甘蓝型油菜自交不亲和位点s单倍型的分子检测方法
【专利摘要】本发明属于油菜分子育种领域，涉及甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测方法、分子标记与应用。制备了鉴别甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记体系，其包括4个SCAR分子标记：SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2。将上述标记组合得到的2对双重PCR标记：SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300。上述PCR标记组合为共同组合使用或单独使用，其DNA序列如SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8所示和SEQ?ID?NO：9所示。本发明为油菜分子育种提供了实用标记和利用方法。
【专利说明】甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于油菜育种【技术领域】，具体涉甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测方法及应用。
【背景技术】
[0002]利用杂种优势提高产量是国内外油菜生产的重要目标和发展方向。油菜杂种优势利用途径有细胞质雄性不育、细胞核雄性不育、自交不亲和、化学杀雄等方法。细胞质雄性不育是当前应用最广泛的油菜杂种优势利用途径，尽管它存在保持系和恢复系的选育周期长、有潜在的细胞质负效应等缺点。我国主要是波里马细胞质雄性不育，其育成的杂交种占领我们油菜种植面积的60%左右；国外主要是萝卜细胞质雄性不育，除了德国NPZ种子公司及其股份占有公司利用MSL系统(具体内容属于该公司机密)、加拿大Bayer公司利用其具有自主知识产权的转基因细胞核雄性不育系统选育杂交种外，其他公司基本上都是利用萝卜细胞质雄性不育选育杂交种。
[0003]我们在研制出一种大量繁殖自交不亲和系的方法(专利号:ZL200810236719.X)的基础上，将自交不亲和三系(自交不亲和系、保持系、恢复系)杂种选育方法(傅廷栋主编，1995)简化为“两系”(是指自交不亲和系、恢复系)杂种选育方法(专利号:ZL200810236960.2)。与波里马细胞质雄性不育和萝卜细胞质雄性不育相比，自交不亲和两系杂交种选育方法具有育种程序简单、杂交种选育周期短、杂种优势强、亲本繁育程序简便、良种生产成本低等优势。
[0004]自交不亲和表型鉴别在两系杂种选育中起很重要的作用。通常用田间亲和指数法来进行判别，即在田间通过套袋自交结籽情况计算亲和指数(Self-compatibility Index,简写为SCI，亲和指数=籽粒`数/花朵数)，不仅费时因而效率低下、受时间限制(必须在油菜开花后进行)，而且结果还易受环境影响。我们利用候选基因法，发展了与S-1300的自交不亲和性连锁的SCAR标记(专利号:ZL200710053354.2)、与丙409自交不亲和保持性连锁的SCAR标记(专利号:ZL200810047237.X)。研究发现甘蓝型油菜普遍存在S单倍型(Zhang等，Theor Appl Genet, 2008，117 (2): 171-179)，上述SCAR标记在很多材料上检测不到，因而应用具有很大的局限。创建甘蓝型油菜S单倍型的分子检测技术，用来准确鉴别自交不亲和性，可解决选育自交不亲和系和恢复系效率低下因而杂种配合力不高的问题、并用于自交不亲和杂种纯度鉴定。这些相关内容，迄今还没有报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用同源基因法克隆甘蓝型油菜自交不亲和位点(又称S位点)基因，根据基因序列差异设计引物，找到可区分人工创建的自交不亲和甘蓝型油菜和天然的自交亲和甘蓝型油菜的S单倍型的SCAR(Sequence characterizedamplified regions,序列特征扩增区域)分子标记,应用得到的SCAR分子标记对甘蓝型油菜自交不亲和表型进行快速而又准确的选择，用于选育自交不亲和系和鉴定自交不亲和两系杂种纯度，以加快油菜自交不亲和新品系的育成。
[0006]具体地，本发明通过以下技术方案实现:
