一种酶-高分子结合物及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶-高分子结合物及其制备方法与应用。该结合物通过高分子活性端基与酶表面的氨基反应形成共价连接得到。在常规反应温度下（37～40℃），该结合物能在常见有机溶剂中形成纳米级分散，有机相催化活性比等当量的天然酶粉高1～2个数量级。同时该结合物纳米颗粒在有机相中具有温敏性，在低温条件下可团聚析出，便于酶催化剂的分离回收循环利用。该纳米颗粒在有机相酶催化合成领域具有广泛的应用前景。本发明还公开了上述酶纳米颗粒的制备方法，即先活化高分子端基，再与酶分子进行共价连接。该方法反应原料易得，反应条件温和，易于放大制备规模。
【专利说明】一种酶-高分子结合物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶-高分子结合物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]酶催化过程不仅可以在水相体系中进行，也可以在有机相中进行。有机溶剂的使用通常有利于溶解底物，抑制逆反应，并消除水对反应产生的副作用，同时也可能保留或者增加酶催化的化学选择性、区位选择性及立体选择性等优势。然而，大多数在体内具有高催化活性的天然酶在有机溶剂中的活性却非常有限。导致该问题的主要原因之一便是酶在有机溶剂中的溶解度极低，极大地限制了底物与酶的活性位点的接触。通过物理或化学修饰、固定化等方法提高酶制剂在有机溶剂中的溶解度(分散度)从而提高催化活性的研究受到了广泛的关注。其中，纳米生物催化系统表现出了优良的催化性能。
[0003]纳米生物催化系统是指基于酶与多种纳米结构整合的系统，如纳米硅，聚合物纳米凝胶，纳米孔材料，纳米花催化剂，自组装纳米反应器及高分子-酶纳米结合物等等。纳米生物催化系统实现了酶在催 化体系中的纳米级分散，对底物与酶之间的传质过程起到了极大地推动作用。
[0004]提高酶的催化效率并实现其回收循环利用是降低酶的使用成本、扩大酶的应用规模的重要基础。在纳米生物催化系统中，在提高酶在有机相中的分散性进而提高活性的同时，酶制剂的回收利用通常较为困难。因此，设计一种制备简单、有机相催化活性高并且易于回收利用的酶催化剂对于有机相生物催化的发展具有重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种酶-高分子结合物及其制备方法与应用。
[0006]本发明提供的制备酶-高分子结合物的方法，包括如下步骤:
[0007]I)将高分子化合物和活化剂溶于有机溶剂中进行氧化反应，反应完毕后加入沉淀剂进行沉淀，所得沉淀即为活化的高分子化合物；
[0008]2)将步骤I)所得活化的高分子化合物和酶于缓冲溶液中进行醛基与氨基的偶联反应,反应0.5-4小时后,加入还原剂进行碳-氮双键的还原反应10-20小时,得到所述酶-高分子结合物。
[0009]上述方法的步骤I)中，所述高分子化合物的平均分子量为500-20000，具体为1100-12600 ；
[0010]所述高分子化合物具体选自
[jUiroiiic j? 1;-127-.Plun:Hiic:P F-沾、[iIuronicK P-123、Pltimnk.1''.L-S]和Pluronic? L-3 I中的至少一种；
[0011]其中，所述Pluronic? F-127的平均分子量为12，600 ；
[0012]所述Pluronic? F-68的平均分子量为8，350 ；[0013]所述PluromcK, P-123的平均分子量为5，800 ；
[0014]所述PIuronieW 1.-81 il勺平均分子量为 2, 800 ；
[0015]所述Pluronic取L-31丨’丨勺平均分子量为1，100 ；
[0016]所述活化剂为能将羟基氧化为醛基的试剂；具体选自铬类氧化剂和高价态碘化合物中的至少一种；
[0017]所述铬类氧化剂具体选自重铬酸吡啶盐和氯铬酸吡啶盐中的至少一种；
[0018]所述高价态碘化合物具体选自戴斯-马丁氧化剂和2-碘酰基苯甲酸中的至少一种；
[0019]所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿和甲苯中的至少一种；
[0020]所述沉淀剂选自乙醚、石油醚和正己烷中的至少一种；
