一种微生态制剂及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】一种微生态制剂及其制备方法与应用，涉及水产养殖。微生态制剂含有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌中的至少一种和植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的至少一种；枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis1A05680），短小芽孢杆菌包括短小芽孢杆菌（Bacillus?pumilus1A08151），植物乳杆菌包括植物乳杆菌（Lactobacillus?plantarum1A07806）；嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌（Lactobacillus?acidophilus?PL7）。在制备促进对虾或石斑鱼生长，提高对虾或石斑鱼免疫力和抗病力，防治病害，提高存活率，净化养殖水质制剂中应用。
【专利说明】—种微生态制剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及水产养殖，尤其是ー种应用于对虾或石斑鱼养殖的制剂，具体是由枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌制成的制剂在促进对虾或石斑鱼生长，提高对虾或石斑鱼免疫力和抗病力，防治对虾或石斑鱼病害尤其是石斑鱼黑身病，提高对虾或石斑鱼存活率，净化养殖水质中的应用。
【背景技术】
[0002]2000年以来，随着高密度养殖模式的推广，我国对虾养殖业进入高速发展时期，2006年，我国对虾养殖总量124万吨，占全球养殖对虾产量的39.2%，并连续多年保持世界第一。但是，集约化、高密度水产养殖的迅猛发展，使养殖生态环境遭到严重破坏，同时也产生了一系列负面的影响，包括饲料资源浪费、环境恶化、病害严重、种质退化、药物残留等，尤其是病害问题日趋严重。对虾白斑综合病毒、桃拉病毒以及弧菌病害等造成对虾大規模死亡，已成为制约对虾养殖业发展的重要瓶颈。石斑鱼作为一种名贵的经济鱼类，自20世纪80年代起，在我国广东、福建、浙江和台湾等地区开始养殖。近年来，我国南方省区的石斑鱼网箱养殖规模迅速扩大，石斑鱼的各种病害也呈现迅速上升的势头。在毎年的春末和夏秋高温季节，常暴发各种急性传染病，如神经坏死病毒、虹彩病毒、病原细菌等造成的鱼苗黑身、打转等，造成大批石斑鱼苗死亡，给养殖业主带来巨大经济损失，严重制约了石斑鱼养殖业的发展。据统计，毎年石斑鱼苗的死亡率高达99%。目前，为了保持养殖密度以及防止疾病的爆发，生产上盲目过度投放各类抗生素，如氯霉素、土霉素、呋喃唑酮等，从而造成养殖动物体内药物残留严重，给养殖动物和人类的健康带来了潜在的危害。随着国家全面禁止在动物养殖中应用抗生素，开发无毒、无副作用、无残留、优质、新型的微生态制剂产品已成为当前市场的需要。
[0003]微生态制剂作为抗生素的替代品，一方面通过有益微生物降解养殖环境的氨氮、亚硝酸盐、H2S、饵料残渣、粪便 排泄物等浄化水质，为养殖动物营造ー个良好的养殖环境，防止病原菌滋生；另ー方面，通过有益微生物产生代谢产物和生理活性物质如抗菌肽等来抑制或者杀灭病原，同时提高养殖动物免疫力和抗病力，达到防治病害的目的；再者，有益微生物通过产生多种消化酶，帮助蛋白质、碳水化合物、脂肪的代谢，提高饲料的利用率和转化率，达到减少资源消耗和增产的目的。
[0004]中国专利CN103005183A公开ー种石斑鱼全价配合饲料，采用进ロ鱼粉、发酵豆柏、a -淀粉、面粉、鱿鱼粉、磷虾粉、酵母膏、丰年虫、鱼油、大豆磷脂、DHA、EPA、复合矿物盐、复合维生素、复合酶制剂、复合免疫增强剂、强肝剂和复合微生态制剂为原料制成。考虑石斑鱼养成期消化生理特点，在饲料中加入各种添加剤，可以促进石斑鱼消化吸收，调节石斑鱼肠道菌群稳定，提高石斑鱼免疫カ和抗脂肪肝的作用，该配合饲料营养均衡全面，无添加抗生素等药物，对水体无污染，属于高效环保无公害的饲料。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种微生态制剂及其制备方法。
[0006]本发明的另一目的是提供ー种微生态制剂的应用，尤其是可促进对虾或石斑鱼生长，提高对虾或石斑鱼免疫力和抗病力，防治对虾或石斑鱼病害尤其是石斑鱼黑身病，提高对虾或石斑鱼存活率，净化养殖水质。
[0007]所述微生态制剂含有:
[0008]枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌中的至少ー种，和植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的至少ー种；
[0009]所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilislA05680)保藏编号CCTCC N0:M2013289 ；
[0010]所述短小芽孢杆菌包括短小芽孢杆菌(Bacillus pumiluslA08151)保藏编号CCTCC N0:M2013291 ；
[0011]所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumlA07806)保藏编CCTCC N0:M2013293 ；