[0007] 申请人:通过克隆甘蓝型油菜自交不亲和位点(又称S位点)基因，根据基因序列差异设计引物，筛选得到一套用于鉴别甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记组合，其包括4个SCAR分子标记:SRK1-1、SCRl-U SRK-1300和SCR7-2，上述4个SCAR分子标记的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID NO:6，7，8，9所示。对这4个SCAR分子标记进行组合得到的2对双重PCR标记，分别是:SRK1-1+SRK-1300组合和SCR7-2+SRK-1300组合，上述双重PCR标记组合为共同组合使用或单独使用，其中将上述两个标记共同组合的使用效果会更好。
[0008]试验表明，我们利用上述分子标记或其组合，创建了利用甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记体系改良自交不亲和系的方法以及用于鉴定甘蓝型油菜自交不亲和杂种纯度的方法。
[0009]甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测技术及其应用，其具体步骤如下:
[0010]A、甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型分子检测技术的创建:
[0011]I)以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本，以甘蓝型油菜自交不亲和恢复系‘8400’为父本进行杂交，得到F1种子，种植F1种子得到F1植株，对F1植株套袋自交得到F2分离群体，取所得F1植株花粉与母本S-1300进行回交，获得BC1分离群体；以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本，以甘蓝型油菜自交不亲和保持系Bing409为父本进行杂交，得到F1种子，种植F1种子得到F1植株，对该F1植株套袋自交得到F2分离群体，取所得F1植株花粉与Bing409进行回交，获得BC1分离群体
[0012]2)调查F2和BC1植株的自交不亲和表型，采用亲和指数法进行分类；
[0013]3)利用已知的候选基因序列，分别克隆步骤I)的S-1300、‘8400’和Bing409的自交不亲和性S位点基因，这些基因包括雌蕊决定基因SRK和雄蕊决定基因SPll ;根据基因有差异序列设计引物(该引物的DNA序列见表5:)，对S-1300、‘8400，和Bing409进行PCR扩增和电泳检测；
[0014]4)回收、克隆、测序步骤3)筛选得到的甘蓝型油菜自交不亲和S位点SCAR标记的DNA片段；
[0015]5)根据步骤3)所示的引物和步骤4)所示的DNA序列，获得两个多重PCR标记(其序列分别如SEQID NO:6、7、8、9所示)使其能通过一次PCR反应区分纯合亲和S1SpS7S7，杂合亲和S1Sw-以及纯合不亲Ss_13(l(lSs_13(l(l三种基因型。选择稳定有差异扩增的引物对F2和BC1分离群体进行标记性状关联分析，确定其是否与自交不亲和性状连锁；
[0016]6)利用步骤4)得到的SCAR标记引物和步骤5)获得的多重PCR引物，扩增甘蓝型油菜，确定甘蓝型油菜自交不亲和S位点基因型。
[0017]上述A步骤得到的分子标记检测技术在甘蓝型油菜自交不亲和系遗传改良种的应用方法如下:
[0018]B、所述分子标记检测技术在甘蓝型油菜自交不亲和系选育中的应用
[0019]I)以甘蓝型油菜自交不亲和系自交不亲和系S-1300为母本，与自交亲和的甘蓝型油菜品种/品系‘8400’为父本进行杂交，得到杂种一代即Fl种子；利用上述A步骤5)中获得的多重PCR引物，扩增甘蓝型油菜自交不亲和系母本S-1300和自交亲和的甘蓝型油菜父本，筛选得到在双亲间有差异扩增的多重PCR引物；
[0020]2)种植所得的F2，在苗期分单株取幼嫩叶片抽取DNA，利用B中步骤I)获得的在双亲间有差异扩增引物检测各单株的基因型；拨除具有父本纯合基因型(S1S1, S7S7)和父本杂合基因型(S1Ss-1300S7)的单株，保留母本纯合基因型(Ss_13CI(lSs_13CI(l)的单株；对保留单株进行人工剥蕾自交，得到F3种子，同时进行套袋自交，利用亲和指数法(Zhang等，2008)对甘蓝型油菜亲和指数的分类标准，检测亲和性；种植所有单株亲和指数均小于2的F3家系，根据苗期长势、生育期等确定目标F3家系，并对其所有单株进行套袋自交，所有单株亲和指数均小于2的F4家系即为新的自交不亲和系。