[0021]所述步骤2)中，所述酶选自南极假丝酵母脂肪酶B (Lipase B Candidaantarctica)、裙皱假丝酵母脂肪酶(Lipase from Candida rugosa)、米黑根毛霉脂肪酶(Lipase from Rhizomucormiehei)、疏棉状嗜热丝抱菌脂肪酶(Lipase fromThermomyceslanuginosus)、猪膜腺脂肪酶、膜凝乳蛋白酶(a-Chymotrypsin from bovinepancreas)、乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase equine)、细胞色素 C (Cytochrome cfrom equine heart)、葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase from Aspergillusniger)、辣根过氧化物酶(Peroxidase from horseradish)和漆酶(Laccase from Trametesversicolor)中的至少一种；
[0022]所述酶的酶活及其定义如下:
[0023]所述南极假丝酵母脂肪酶B的酶活为5_15U/mg，具体为9U/mg ;酶活力单位U定义为在pH8.0，40° 1:条件下，每分钟水解三丁酸甘油酯产生I微摩尔(μ mol) 丁酸所需的酶量;
[0024]所述褶皱假丝酵母脂肪酶的酶活为≥700U/mg,具体为700-1，000U/mg ;酶活力单位U定义为在pH7.2，37° 1:条件下，每小时水解三丁酸甘油酯产生I微摩尔(μ mol)脂肪酸所需的酶量；
[0025]所述米黑根毛霉脂肪酶的酶活为≥20，000U/g,具体为20，000-25，000U/g ;酶活力单位U定义为在pH7.0，37° 1:下，每分钟水解三丁酸甘油酯产生I微摩尔(μ mol)的脂肪酸所需的酶量；
[0026]所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的酶活为> 100，000U/g，具体为100，000-180, 000U/g ;酶活力单位U定义为在ρΗ7.0, 37° °C下，每分钟水解三丁酸甘油酯产生I微摩尔(μ mol)的脂肪酸所需的酶量；
[0027]所述猪胰腺脂肪酶的酶活为≥100，000U/g,具体为100，000-400，000U/g ;酶活力单位U定义为在pH7.7，37° 1:下，每分钟水解橄榄油产生I微摩尔(μ mol)的脂肪酸所需的酶量；
[0028]所述胰凝乳蛋白酶的酶活为> 40U/mg，具体为40_60U/mg ;酶活力单位U定义为在pH7.8，25° °C条件下，每分钟水解I微摩尔(μ mol)的BTEE (N-苯甲酰-L-酪氨酸乙酯)产生N-苯甲酰-L-酪氨酸所需的酶量；
[0029]所述乙醇脱氢酶的酶活为≥10.0U/mL，具体为10_16U/mL ;酶活力单位U定义为在pH7.0，30° °C条件下，每分钟还原I微摩尔(μ mol)的苯甲醛产生苯甲醇所需的酶量；[0030]所述细胞色素C的酶活为8_20U/mg，具体为12U/mg ;酶活力单位U定义为在pH7.0，30° °C条件下，每分钟催化I微摩尔(μ mol)的2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和过氧化氢产生阳离子自由基ABTS+.所需的酶量；
[0031]所述葡萄糖氧化酶的酶活为100，000-250, 000U/g，具体为150，000U/g ;酶活力单位U定义为在pH5.1，35° °C条件下，每分钟将I微摩尔(μ mol)的β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸内酯和过氧化氢所需的酶量；
[0032]所述辣根过氧化物酶的酶活为250_330U/mg，具体为300U/mg ;酶活力单位U定义为在pH6.0, 20° 1:条件下，每20秒将Img的邻苯三酚氧化为红掊酚所需的酶量；
[0033]所述漆酶的酶活为≥0.5U/mg,具体为0.5-0.8U/mg ;酶活力单位U定义为在PH6.0，20° 1:条件下，每分钟氧化I微摩尔(μ mol)的邻苯二酚产生邻苯二醌所需的酶量；
[0034]所述缓冲溶液的pH值为7-10 ;具体选自下述化合物水溶液中的至少一种:磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硼酸、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾；浓度为5-100mM，具体为10-50mM ；
[0035]所述还原剂为能将亚胺结构还原为胺的试剂；
[0036]所述还原剂具体选自硼氢化钠和氰基硼氢化钠中的至少一种。
[0037]所述高分子化合物、活化剂、酶和还原剂的质量比为50-500:5-100:10:5_50，具体为 10-350:5-60:10: 10-40 ；
[0038]所述步骤I)中，所述高分子化合物在有机溶剂中的质量百分浓度为I~5% ；
[0039]所述步骤I)中，反应温度为室温，时间为10-24小时；
[0040]所述步骤2)中，反应温度均为室温。
