一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中抗菌株的方法，可用于引起小麦赤霉病的禾谷镰孢菌对多菌灵的抗性群体的动态监测及流行预警。本发明是以环介导恒温扩增技术(LAMP)为基础建立起来的一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的分子技术。该检测方法通过在禾谷镰孢菌对多菌灵的中抗菌株(F167Y)的β2微管蛋白上设计2对特异性引物，进行LAMP扩增，根据反应产物颜色判定是否为禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株。如果颜色为天蓝色(有扩增产物)为禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株；如果颜色为紫色(无扩增产物)则为禾谷镰孢菌敏感菌株。本发明简便、快速、成本低，对小麦赤霉病菌抗性风险评估及合理用药具有重要的现实意义。
【专利说明】一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的方法
【技术领域】
[0001]本发明是基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)对禾谷镰孢菌的多菌灵中等抗性水平菌株的快速分子检测方法,可用于禾谷镰孢菌对多菌灵抗性群体发展的动态监测与抗性风险评估，进行抗药性小麦赤霉病的流行预测，为小麦赤霉病的防治提供用药指导。
【背景技术】
[0002]环介导恒温扩增反应(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是:利用一套(4种)特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60?65 °C范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在I小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原的快速诊断及检测。
[0003]小麦赤霉病是一类由禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)引起的一种分布较广、破坏性较强的世界性病害，严重影响着小麦的产量和品质。多年来，小麦赤霉病主要采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。但是随着使用年限和频率的增长，田间逐渐产生了抗药性群体，从而导致该病防效下降。经过多年的研究，南京农业大学植物药理学和病害防控实验室发.现小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由禾谷镰孢菌β2_微管蛋白基因(FGSG06611.3)突变造成，该基因编码第167位和200位氨基酸密码子的突变分别为TTT (Phe) — TAT (Tyr)和TTC(Phe) — TAC(Tyr)。第167位或者200位氨基酸密码子的突变可引起禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗药性的产生，其中第167位突变占所有抗药性突变类型总量的95%以上，成为病原菌产生田间抗药性的主要原因。
[0004]病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例达到3%时，即可引起抗药性病害流行，导致药剂防治失败。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴别抗药性。本发明在抗药性机制研究的基础上，基于LAMP技术能快速、准确检测禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性。该检测方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对小麦赤霉病的有效防治、抗药性流行预警具有重要的现实意义。然而，经检索目前国内外尚未有禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的LAMP快速分子检测的相关报道。
【发明内容】
[0005]已报道的禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的鉴定及检测方法存在费时、费力、成本高的缺点。针对这一缺点，根据禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的基因型，通过实验条件优化，建立了一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的方法。该方法具有简便、快速、省时省力、灵敏度高等特点，对小麦赤霉病的合理用药、控制病害发生与流行、减少经济损失具有实用价值。
[0006]田间采集的多菌灵中抗禾谷镰孢菌菌株的95%以上的突变类型是由于禾谷镰孢菌的32微管蛋白基因编码的第167位氨基酸密码子突变造成的。本发明所述的快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的分子生物学方法，步骤是:
[0007](I)在禾谷镰孢菌的β 2微管蛋白基因上包括167位氨基酸的序列设计I对外引物和I对内引物，利用该引物在恒温条件下，进行LAMP扩增；
[0008]①LAMP反应所用的外引物对:
【权利要求】
1.一种基于LAMP技术快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的分子生物学方法，步骤是: (1)运用两对特异性引物对待鉴定真菌的基因组DNA进行LAMP恒温扩增，其中所述的两对特异性引物的碱基序列分别是: LAMP反应所用的外引物对:
F3:TTCCAGCTGACGCACTCT
B3:ACAGAAGGTCTCGTCAGAGT LAMP反应所用的内引物对(含人为引入错配碱基):
FIP:TGCGATCGGGGAACTCCTCG_TGGTACCGGTTCCGGTATG
BIP:A ?CCGTTATGCCCTCGCCC-ACGAGCTGGTTCAGAGACAA (2)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0 %琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果； (3)鉴定是否为禾谷镰孢菌抗多菌灵菌株；如果LAMP扩增产物显示天蓝色，这时电泳图谱应为梯状条带，判定为禾谷镰孢菌抗多菌灵菌株；如果扩增产物为紫色，这时电泳图谱无条带扩增，判定为禾谷镰孢菌敏感菌株。
2.根据权利要求1所述快速检测禾谷镰孢菌抗多菌灵菌株的方法，其特征在于:步骤(I)所述的LAMP反应总体积为10 μ L,反应体系是:及yr DNA 聚合酶(8U/nL) 0.3 μ?IOxThermoPol1.0 pLMgCl2 (25mM)1.6 μ?dNTP (IOmM)1.0 μιFIP (40 μΜ)0.4 μιBIP (40 μΜ)0.4 μ?F3 (ΙΟμΜ)0.2 μΕΒ3 (ΙΟμΜ)0.2 μ?甜菜碱(8 Μ)1.2 uLHNB (2.5 mM)0.6 μ?基因组DNA0.5 μL(IH2O (灭菌蒸馆水)2.6 pL。
3.根据权利要求1所述快速检测禾谷镰孢菌抗多菌灵菌株的方法，其特征在于:步骤(I)所述的LAMP反应恒温扩增条件是:63°C 60min,80°C IOmin0
【文档编号】C12Q1/04GK103436628SQ201310431741
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】周明国, 段亚冰, 葛常艳, 张晓柯 申请人:南京农业大学