胞活化剂的培养容器中进行后续培养步骤。
[0041]优化的细胞因子
[0042]在细胞扩增培养过程中，通常需要在培养基中加入细胞因子以促进细胞的增殖。本发明的方法中对扩增淋巴细胞时使用的细胞因子进行了优化。
[0043]在本发明中，细胞因子使用IL-2、IL-7和INF-gamma的组合。其中IL-2可以高效率、高专一性地扩增CD8+T细胞，而CD8+T细胞是免疫系统发挥抗肿瘤作用的最重要的细胞成分。而IL-7和INF-gamma则额外地促进淋巴细胞增殖，例如，维持记忆细胞的生存能力并减少细胞活化后的死亡，从而达到最好的细胞扩增效果和细胞活性的保持。在本发明的方法使用的培养基中，IL-2的浓度可以是250-3000U/ml，500-2000U/ml，750-1500U/ml，例如1000U/ml ；IL-7 的浓度可以是 1-lOOU/ml，5_50U/ml，10_30U/ml，例如 20U/ml ；INF-y 的浓度可以是 250-3000U/ml，500-2000U/ml，750-1500U/ml，例如 lOOOU/ml。优选地，使用本发明的方法扩增后的细胞主要为CD8+T细胞，例如，所扩增的活化淋巴细胞中，CD8+T细胞的比例可>50%。
[0044]优化的无血清培养基
[0045]本领域常用的细胞培养基如RPM1-1640或DMEM等在培养细胞时必须添加胎牛血清或者人血清。然而添加血清将带来一些问题，例如引入血清来源病源体污染，不同批次血清间可能存在的差异，免疫排斥风险等等。
[0046]本领域已开发了一些无血清细胞培养系统。然而，这些无血清培养系统在淋巴细胞培养过程中不能实现高效扩增，不能满足临床对治疗用细胞数量和活性的要求，并且所获得的细胞在短期内就失去活性。
[0047]本发明针对已有的无血清细胞培养方法进行了改进，筛选出适于扩增淋巴细胞的无血清培养基，并且结合上面描述的优化的细胞因子组合以及优化的培养步骤，避免了上述问题。适于在本发明的方法中使用的无血清培养基包括X-VIV015 (Lonza)、TexMACS(Miltenyi Biotech)或頂SFIOO(LYMMUNOTECH)培养基。最优选的无血清培养基为MSF100
培养基。
[0048]本发明的方法的一个优点是淋巴细胞培养过程中可以使用相同的培养基(包含相同的优化细胞因子组合)，无需在培养中进行变化，这简化了培养步骤，便于大规模操作，有利于商业上应用。
[0049]与本领域其它无血清培养方法相比，本发明的方法具有稳定的细胞培养效率，可以达到或超过添加动物血清的培养体系的扩增效力，获得的细胞活性稳定，具有较长的有效期。使用本发明的扩增活化淋巴细胞的方法，所述生物学样品中的淋巴细胞可被扩增至少10倍，优选至少100倍，更优选至少1000倍。使用本发明的方法所扩增的活化淋巴细胞的活力可保持至少4小时，优选至少8小时，更优选至少12小时。
[0050]免疫治疗方法和药物组合物
[0051]本发明还提供了一种免疫治疗方法，包括给个体施用通过本发明方法而获得的活化淋巴细胞。
[0052]在本发明的免疫治疗方法的一个实施方式中，通过上述扩增方法所获得的淋巴细胞是自体淋巴细胞，且所述免疫治疗方法包括以下步骤:
[0053](i)从个体获得含有淋巴细胞的生物学样品；[0054](?)采用本发明的方法扩增所述淋巴细胞，由此获得扩增的活化淋巴细胞；和
[0055](iii)将所述扩增的活化淋巴细胞回输给所述个体。
[0056]在本发明的免疫治疗方法中，使用的淋巴细胞来源于病人自身的少量外周血。这些淋巴细胞在短时间内可以活化扩增达100-1000倍，再回输于病人体内。
[0057]本发明的方法获得的活化细胞大部分是⑶8+T淋巴细胞(>50%)。⑶8+T淋巴细胞在杀伤病毒感染的细胞和癌症细胞中发挥重要的功能。人体内T淋巴细胞包括许多针对不同抗原的特异性细胞。这些细胞经过培养后，会针对不同的肿瘤抗原/病毒抗原具有广泛的识别和杀伤效果。本发明的免疫治疗方法可用于治疗患有例如肿瘤、感染性疾病、先天性或后天性免疫缺陷症、以及器官移植后感染性疾病及感染诱发的肿瘤的个体。
[0058]可使用本发明的免疫治疗方法进行治疗的肿瘤包括但不限于肝癌、肺癌、贲门癌、结肠癌、乳腺癌、髓母细胞瘤、胃癌、肾癌、和恶性黑色素瘤，且患有肿瘤的个体可以是正在接受放疗和/或化疗的个体。
[0059]本发明还提供一种免疫治疗的药物组合物，其包括通过本发明方法而获得的活化淋巴细胞。
_0] 本发明的各种优势