[0041]另外，按照上述方法制备得到的酶-高分子结合物，酶的部分表面氨基与高分子的端醛基通过化学反应形成共价连接；该酶-高分子结合物可在有机溶剂中形成纳米颗粒，具有有机相温敏性及催化活性，以及以该酶-高分子结合物为活性成分的催化剂，也属于本发明的保护范围。其中，所述酶催化剂的粒径为10-200nm，具体为20-80nm，更具体为20、25、30、50、20-50、25-50、30-50、25-30 或 20_30nm。
[0042]所述有机溶剂选自甲苯、甲醇、氯仿和四氢呋喃中的至少一种。
[0043]本发明提供的酶-高分子结合物，可以在常规催化反应温度下(如40°C)，溶解在常见的有机溶剂中，具有较高的催化活性。酶分子表面共价连接的易溶于有机溶剂的高分子，赋予了该结合物在有机相中可达到纳米级分散的特性，强化了底物与酶之间的传质过程，有助于提高酶-高分子结合物的活性。另一方面，酶分子的亲水性使得结合物在有机相中的溶解度对温度更为敏感。在低温(4°C)条件下可使纳米级分散的结合物形成团聚沉淀，从而实现催化剂与反应体系的分离，便于酶催化剂的循环使用。同时，酶表面的高分子在升温溶解-降温沉淀析出的过程中对酶的空间构象起到了保护的作用。该结合物纳米颗粒在有机相生物催化领域具有广泛的应用前景。其制备方法反应条件温和，虽然对酶分子进行了共价修饰，但仍保留了大部分酶活。且选用原料高分子为工业化产品，易于获得，成本较低，较易于工业实施和放大。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1为酶-高分子结合物的结构示意图及其温度敏感性。[0045]图2为天然酶及其对应的酶-高分子结合物的SDS-PAGE电泳图(南极假丝酵母脂肪酶B (CALB);褶皱假丝酵母脂肪酶(CRL);细胞色素C (Cyt C))
[0046]图3为利用高分辨率透射电镜观察本发明所述的酶-高分子结合物纳米颗粒的形态图(甲苯分散制样，a)南极假丝酵母脂肪酶B ;B)褶皱假丝酵母脂肪酶；C)细胞色素C，嵌入照片为细胞色素C天然蛋白(左)及结合物(右)在甲苯中分散的情况)。
[0047]图4为本发明酶-高分子结合物纳米颗粒和天然酶的有机相催化活性对比图。
[0048]图5为本发明酶-高分子结合物纳米颗粒(南极假丝酵母脂肪酶B)在有机溶剂中多次升温降温循环的催化活性变化图。
【具体实施方式】
[0049]下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
[0050]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0051]本发明中所用南极假丝酵母脂肪酶B (Lipase B Candida antarctica)购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为62288 ；
[0052]裙皱假丝酵母脂肪酶(Lipase from Candida rugosa)购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为L1754 ；
[0053]米黑根毛霉脂肪酶(Lipase from Rhizomucormiehei)购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为L4277 ；
[0054]疏棉状嗜热丝抱菌脂肪酶(Lipase from Thermomyceslanuginosus)购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为L0777 ；
[0055]膜凝乳蛋白酶(a-Chymotrypsin from bovine pancreas)购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为C4129 ；
[0056]乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase equine)购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为79854 ；
[0057]细胞色素C (Cytochrome c from equine heart)购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为C7752 ；
[0058]葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase from Aspergillusniger)购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为G7141 ；
