小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重pcr检测引物组和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测引物组和试剂盒。其是由检测小肠结肠炎耶尔森氏菌16S?rRNA和检测与小肠结肠炎耶尔森氏菌致病相关的粘附侵袭位点基因、耐热肠毒素A基因、粘附素基因、耐热肠毒素B基因、毒力活化因子基因以及O:3血清型抗原编码基因的引物对组成。本发明建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法，利用分析设计得到的所述引物对，对待测增菌液或平板分离菌落提取的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR产物进行电泳分析以确定样品中是否是小肠结肠炎耶尔森氏菌的同时，确定其含有的与小肠结肠炎耶尔森氏菌致病相关的毒力基因和判定是否为O:3血清型。
【专利说明】小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测引物组和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属微生物检测领域，涉及小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测引物组和试剂盒。
【背景技术】
[0002]小肠结肠炎耶尔森氏菌是一种新发肠道传染病，自20世纪80年代逐渐引起全球的广泛重视，是欧美等国家感染性腹泻的主要病原体之一。该细菌普遍存在于自然环境中，水、土壤和食物中均有发现，在家畜、家禽中广泛携带。小肠结肠炎耶尔森氏菌是一种重要的食源性致病菌，它可以在低温条件下生长，通过污染食品可以导致以肠道症状为主的食物中毒,严重时病患可产生呼吸系统、心血管系统、骨骼结绨组织等疾患,甚至引起败血症，造成死亡。
[0003]对小肠结肠炎耶尔森氏菌的鉴定，通常采用种内保守种间差异大的基因作为检测目标。16S rRNA具有高度的保守性和特异性，是理想的鉴别小肠结肠炎耶尔森氏菌的目标序列。小肠结肠炎耶尔森氏菌存在多种血清型，但并不是每个血清型都能引起人类致病，而且是否引起人类致病是由菌株所携带的毒力基因决定的。不同国家和地区主要致病血清型存在差异，比如美国0:8型占优势，其次是0:5，27;日本以0:3型为主，其次是0:6血清型；比利时以0:3型为主，其次是0:9型。在中国，存在多达58个血清型，但引起人类致病的以0:3型和0:9型为主，0:8血清型在国外具有很强的毒力，而国内的0:8血清型分离株均缺乏毒力因子。
[0004]已证实小肠结肠炎耶尔森氏菌的致病因子是染色体DNA上的粘附侵袭位点基因(ail)、耐热肠毒素A基因(yst A)、质粒上的粘附素基因(yadA)和毒力活化因子基因(virF)的表达与调控的结果。另外生物IA型还携带与ystA同族的肠毒素基因——ystB，其作用目前尚不清楚。
[0005]目前经典的细菌学检查方法是细菌分离培养和生化鉴定，一般在25°C培养24小时，采用特定性质的培养基，比如按照国际标准IS010273:2003使用PSB和ITC培养基分离；然后采用赖氨酸脱羟酶试验、蔗糖试验、海藻糖试验、木糖试验、脂肪酶试验和柠檬酸盐试验等分析和确证小肠结肠炎耶尔森氏菌。通过传统方法分析可以获得小肠结肠炎耶尔森氏菌种属鉴定特征，但无法获得其致病性的数据和信息。
[0006]在生化鉴定的基础上，应用血清凝集原理可以鉴定出菌株不同的血清型别，但是不同血清型别与菌株致病性没有必然联系，比如中国的0:8血清型通常不对人致病，但美国的0:8血清型具有很强的毒力，原因是中国的0:8血清型缺乏毒力因子。因此，血清型别鉴定方法无法获得毒力因子分析数据。
[0007]当前分子生物学检测方法为毒力基因的检测提供了良好的检测工具，如中国专利申请号为201110275661.1的发明专利公开了一种基于实时荧光定量PCR技术的检测试剂盒，试剂盒由前引物、后引物、TaqMan探针、荧光PCR预混液、ROX液、纯水和阳性标准液等成分组成，使用实时荧光PCR仪，由前后引物和TaqMan探针与ail基因特异性结合、扩增，从而实现对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测与分析。再如中国专利申请号为201210448992.5的发明专利公开了一种基于核酸恒温扩增技术的检测试剂盒；再如文献“Real-Time PCR Method for Detection of Pathogenic Yersinia enterocolitica inFood，，(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Oct.2008，p.6060 - 6067)公开了一种基于实时荧光定量PCR技术的检测方法，该方法采用针对ail基因的引物探针序列，扩增出特异性的基因片段——163bp的扩增子，以分析和检测致病性的小肠结肠炎耶尔森氏菌株；再如文献“0:3和0:9小肠结肠炎耶尔森菌主要毒力基因分布调查”(中国媒介生物学及控制杂志，2004年8月第15卷第4期)提供了一种分析0:3和0:9血清型菌株毒力基因的检测方法，该方法设计了一整套针对ail基因、ystA基因、ystB基因、yadA基因、virF基因的引物对，使用普通单重PCR反应体系，包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、特异性引物对，MgCl2,dNTP等成分，对小肠结肠炎耶尔森氏菌的常见毒力基因进行逐一检测。
[0008]普通单重PCR方法、实时荧光PCR方法和等温扩增PCR方法可以对小肠结肠炎耶尔森氏菌种属鉴定基因、毒力基因和血清型基因逐个进行检测。7对引物的退火温度和浓度不尽相同，需要7轮PCR反应逐一检测，这种方法操作繁琐，耗费时间和人力，需要分别做好每个反应体系的质量控制，比如内部质控。目前尚未有采用多重PCR对与小肠结肠炎耶尔森氏菌致病相关的毒力基因进行全面检测的报道。
【发明内容】