[0012]所述嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus PL7)保藏编号CCTCC N0:M2013294o
[0013]所述微生态制剂包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌吋，所述枯草芽孢杆菌含量为菌数占总菌数百分比20%~30% ;所述短小芽孢杆菌含量为菌数占总菌数百分比20%~30% ;所述植物乳杆菌含量为菌数占总菌数百分比20%~30% ;所述嗜酸乳酸杆菌含量为菌数占总菌数百分比20%~30%，总量为100%。
[0014]所述微生态制剂包括兽药、饲料添加剂或水质净化剂等。
[0015]所述微生态制剂中，枯草芽孢杆菌发酵液、短小芽孢杆菌发酵液、植物乳杆菌发酵液和嗜酸乳杆菌发酵液均按照本领域常规的深层液体发酵培养的方式获得，较佳地经过斜面培养、一级种子培养和发酵培养。具体可通过以下方法制备得到:
[0016]枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的培养:将出发菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；发酵培养基配方(W/V):豆饼粉 3%，淀粉 1.5%，玉米浆 1%，葡萄糖 0.5%，(NH4)2SO40.1%, NH4Cl0.1%, KH2PO40.05%, NaH2PO40.5%, MgSO40.05%, MnSO40.05%,发酵培养条件为 28 ~37°C，通风培养 36 ~48h，活菌数≤109CFU/mL ；
[0017]植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的培养:将出发菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规MRS培养基；发酵培 养基配方(W/V):糖蜜3%，红糖1%，酵母粉0.6%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.2%，CaCO30.5%，发酵培养条件为28~37°C，静置培养36~48h，活菌数≤ 109CFU/mL。
[0018]所述微生态制剂的存在形式较佳的为微生物菌体发酵液，或者微生物菌液与固体辅料的混合物。
[0019]当所述微生态制剂的存在形式为微生物菌液时，制备方法包括将枯草芽孢杆菌发酵液、短小芽孢杆菌发酵液、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵液按比例均匀混合即可；混合后最好进行浓缩处理，并可加入维生素C、低聚果糖、甘露醇等中的至少ー种保护剂，起到协调作用。
[0020]当所述微生态制剂的存在形式为微生物菌液与固体辅料的混合物时，制备方法包括将枯草芽孢杆菌发酵液、短小芽孢杆菌发酵液、红酵母菌发酵液和乳酸杆菌发酵液按比例混合均匀，作为主要活性成分，按照一定的剂型エ艺，添加固体辅料制成片剂、散剤、粉剂等。所述固体辅料为本领域常规使用固体辅料，包括石灰石、硅藻土、沸石粉、活性碳、微量元素等。
[0021]本发明所述微生态制剂中的上述任ー组合，均具有促进对虾或石斑鱼生长，提高对虾或石斑鱼免疫力和抗病力，防治对虾或石斑鱼病害尤其是石斑鱼黑身病，提高对虾或石斑鱼存活率，净化养殖水质的作用。
[0022]所述微生态制剂可在制备促进对虾或石斑鱼生长，提高对虾或石斑鱼免疫カ和抗病力，防治对虾或石斑鱼病害，提高对虾或石斑鱼存活率，净化养殖水质，尤其是石斑鱼黑身病的制剂中应用。
[0023]本发明所述枯草芽孢杆菌优选但不限于枯草芽孢杆菌1A05680保藏编号CCTCC N0:M2013289 ；短小芽孢杆菌优选但不限于短小芽孢杆菌1A08151保藏编号CCTCC N0:M2013291 ;植物乳杆菌优选但不限于植物乳杆菌1A07806保藏编号CCTCCN0:M2013293 ;嗜酸乳杆菌优选但不限于嗜酸乳杆菌PL7保藏编号CCTCC N0:M2013294。
[0024]本发明选用的菌株特性及功能如下:
[0025]1、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌:所述枯草芽孢杆菌CCTCC N0:M2013289和短小芽孢杆菌CCTCC N0:M2013291具有产胞外蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等活性，可以促进养殖动物生长，提高饲料利用率；同时能产生脂肽类抗菌物质，较强抑制各类水产动物致病菌，包括哈维氏弧菌、溶藻弧菌、坎贝氏弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌等。
[0026]2、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌:所述植物乳杆菌CCTCC N0:M2013293和嗜酸乳杆菌CCTCC N0:M2013294进入水产动物肠道，可以调节肠道菌群平衡，能产类细菌素和乳酸，抑制病原菌生长，提高养殖动物机体免疫力和抗病カ。
[0027]所述微生态制剂可促进对虾生长，提高对虾抗病力，防治对虾病害发生，提高对虾存活率，浄化养殖水质。所述微生态制剂应用于对虾养殖的使用方法和用量如下:
