短小芽孢杆菌在对虾养殖中的应用的制作方法
【专利摘要】短小芽孢杆菌在对虾养殖中的应用，涉及水产养殖。所述短小芽孢杆菌为Bacillus?pumilus1A05490和Bacillus?pumilus1A08151，分离自中国黄海表层沉积物和印度洋深海沉积物，可在制备短小芽孢杆菌制剂等中应用，所述短小芽孢杆菌制剂包括致病性弧菌抑菌制剂、对虾生长促进剂、对虾饲料添加剂、对虾养殖水质改良剂等中的一种。所制得的短小芽孢杆菌制剂包含的活菌数不低于1×109CFU/mL，最高可达到1×1010CFU/mL以上。所述短小芽孢杆菌制剂按对虾饲料重量的0.5%～5%添加，所述短小芽孢杆菌制剂在养殖水体中的接种浓度可为103～104cfu/mL。
【专利说明】短小芽孢杆菌在对虾养殖中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及水产养殖，尤其是涉及一种短小芽孢杆菌在对虾养殖中的应用。
【背景技术】 [0002]集约化、高密度水产养殖的迅猛发展,使养殖生态环境遭到严重破坏,水产养殖病害越来越复杂，发病率越来越高，危害越来越严重，抗生素饲料添加剂的使用量日益增加。2010年，全国水产养殖面积764万公顷，其中有24万公顷遭受病害，产量损失近30万吨。在95%养殖面积中，为了防止疾病发生，生产中盲目、大规模地投放各类抗生素，如氯霉素、土霉素、呋喃唑酮等。氯霉素直接加入水中，土霉素拌饲料投喂或直接泼洒养殖水体。2000年抗生素用量约为16200吨，约70%用于畜牧业和水产养殖业。由于药物滥用、药物残留和细菌耐药性等问题日趋严重，引发了人们对食品和环境安全的关注。寻找一种新型、安全、绿色的抗生素替代品成为当前水产研究的热点之一，其中益生菌因其具有抑菌、促生长、提高免疫等作用日益受到重视。微生态制剂是通过“以菌治菌”达到防治水产养殖动物病害的目地。一方面，通过有益微生物产生代谢产物和生理活性物质来抑制或者杀灭病原菌，同时在养殖水体和养殖动物肠道中与病原菌竞争营养，占据生态位，形成优势菌群，达到防治病害的目的。另一方面，有益微生物通过产生多种消化酶，帮助蛋白质、碳水化合物、脂肪的代谢，提高饲料的利用率和转化率，达到减少资源消耗和增产的目的。
[0003]中国专利CN101773672A公开一种防治对虾白斑病的口服生物制剂，该制剂的组分和重量含量为:1%~10%表达VP28的重组枯草芽孢杆菌和5%~50%壳聚糖，其余为作为载体的玉米淀粉。该制剂使用安全，且能有效防治对虾白斑综合症。中国专利CN102309527A公开一种防治南美白对虾死底症的药物，按重量％由以下成分混合制备而成:枯草芽孢杆菌粉20%~30%，反硝化菌粉10~20%，纳豆芽孢杆菌粉10%~20%，乳酸菌粉1%~5%，沸石粉10%~20%，淀粉5%~49%。制备步骤如下:按重量％称取下述各成分:枯草芽孢杆菌粉20%~30%，反硝化菌粉10%~20%，纳豆芽孢杆菌粉10%~20%，乳酸菌粉1%~5%，沸石粉10%~20%，淀粉5%~49% ;然后进行混合，搅拌均匀，过20~80目筛，分装，500g/袋。中国专利CN102586144A公开一种短小芽孢杆菌、益生菌制剂及其制备方法和应用。该短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149于2011年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号:CCTCC NO:M2011411o该发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149具有强的胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对弧菌具有广泛的抑制性，且不具有溶血活性。以此菌作为发酵菌株，经固态发酵、干燥粉碎制得以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149作为活性成分的短小芽孢杆菌益生菌制剂，将其添加到对虾饲料中，饲喂对虾。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种短小芽孢杆菌。
[0005]本发明的另一目的在于提供一种短小芽孢杆菌在对虾养殖中的应用。[0006]所述短小芽抱杆菌为Bacillus pumiluslA05490 和 Bacillus pumiluslA08151,保藏单位:中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址:中国，武汉，武汉大学；保藏日期:2013 年 06 月 25 日；保藏编号分别为:CCTCC NO:M2013288 和 CCTCC NO:M2013291。
[0007]短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus) 1A05490CCTCC NO:M2013288，是从中国黄海表层沉积物分离获得；短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) 1A08151CCTCC NO:M2013291，是从印度洋深海沉积物分离获得。
[0008]短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus) 1A05490CCTCC NO:M2013288 和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) 1A08151CCTCC NO:M2013291 具有下述特征:
[0009]1、形态特征:短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) 1A05490CCTCC NO:M2013288 和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) 1A08151CCTCC NO:M2013291 为杆状，大小为(1.5 ~