[0021]3)取自交亲和的甘蓝型油菜父本‘8400’和‘Bing409’花粉与B中第I)步骤所得F1杂交得到回交一代(BC1)种子；种植该BC1，在苗期分单株提取幼嫩叶片的总DNA，利用B步骤中2)获得的在双亲间有差异扩增引物检测各单株的基因型；拨除具有父本纯合基因型(S1SpS7S7)的单株，保留父本杂合基因型(S1SsLSs_13TOS7)的单株；根据苗期长势、生育期等选择部分保留单株，与父本‘8400’和‘Bing409’杂交得到BC2种子；种植BC2种子，采用与上述相同的方法选择父本杂合基因型(S1Sy、Ss_13(KIS7)的单株，与父本‘8400’和‘Bing409’杂交得到BC3种子，继续上述步骤，得到BC4种子。种植BC4,分析各单株基因型，对父本杂合基因型的单株进行自交或剥蕾自交，得到BC4F2种子。种植BC4F2,分析各单株基因型，对母本纯合基因型(Ss_13CI(lSs_13CI(l)的单株进行自交、利用亲和指数法(参考文献同上)确认其为不亲和性，同时，剥蕾自交得到BC4F3,即新的自交不亲和系。
[0022]4)在油菜开花前在F1植株主花序或生长状态较好的侧枝花序上选取大小在
2.5-4mm之间的花蕾，进行小孢子培养。提取经小孢子培养获得的再生苗叶片总DNA (方法见参见《【具体实施方式】》)，利用B中步骤2)的方法获得的在双亲间有差异扩增引物检测每一获得的再生苗的基因型；选择母本纯合基因(Ss_13CI(lSs_13CI(l)单株进行继代培养，移栽田间；对加倍成功的即双单倍体植株，进行人工剥蕾自交，同时进行套袋自交，利用亲和指数法(参考文献同上)检测亲和性，所有亲和指数小于2的双单倍体植株即为新的甘蓝型油菜自交不亲和系。
[0023]C、分子标记检测技术在甘蓝型油菜自交不亲和杂种纯度鉴定的应用
[0024]I)以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本、与亲和甘蓝型油菜为父本‘8400’和‘Bing409’杂交，得到Fl种子；种植甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300、父本‘8400’和‘Bing409’和Fl杂种，于苗期分单株提取叶片总DNA ;利用A中步骤5)获得的多重PCR引物，扩增S-1300和父本‘8400’和‘Bing409’，选择在父母本间有差异扩增带的引物分析Fl杂种各单株的基因型，与双亲的扩增带型进行比较，计算父母本杂合基因型的比例，即为杂种纯度。
[0025]在上述发明中，A步骤中的3)所述的与甘蓝型油菜A基因组自交不亲和S位点完全连锁的显性标记引物的DNA序列如下:
[0026]SRKl-1
[0027]
【权利要求】
1.人工创造的用于鉴别甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记，其特征在于所述的分子标记为:SRK1-1、SCRl-1、SRK-1300和SCR7-2，将上述4个SCAR分子标记进行组合得到如下所述的2对双重PCR标记组合:SRK1-1+SRK-1300组合及SCR7-2+SRK-1300组合，上述双重PCR标记组合为共同组合使用或单独使用； 上述分子标记对应的核苷酸序列如下所述: SRKl-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示； SCRl-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示； SRK-1300的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示； SCR7-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
2.权利要求1所述的分子标记在甘蓝型油菜自交不亲和系遗传改良中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其中包括在甘蓝型油菜自交不亲和系选育中的应用。
4.如权利要求2所述的应用 ，其中包括在甘蓝型油菜自交不亲和杂种纯度鉴定中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103451283SQ201310366045
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】马朝芝, 高长斌, 翟文, 周贵龙, 张彤 申请人:华中农业大学