[0028]日常饲养时，取菌剂全池均匀泼酒。每5天使用一次，每亩养殖水体用量为I~2L，水质恶化时可加倍使用。使用后水质改善明显，水色鲜活、pH稳定、藻类生长稳定；同时水体弧菌含量较低，期间未见病害发生。同时取菌剂用适量水稀释后均匀喷洒在饲料表面，每IOOkg饲料使用I~2L，每日拌料投喂，连续投喂3天后停用2天，再连用3天。拌料投喂一段时间后，对虾摄食旺盛、肠道粗实，未见肠炎等发生。
[0029]所述微生态制剂可用于防治石斑鱼育苗期间病害的发生，包括神经坏死病毒、虹彩病毒、细菌等引起的“癫”、“黑身”等症状；有效缓解或预防病害发生，极大地降低病害造成的死亡率；同时能改善养殖水质，増加石斑鱼消化吸收功能和抗病抗逆能力，提高石斑鱼产量和质量，缩短养殖周期。所述微生态制剂在防治石斑鱼苗“黑身病”时的使用方法和用量如下:
[0030]石斑鱼苗一旦出现黑身症状，立即使用菌剂。24m3水体用量为100~200ppm，，全池均匀泼酒。每两天加一次菌，毎次加菌之前池底清污，少量换水。2天为ー个周期，连用6天，即可提高石斑鱼苗免疫力，有效缓解石斑鱼苗黑身症状，极大提高存活率。
[0031]本发明根据微生物的不同特性，将不同功效的微生物进行配伍使用，发挥协同作用。【具体实施方式】
[0032]以下实施例将对本发明作进ー步的说明。
[0033]制备例说明:上述已经对本发明的微生态制剂的制备进行说明，这里通过包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilislA05680)保藏编号CCTCC N0:M2013289、短小芽孢杆菌(Bacillus pumiluslA08151)保藏编号 CCTCC N0:M2013291、植物乳杆菌(LactobacillusplantarumlA07806)保藏编号 CCTCC N0:M2013293 和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus PL7)保藏编号CCTCC N0:M2013294四种微生物的液体制剂为例进行说明。制备方法并不局限于本方面实施例所述，公知的能够达到制备目的的方法均可以。下面通过实施例的方式进ー步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。
[0034]枯草芽孢杆菌(BacillussubtilislA05680)保藏编号 CCTCC N0:M2013289、短小芽孢杆菌(Bacillus pumiluslA08151)保藏编号CCTCC N0:M2013291、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumlA07806)保藏编号 CCTCC N0:M2013293 和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus PL7)保藏编号 CCTCC N0:M2013294 四种微生物已于 2013年6月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
[0035]实施例1 一种微生态制剂的制备
[0036]微生态制剂中各组分菌体的培养:
[0037]枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的培养:将出发菌株枯草芽孢杆菌(BacillussubtilislA05680)保藏编号 CCTCC N0:M2013289 和菌株短小芽孢杆菌(BacilluspumiluslA08151)保藏编号CCTCC N0:M2013291按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的肉汤培养基；发酵培养基配方:豆饼粉3%，淀粉1.5%，玉米浆1%，葡萄糖 0.5%, (NH4)2SO40.1%, NH4Cl0.1%, KH2PO40.05%, NaH2PO40.5%, MgSO40.05%, MnSO40.05%,发酵培养条件为37°C，通风培养36h，活菌数≥109CFU/mL ；
[0038]植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的培养:将出发菌株植物乳杆菌(LactobaciIIusplantarumlA07806)保藏编号 CCTCC N0:M2013293 和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus PL7)保藏编号CCTCC N0:M2013294按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规MRS培养基；发酵培养基配方:糖蜜3%，红糖1%，酵母粉0.6%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.2%，CaCO30.5%，发酵培养条件为37°C，静置培养36h，活菌数≥IO9CFU/
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[0039]将上述制备的枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌按照各组分活菌数等比例混合均匀，混合菌液中添加适量维生素C( 1g/L)得到复合微生态制剂菌液。