1.7) UmX (2.5~3.0) iim，革兰氏阳性，能运动，有侧生鞭毛，产芽孢。在2216E固体培养基上28°C培养48h，菌落呈灰白色、表面干燥、扁平、边缘规则、不凸起、不透明，菌落直径大小约为2~3mm。
[0010]2、生理生化特征:菌株生长盐度范围为0~15%，18%以上不生长，最适范围为0~9% ;生长pH范围为5~12，最适范围为6~8。氧化酶( + )，接触酶( + )，硝酸盐还原(_)，吲哚试验(-)，不能发酵D-葡萄糖产酸，明胶液化( + )，尿素酶(-)，(6-葡萄糖苷酶( + )，(6-半乳糖苷酶( + )，能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、苹果酸、柠檬酸，不能利用麦芽糖、癸酸、己二酸、苯乙酸。
[0011]API ZYM结果显示，菌株1A05490和1A08151具有碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、a-胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、3 -葡(萄)糖苷酶，不具有脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、胰蛋白酶、a -半乳糖苷酶、0 -半乳糖苷酶、P -葡(萄)糖苷酸酶、a -葡(萄)糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、`a-甘露糖苷酶、a-岩藻糖苷酶等酶活性。
[0012]3、多基因序列分析:按照常规方法抽提短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus) 1A05490 和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) 1A08151 的基因组 DNA，并对 16SrRNA、gyrB、aroE和pyrE基因序列进行测定,其中短小芽抱杆菌1A05490的16S rDNA和pyrE基因序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示；短小芽孢杆菌1A08151的16S rDNA和pyrE基因序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0013]经BLAST比对分析，短小芽孢杆菌1A05490和短小芽孢杆菌1A08151与Bacillus pumilus ATCC7061(T)的 16S rDNA 序列同源性分别为 99.67% 和 100%，与 B.altitudini41KF2b(T)的 16S rDNA 序列同源性分别为 99.93% 和 99.6%，与B.safensisF0-036b (T)的 16S rDNA 序列同源性分别为 99.54%和 99.87%。16S rDNA,gyrB,aroE 和 pyrE 四个基因的 MLSA (multilocus sequence analysis)分析结果表明，1A05490与 B.pumilus ATCC7061 (T)、B.altitudini41KF2b (T)和 B.safensisF0-036b (T)三株模式种的同源性分别为97.44%,93.06%和94.37% ；1A08151与上述三株模式种的同源性分别为97.55%、92.93% 和 94.53%。
[0014]综合菌株的形态特征、生理生化特性以及16S rDNA、gyrB、aroE和pyrE基因的MLSA序列分析结果，本发明的菌株1A05490和1A08151鉴定为短小芽孢杆菌，具体为短小芽孢杆菌 1A05490 (CCTCC NO:M2013288)和短小芽孢杆菌 1A08151 (CCTCC NO:M2013291 )。
[0015]所述短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus) 1A05490和短小芽抱杆菌(Bacilluspumilus) 1A08151能产生酯酶、蛋白酶和纤维素酶等，且具有较强的活性，对致病性弧菌有显著的抑菌效果，对对虾生长有明显的促进作用，因此短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus) 1A05490和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) 1A08151可在制备短小芽孢杆菌制剂等中应用，短小芽孢杆菌制剂包括致病性弧菌抑菌制剂、对虾生长促进剂、对虾饲料添加剂、对虾养殖水质改良剂等中的一种。
[0016]所述短小芽孢杆菌制剂的制备方法的具体步骤为:将短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)lA05490和短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus) 1A08151按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；发酵培养基配方(W/V):豆饼粉 3%，淀粉 1.5%，玉米浆 1%，葡萄糖 0.5%，(NH4) 2S041%, NH4Cl0.1%, KH2PO40.05%, NaH2PO40.5%, MgSO40.05%, MnSO40.05%。
[0017]所制得的短小芽孢杆菌制剂包含的活菌数不低于lX109CFU/mL，最高可达到I X 1010CFU/mL以上。所述短小芽孢杆菌制剂按对虾饲料重量的0.5%~5%添加，所述短小芽孢杆菌制剂在养殖水体中的接种浓度可为IO3~104cfu/mL。 [0018]本发明的短小芽孢杆菌1A05490和1A08151对哈维氏弧菌SF1、坎贝氏弧菌VH1、鳗弧菌Wl、副溶血弧菌1937、欧文氏弧菌VH2、需钠弧菌FS-1等对虾致病性弧菌具有广泛的抑制性。1A05490和1A08151发酵上清液用乙酸乙酯萃取，蒸发浓缩后，对粗提物进行薄层层析(TLC)检测，产物经茚三酮显色剂显色后呈紫红色，初步判定菌株产生的是脂肽类活性物质，该活性物质对致病性弧菌具有强的抑制性。
