一种肿瘤细胞球三维可控图案化的方法
【专利摘要】一种肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，首先利用负性光刻胶的热塑性制得半球弧形凹槽模板，经过聚二甲基硅氧烷两次复制翻转成型及特殊抗细胞贴附修饰，得到可用于细胞接种-沉降-聚集成球的聚二甲基硅氧烷微坑芯片；所得细胞球经胶原胞外基质的包埋，实现细胞球三维基质中的图案化排列。值得注意的是，通过芯片模板设计，可以调控细胞球图案化排列，包括细胞球间距、相对位置等参数。
【专利说明】一种肿瘤细胞球三维可控图案化的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于模拟肿瘤及其微环境研究领域，具体涉及一种肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法。
【背景技术】
[0002]传统肿瘤研究体系多采用二维培养技术，与真实的体内三维环境相差甚远，由此取得的实验结果对于临床指导存在很大的偏差与局限性。
[0003]为更好地贴近体内三维环境，研究者提出细胞三维成球模型用以代替传统二维方式。细胞三维成球方式，常见如“悬滴法”(细胞悬液在重力作用下形成多细胞聚集球体)、细胞-胞外基质混合成球法及细胞-三维高聚物支架培养等。将所形成的细胞球包埋于细胞外基质以模拟肿瘤微环境的工作如Truong等人利用微孔注射器将细胞球定点注入胶原内部，观察不同肿瘤细胞在其中的侵袭行为(Hoa H.Truong等，B1materials, 2012, 33, 181-188);再如Vinci等人将孔板微坑中形成的细胞球逐个转移到空白的基底胶中，观察药物对基质中三维细胞球的侵袭抑制效果。然而，上述已报道的肿瘤研究模型均不能实现高通量、可控的细胞球三维包埋。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，该方法是以实现胶原全方位、可控包埋细胞球，模拟体内肿瘤微环境的研究方法。
[0005]本发明提供了一种肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，首先利用负性光刻胶的热塑性制得特定图案化的SU-8半球弧形凹槽模板，经过聚二甲基硅氧烷两次复制翻转成型及特殊抗细胞贴附修饰，得到聚二甲基硅氧烷微坑芯片；将细胞悬液均匀平铺在该芯片表面，经过两天沉降及细胞间相互作用的过程，微坑中的细胞成球样；原位平铺胶原液并于37°C固化，胶原块与芯片模板一起反转后将芯片剥离；由于此时的细胞球为半包埋于胶原块中，需要再加一层胶原液并固化，最终得到全方位包埋于胶原胞外基质中的细胞球三维可控图案；或者基于同样原理，得到全方位包埋于Matrigel胞外基质的细胞球三维可控图案。
[0006]本发明提供的肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，所述细胞球是通过在抗细胞贴附聚二甲基硅氧烷微坑芯片接种-沉降-聚集成球，直径为300 μ m。
[0007]本发明提供的肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，所述特殊抗细胞贴附修饰过程为:SU_8半球弧形凹槽模板经过聚二甲基硅氧烷两次复制翻转成型后，用表面活性剂泊洛沙姆(Pluronic F-127)浸泡，经此修饰，固态聚二甲基硅氧烷表面修饰的疏水基团具有抗细胞贴附的作用，从而可促使细胞成球生长。
[0008]本发明提供的肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，所述细胞悬液为细胞均匀散布的培养基溶液。
[0009]本发明提供的肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，所述胶原胞外基质选取了可用于细胞三维培养的I型鼠尾胶原或者其它适用于细胞三维培养的生物基质材料；胶原胞外基质的浓度为3mg/ml,厚度为l-3mm。
[0010]本发明提供的肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，所述细胞球的图案化可实现高通量、可控的包埋。
[0011]本发明的创造性在于:通过芯片设计与胶原全方位包埋，实现高通量或者特定排列的肿瘤细胞球图案化。