[0040]复合菌剂稳定性实验:
[0041 ] 复合菌剂在常温下避光保存0个月、1个月、2个月、3个月后，分别取样检测菌剂中的芽孢杆菌及乳酸菌含量。芽孢杆菌采用LB平板稀释涂布法检测。乳酸菌采用MRS加2%碳酸钙稀释倒平板法检测，计数时只计算周围有溶钙圈的菌落。结果见表1:
[0042]表 1
[0043]
【权利要求】
1.一种微生态制剂，其特征在于含有: 枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌中的至少ー种，和植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的至少ー种。
2.如权利要求1所述ー种微生态制剂，其特征在于所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilislA05680)保藏编号 CCTCC N0:M2013289 ； 所述短小芽孢杆菌包括短小芽孢杆菌(Bacillus pumiluslA08151)保藏编号CCTCCN0:M2013291 ； 所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumlA07806)保藏编号CCTCCN0:M2013293 ； 所述嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus PL7)保藏编号CCTCCN0:M2013294o
3.如权利要求1所述ー种微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌时，所述枯草芽孢杆菌含量为菌数占总菌数百分比20%~30% ;所述短小芽孢杆菌含量为菌数占总菌数百分比20%~30% ;所述植物乳杆菌含量为菌数占总菌数百分比20%~30% ;所述嗜酸乳酸杆菌含量为菌数占总菌数百分比20%~30%,总量为100%o
4.如权利要求1所述ー种微生态制剂，其特征在于包括兽药、饲料添加剂或水质净化剂。
5.如权利要求1所述ー种微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂中，枯草芽孢杆菌发酵液、短小芽孢杆菌发酵液、植物乳杆菌发酵液和嗜酸乳杆菌发酵液均按照本领域常规的深层液体发酵培养的方式获得，较佳地经过斜面培养、一级种子培养和发酵培养。
6.如权利要求1所述ー种微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂的存在形式为微生物菌体发酵液，或者微生物菌液与固体辅料的混合物。
7.如权利要求1所述ー种微生态制剂的制备方法，其特征在于其具体步骤如下: 枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的培养:将出发菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；发酵培养基配方，W/V:豆饼粉 3%，淀粉 1.5%,玉米浆 1%，葡萄糖 0.5%, (NH4)2SO40.1%, NH4Cl0.1%, KH2PO40.05%,NaH2PO40.5%, MgSO40.05%, MnSO40.05%,发酵培养条件为 28 ~37°C，通风培养 36 ~48h，活菌数≤ 109CFU/mL ； 植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的培养:将出发菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规MRS培养基；发酵培养基配方，W/V:糖蜜3%，红糖1%，酵母粉0.6%,蛋白胨0.5%,KH2PO40.2%, CaCO30.5%,发酵培养条件为28~37°C，静置培养36~48h，活菌数≤109CFU/mL。
8.如权利要求6所述ー种微生态制剂的制备方法，其特征在于当所述微生态制剂的存在形式为微生物菌液时，制备方法包括将枯草芽孢杆菌发酵液、短小芽孢杆菌发酵液、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵液按比例均匀混合即可； 当所述微生态制剂的存在形式为微生物菌液与固体辅料的混合物时，制备方法包括将枯草芽孢杆菌发酵液、短小芽孢杆菌发酵液、红酵母菌发酵液和乳酸杆菌发酵液按比例混合均匀，作为主要活性成分，按照剂型要求，添加固体辅料制成片剂、散剤、粉剂中的ー种；所述固体辅料包括石灰石、硅藻土、沸石粉、活性碳、微量元素中的至少ー种。
9.如权利要求8所述ー种微生态制剂的制备方法，其特征在于所述混合后进行浓缩处理，并加入维生素C、低聚果糖、甘露醇中的至少ー种。
10.如权利要求1所述ー种微生态制剂在制备促进对虾或石斑鱼生长，提高对虾或石斑鱼免疫力和抗病力，防治对虾或石斑鱼病害，提高对虾或石斑鱼存活率，净化养殖水质，尤其是石斑鱼黑身病的制剂中应用。
【文档编号】C12N1/20GK103497906SQ201310333941
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年8月2日 优先权日:2013年8月2日
【发明者】邵宗泽, 王丽萍, 单大鹏, 黄兆斌 申请人:国家海洋局第三海洋研究所