[0019]以短小芽孢杆菌1A05490或1A08151发酵液作为活菌制剂，泼洒到养殖水体/添加到饲料中饲喂对虾，可以起到抑制养殖水体中病原弧菌的繁殖，提高对虾消化道酶活，促进对虾生长，提高对虾抗病力，减少对虾病害发生，特别是对于对虾弧菌病害的防治和对虾产量的增加具有很好的效果。
[0020]本发明的短小芽孢杆菌1A05490和短小芽孢杆菌1A08151在提高对虾抗病力、促进对虾生长方面有显著效果。在用致病性坎贝氏弧菌VHl浸浴感染对虾的实验中发现，添加短小芽孢杆菌1A05490和1A08151的实验组对虾存活率显著高于对照组，分别提高了35%和30%。将短小芽孢杆菌1A05490和1A08151进行液体发酵，以107cfu/g (每克饲料的活菌含量)的浓度添加至饲料中投喂南美白对虾，同时以IO5CfuAiL (每毫升海水的活菌含量)的浓度泼洒至养殖水体中，结果发现，经过30天的饲养，投喂添加了短小芽孢杆菌益生菌1A05490和1A08151的饲料的实验组与不添加益生菌的对照组相比，对虾平均体重增长率分别提高了 33.3%和25.4%，益生菌1A05490和1A08151实验组的对虾肠道胰蛋白酶和淀粉酶均显著高于对照组(P〈0.05)。弧菌含量动态监测结果表明，1A05490和1A08151实验组的养殖海水中弧菌含量低于对照组；菌株1A05490和1A08151均能在养殖海水和对虾肠道中存活，养殖海水中检测到的活菌含量在IO4CfuAiL以上，对虾肠道中芽孢杆菌含量在104cfu/g以上。现场实验结果表明，短小芽孢杆菌1A05490和1A08151能将养殖水体亚硝酸盐和弧菌含量控制在较低水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为短小芽孢杆菌1A05490的酶活性检测图。1、蛋白酶；2、酯酶；3、纤维素酶。
[0022]图2为短小芽孢杆菌1A05490和1A08151抑菌活性检测图。1、菌株1A05490 ;2、菌株1A08151 (指示菌为坎贝氏弧菌VHl )。
[0023]图3为短小芽孢杆菌1A05490和1A08151的16S rDNA、gyrB、aroE和pyrE基因的MLSA分析。
[0024]图4为短小芽孢杆菌1A05490和1A08151发酵上清液对坎贝氏弧菌VHl生长的抑制。在图4中，标记?为对照:VH1，为处理:VH1+1A08151，▲为处理:VH1+1A05490。
[0025]图5为短小芽孢杆菌1A05490和1A08151抑菌活性物质TLC初步分析。
[0026]图6为实验室条件下养殖水体中弧菌含量的动态监测。在图6中，标记?实验组:1A05490, 为实验组:1A08151，▲为对照组。
[0027]图7:现场实验中水体亚硝酸盐含量的动态监测。在图7中，标记? 1A05490，为1A08151，▲为对照组。
[0028]图8:现场实验中水体弧菌含量的动态监测。在图8中，标记? 1A05490，为1A08151，▲为对照组。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图对本发明作进一步的说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述的实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0030]实施例1短小芽孢杆菌的筛选和鉴定
[0031]1、酶活筛选:从中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)选取299株芽孢杆菌，进行蛋白酶活性、淀粉酶活性、脂肪酶活性和纤维素酶活性检测。结果发现，具有蛋白酶、淀粉酶、油脂酶活性和纤维素酶活性的菌株分别有147株、130株、38株和58株。
[0032]2、抑菌活性筛选:采用琼脂平板扩散法对上述获得的具有较高产酶活性的芽孢杆菌进行抑菌活性筛选。所用培养基为海水216L培养基，指示菌为致病性哈维氏弧菌SFl和坎贝氏弧菌VHl。指示菌和受试菌分别在216L培养基中过夜培养，取适量指示菌用无菌生理盐水稀释至107cfu/ml，吸取IOOii L涂布216L平板，在平板上打孔，在孔中加入受试菌发酵液50ul，30°C培养24小时，观察结果，对抑菌圈进行测量。结果表明，299株细菌中有47株对哈维氏弧菌SFl有一定的抑制作用，有26株能抑制坎贝氏弧菌VHl。其中，5株芽孢杆菌对两株弧菌均有较强的抑制作用。进一步对这5株芽孢杆菌的抑菌谱进行测定，结果发现5株菌对不同病原菌均有不同程度的抑制作用。产酶和抑菌结果分别如表1和表2所示。
[0033]表15株短小芽孢杆菌的产酶活性
[0034]
【权利要求】
1.短小芽抱杆菌，其特征在于为BacilluspumiluslA05490和BacilluspumiluslA08151，保藏单位:中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期:2013年06月25日；保藏编号分别为:CCTCC NO:M2013288 和 CCTCC NO:M2013291。
2.如权利要求1所述短小芽孢杆菌在制备短小芽孢杆菌制剂中应用，所述短小芽孢杆菌为 Bacillus pumiluslA05490 和 Bacillus pumiluslA08151。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述短小芽孢杆菌制剂包括致病性弧菌抑菌制剂、对虾生长促进剂、对虾饲料添加剂、对虾养殖水质改良剂中的一种。
【文档编号】C12R1/07GK103602608SQ201310333935
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年8月2日 优先权日:2013年8月2日
【发明者】邵宗泽, 王丽萍, 单大鹏, 黄兆斌 申请人:国家海洋局第三海洋研究所