[0009]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测的引物组和试剂盒，可快速鉴定小肠结肠炎耶尔森氏菌，筛查小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因和确定血清型，建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法。
[0010]为了实现本发明目的 ，本发明首先提供了设计和筛选特异性引物的技术方案:
[0011]1、设计阳性内对照(IAC)扩增引物和基因
[0012]以pET28a质粒为IAC模板设计一对引物，扩增其中的1176bp大小的片段，作为检测的IAC。IAC上游引物序列为5，-TGCAGGTCGACTCTAGAGGA-3 ’，IAC下游弓丨物的序列为5’ -TTCGAGCTCGGTACCCGGGGA-3’。pET28a 的碱基序列如 SEQ ID N0.17 所示。
[0013]2、设计特异性引物
[0014]本发明主要目的是鉴定小肠结肠炎耶尔森氏菌和检测其毒力基因，同时筛查所检测菌株是否为中国主要流行的0:3血清型，设计的目标基因详见表1。
[0015]在Genbank中查找表1所列举基因的全长序列，把每种基因的若干全长序列导入Mega4软件中，比对分析获得7个目标基因的保守序列区段。把每种基因的序列区段分别输入primer premier6软件中，设计3套引物对备用方案。设计过程中充分考虑不同目标基因的引物对在一个反应体系内共扩增的问题，因此，引物对设计时要考虑到Tm值、GC含量，同时尽可能避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，以保证后期不同引物对同时扩增的概率。
[0016]表1小肠结肠炎耶尔森氏囷毒力基因多重PCR检测目标基因
【权利要求】
1.一种小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重PCR检测引物组，其特征在于，其是由检测小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA及其毒力基因和血清型的引物对组成； 其中，检测小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因和血清型的引物对是由检测粘附侵袭位点基因、耐热肠毒素A基因、粘附素基因、耐热肠毒素B基因、毒力活化因子基因、0:3血清型抗原编码基因的6个引物对组成； 所述检测小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2 所示； 所述检测粘附侵袭位点基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 所示； 所述检测耐热肠毒素A基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6 所示； 所述检测粘附素基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.7、SEQ IDN0.8所示； 所述检测耐热肠毒素B基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10 所示； 所述检测毒力活化因子基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.12 所示； 所述检测0:3血清型抗原编码基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ IDN0.13、SEQ ID N0.14 所示。
2.一种小肠结肠炎耶尔森氏.菌毒力基因多重PCR检测的方法，其特征在于，将权利要求I所述引物组与待测增菌液或平板分离菌落提取DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析以确定样品中是否含有小肠结肠炎耶尔森氏菌和含有的毒力基因种类和血清型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行多重PCR反应时，反应体系中还加入阳性内对照引物对，与检测小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA及其毒力基因和血清型的引物对组成引物混合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多重PCR反应体系为:TaqDNA聚合酶 1-2U，5XPCR buffer (Tris.HCllOOmM (ΡΗ8.3)，KC1250mM, tween-200.2%) 5 μ L,IOmm的dNTP0.5-1.5μ L，25mM的MgCl2l-5y L, IOX引物混合物2.5 μ L，阳性内对照模板pET28a0.0003-0.0lng, DNA 模板 2-5 μ L,超纯水补至 25 μ L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，引物混合物中各引物对的引物终浓度为1-8 u Mo
7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，所述多重PCR反应按以下步骤进行:
a:95°C 4min ；
b:95°C 15-60s,
c:55-65°C 15-60s,d:72°C 30-120s, b_d 循环 30-35 个反应；e:72 °C 5-10min。
8.一种含有权利要求1所述.的多重PCR检测引物组的试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK103468811SQ201310424328
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】王雷, 王晓艳, 王彦威, 张志强 申请人:北京卓诚惠生生物科技有限公司