一种Bt蛋白Cry72Aa1、其编码基因及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种新的Bt蛋白Cry72Aa1及其编码基因，所述蛋白具有SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列，或该序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明的Cry72Aa1蛋白可以用于制备Bt杀虫剂，可将其编码基因转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。
【专利说明】—种Bt蛋白Cry72Aa1、其编码基因及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新的Bt蛋白，具体地说,涉及一种Bt蛋白Cry72Aal、其编码基因及应用。
【背景技术】[0002]在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。
[0003]苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌,它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins,简称ICPs), ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。
[0004]自1981年Schn印f从菌株HD-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，已陆续分离克隆了 500多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N,等Microbiol Mol BiolRev, 1998, 62:807-813; http: //www.bio I s.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前已经分离克隆了 72个类群的杀虫蛋白。一般而言，CryU Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效。其中研究的最多的是Cryl和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.1sraelensis,简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛用于蚊虫的防治。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性。
[0005]以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性。然而，从上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(McGaughey，W.H.1985.Science.229:193-195)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985 年，McGaughey 报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)在 Dipel (Btsubsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后,抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik, B.E,等 1994.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.91:4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.昆虫学报，39(3):238-244;Hofte, H.，1988.Appl.Environ.Microbiol.54:2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf，E.，等1998.Mol.Biol.Rev.65(3): 775-806)。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现(Georghiou G P, 1997.Applied and Environmental Microbiology, 63:1095-1101)。
[0006]为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力、宽杀虫谱的Bt基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种新的Bt蛋白Cry72Aal、其编码基因及应用。
[0008]为了实现本发明目的，本发明的一种Bt蛋白Cry72Aal，其氨基酸序列为:1)SEQID N0.1所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如在非活性区段，将第684位的Leu替换为Gly，将第676位的Leu缺失，在第688位增加一个Ala或增加Lys，不影响蛋白的活性。
[0009]本发明还提供编码上述蛋白的基因cry72Aal，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]本发明还提供用于检测基因Cry72Aal的PCR引物对，包括:
[0011 ] PS72-F: 5，-GGGGTCGACAATGTCTAATCGTTATCCACG-3，
[0012]PS72-R: 5，-CCCCTCGAGTTATTTGACAAATAAACTATT-3，
[0013]本发明从四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)新菌株HS18-1。该菌株已于2008年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号为CGMCC N0.2718。该菌株已在ZL200910081594.2中公开。
[0014]通过对HS18-1的毒力测试表明，HS18-1对鳞翅目害虫、双翅目害虫等，均具有极高的毒力。从HS18-1基因组及质粒测序结果中发现该菌株存在一个新的cry基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到cry72Aal基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，全长为2064bp，分析表明，cry72Aal基因GC含量为36.87%。编码687个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。在softberry网站采用bacterialsigma7.0promoter程序对全序列进行预测表明,在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将其命名为cry72Aal。Cry72Aal蛋白的氨基酸组成如表1所示。
[0015]表lCry72Aal蛋白的氨基酸组成
[0016]
【权利要求】
1.一种Bt蛋白Cry72Aal，其氨基酸序列为: 1)SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列；或 2)SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。
6.由权利要求1所述蛋白的制备的杀虫剂。
7.权利要求2或3所述基因或权利要求4所述载体在制备转基因植物中的应用。
8.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4所述载体或权利要求5所述工程菌在提高植物抗虫性中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为棉花、玉米、水稻。
10.用于检测权利要求2所述基因的PCR引物对，其特征在于，包括:
PS72-F:5’ -GGGGTCG ACAATGTCTAATCGTTATCCACG-3’ 和
PS72-R:5’ -CCCCTCGAGTTATTTGACAAATAAACTATT-3’。
【文档编号】C12N1/21GK103524605SQ201310430487
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】郑爱萍, 李平, 李巧, 朱军, 邓其明, 王世全, 李双成 申请人:四川农业大学