[0061]总而言之，本发明所提供的扩增活化淋巴细胞的方法相对于现有技术具有以下优势:
[0062]1.使用无血清培养基进行培养
[0063]本发明的方法可以使用无血清培养基进行，无血清培养避免了使用血清可能导致的病源微生物污染及其它对细胞生长的不利因素，也避免了可能带来的安全性因素。
[0064]2.细胞扩增效率高，不需要使用血细胞单采机
[0065]通过本发明的方法在体外高效活化和扩增患者自身的T淋巴细胞，从IX IO7?4 X IO7外周血单个核细胞开始，可以获得I X IO9?12 X IO9活化扩增的以杀伤性T细胞为主的淋巴细胞，这种约100?约1000倍以上高效扩增，避免了传统免疫细胞治疗需要使用单采机采取大量起始外周血单个核细胞对患者整体免疫细胞系统的破坏作用。
[0066]3.细胞产品活性高、稳定性好
[0067]传统非特异性细胞培养后，细胞活性一般保持在2小时左右。而本发明的方法产生的细胞活性和稳定性好，细胞可保存12个小时而不影响其治疗效果。
[0068]4.可以实现规范化、系统化生产
[0069]本发明的方法操作简单、步骤统一、出错风险小，特别适宜于大规模系统生产。
[0070]5.细胞产品可符合统一质量标准
[0071]经过本发明的方法进行扩增后可获得数量和质量相对一致的淋巴细胞，符合统一的质量标准，有利于商业应用。
[0072]实施例
[0073]下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。
[0074]实施例1:143例患者的活化淋巴细胞扩增
[0075]⑴采集了共计143例患者的外周血，不同性别、年龄和肿瘤类型均有分布。患者基本信息见下表1、2和3。[0076]表1:患者性别
[0077]
【权利要求】
1.一种通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括: a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天； b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天； c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天； d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天； e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和 f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述淋巴细胞活化剂是抗CD3抗体。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)-(e)中使用相同的无血清培养基。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述无血清培养基还含有细胞因子。
5.权利要求4的方法，其中所述细胞因子包括IL-2、IL-7以及INF-Y。
6.权利要求5的方法，其中所述无血清培养基中IL-2的浓度是750-1500U/ml，优选1000U/ml。
7.权利要求5的方法，其中所述无血清培养基中IL-7的浓度是10-30U/ml，优选20U/ml ο
8.权利要求5的方法，其中所述无血清培养基中INF-Y的浓度是750-1500U/ml，优选1000U/ml。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述无血清培养基选自X-VIV015、TexMACS和IMSF100培养基。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述淋巴细胞被扩增100-1000倍。
11.权利要求1-9任一项的方法，其中被扩增后的淋巴细胞主要是⑶8+T细胞。
12.权利要求1-9任一项的方法，其中所获得的扩增的活化淋巴细胞的活力可以保持至少12小时。
【文档编号】C12N5/0783GK103436492SQ201310334666
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月2日 优先权日:2013年8月2日
【发明者】邵谊 申请人:北京赛诺泰生物科技有限公司