[0012]本发明的优点在于:1、可实现高通量或者特定图案化的细胞球三维排列；2、操作简单易控。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1细胞球三维基质中图案化排列原理示意图，各步骤图依次分别代表SU-8光刻胶不完全曝光、显影热熔、PDMS复制反转制成微柱芯片、PDMS再次复制反转制成微坑芯片、细胞接种、细胞沉降聚集成团、一次胶原滴加固化、胶原块与PDMS芯片反转、胶原块自PDMS芯片剥离、二次胶原滴加固化、最终成型；
[0014]图2细胞球三维基质中的图案化排列表征。
【具体实施方式】
[0015]下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
[0016]实施例1:
[0017]基于胶原基质中细胞球三维图案化的方法表征。首先利用负性光刻胶的热塑性制得SU-8半球弧形凹槽模板，浇注聚二甲基硅氧烷单体引发剂混合液固化，两次复制翻转成型后，用表面活性剂Pluronic F-127浸泡，经此修饰，固态聚二甲基硅氧烷表面修饰的疏水基团具有抗细胞贴附的作用，得到可用于细胞接种-沉降-聚集成球的聚二甲基硅氧烷微坑芯片，芯片原位形成的细胞球直径为300 μ m，选取可用于细胞三维培养的I型鼠尾胶原胞外基质正-反两次包埋细胞球阵列，实现细胞球三维基质中的图案化排列，胶原终浓度为3mg/ml，厚度为l_3mm，过程如图1所示；通过芯片模板设计，可以调控细胞球图案化排列，所得到的荧光蛋白转染脑胶质瘤U87细胞球方形矩阵及“cell”形图案如图2所示。
[0018]实施例2:
[0019]基于Matrigel基质中细胞球三维图案化的方法表征。利用负性光刻胶的热塑性制得SU-8半球弧形凹槽模板，浇注聚二甲基硅氧烷单体引发剂混合液固化，两次复制翻转成型后，用表面活性剂Pluronic F-127浸泡，经此修饰，固态聚二甲基硅氧烷表面修饰的疏水基团具有抗细胞贴附的作用，得到可用于细胞成球的聚二甲基硅氧烷微坑芯片，微坑直径和间距均为500 μ m ;将密度为15个/ml的荧光蛋白转染脑胶质瘤U87细胞接种于芯片，经过沉降及两天的聚集，原位形成的细胞球直径为300 μ m ;选取可用于细胞三维培养的Matrigel基质正-反两次包埋细胞球阵列，实现细胞球三维基质中的图案化排列，胶厚度为l_3mm。
【权利要求】
1.一种肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，其特征在于:首先利用负性光刻胶的热塑性制得特定图案化的SU-8半球弧形凹槽模板，经过聚二甲基硅氧烷两次复制翻转成型及特殊抗细胞贴附修饰，得到聚二甲基硅氧烷微坑芯片；将细胞悬液均匀平铺在该芯片表面，经过两天沉降及细胞间相互作用的过程，微坑中的细胞成球样；原位平铺胶原液并于37°C固化，胶原块与芯片模板一起反转后将芯片剥离；由于此时的细胞球为半包埋于胶原块中，需要再加一层胶原液并固化，最终得到全方位包埋于胶原胞外基质中的细胞球三维可控图案；或者基于同样原理，得到全方位包埋于Matrigel胞外基质的细胞球三维可控图案。
2.按照权利要求1所述肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，其特征在于:所述细胞球是通过在抗细胞贴附聚二甲基硅氧烷微坑芯片接种-沉降-聚集成球，直径为300 μ m0
3.按照权利要求1所述肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，其特征在于:所述特殊抗细胞贴附修饰过程为:SU-8半球弧形凹槽模板经过聚二甲基硅氧烷两次复制翻转成型后，用表面活性剂泊洛沙姆Pluronic F-127浸泡，经此修饰，固态聚二甲基硅氧烷表面修饰的疏水基团具有抗细胞贴附的作用，从而可促使细胞成球生长。
4.按照权利要求1所述肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，其特征在于:所述胶原胞外基质选取了 I型鼠尾胶原或者其它适用于细胞三维培养的生物基质材料；胶原胞外基质的浓度为3mg/ml,厚度为l-3mm。
5.按照权利要求1所述肿瘤细胞球在三维基质中可控图案化的方法，其特征在于:细胞球的图案化可实现高通量、可控的包埋。
【文档编号】C12N11/04GK104419696SQ201310400232
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】秦建华, 马静云, 张旭, 石杨 申请人:中国科学院大连化学物理研究所