[0059]辣根过氧化物酶(Peroxidase from horseradish)购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为P8375 ；
[0060]漆酶(Laccase from Trametesversicolor)购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为 38429。
[0061]实施例1
[0062]酶为南极假丝酵母脂肪酶B (酶活为9U/mg)以重量计为10份，高分子化合物为平均分子量为12，600的Pluronic? F-127以重量计为60份，活化剂戴斯-马丁氧化剂以重量计为10份，还原剂为氰基硼氢化钠以重量计为6份。
[0063]I)将上述配比的高分子及高分子活化剂溶解在二氯甲烷中，在室温下进行氧化反应15小时，将端羟基氧化为醛基，之后加入冷乙醚沉淀得到活化的高分子产物，真空干燥；[0064]2)将步骤I)所得活化的高分子化合物和酶溶解在pH值为7的IOmM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，室温进行醛基与氨基的偶联反应2小时后，加入还原剂进行碳-氮双键的还原反应18小时，使偶联形成的碳-氮双键还原为稳定的碳-氮单键。产物经过透析后，冻干得到本发明提供的酶-高分子结合物。
[0065]效果评价:
[0066]1、按照如下方法测定水相中的酶活:
[0067]首先将对硝基酚丁酸酯溶解在丙酮中，然后在搅拌下缓慢加入到含有1.25%(w/v)的Triton X-100的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(50mM，pH7.0)中配制成0.5mM的底物溶液，溶液中丙酮浓度控制在5% (v/v)0测活时，将一定量酶液加入到0.5mM的底物溶液中，混合10秒后在紫外分光光度计上测定348nm处的吸收值在I分钟时间内的变化，获得吸光度-时间曲线，不同酶催化剂的曲线的斜率之比即酶活之比。
[0068]所得结果为:室温下，该实施例所得酶-高分子结合物的水相生物催化活性为等当量天然酶(南极假丝酵母脂肪酶B，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为62288)的95%。
[0069]2、如图1所示，在该酶-高分子结合物中，高分子的端基与酶表面的氨基形成化学键连接。该高分子在有机溶剂中具有良好的溶解度，从而赋予了该结合物在有机相中达到纳米级分散的特性。
[0070]3、利用SDS-PAGE结果(图2)可知，几乎所有酶分子都被连接上至少一个高分子链，分子量比天然酶相比有明显的提高。
[0071]4、利用高分辨透射电镜观察上述酶-高分子结合物颗粒的形态(在甲苯中分散制样)，结果如图3a所示，平均粒径为20nm，粒径分布较为均匀。纳米级分散强化了底物与酶之间的传质过程，有助于提高酶-高分子结合物的活性。
[0072]5、按照如下方法测定有机相中酶活:
[0073]5ml己酸(0.lmol/L)和正丁醇(0.lmol/L)的甲苯溶液置于摇床(40°C,200转/分钟)中，加入酶含量为0.5mg的酶-高分子结合物，对照组加入等当量的天然酶粉(南极假丝酵母脂肪酶B，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为62288)。20min后加入IOml乙醇/丙酮(1/1，v/v)混合溶剂终止反应。未反应的己酸的量通过0.05mol/ml的氢氧化钠溶液滴定(苯酚为指示剂)测定，从而计算酶活。
[0074]所得结果为:如图4所示，40°C下，在甲苯溶剂中该实施例所得酶-高分子结合物的生物催化活性为等当量天然酶粉(南极假丝酵母脂肪酶B，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为62288)的68倍。
[0075]6、酶分子的亲水性使得结合物在有机相中的溶解度对温度更为敏感。
[0076]在1%浓度下，低温(4°C)可使纳米级分散的结合物形成团聚沉淀，从而实现催化剂与反应体系的分离，便于酶催化剂的循环使用。同时，酶表面的高分子在升温溶解-降温沉淀析出的过程中对酶的空间构象起到了保护的作用。
[0077]7、图5表明，该酶-高分子结合物在有机相中经过10次升温溶解-降温沉淀析出的循环后，仍然保持了 95%以上的活性。该实验过程如下:将适量的酶-高分子结合物加入到甲苯中，质量浓度为1%，40°C恒温2小时，取一定量测定有机相酶活(第I个数据点)；剩余酶液在4°C下恒温2小时，再在40°C下恒温2小时，取一定量测定有机相酶活(第2个数据点)，以此类推。[0078]实施例2
[0079]按照实施例1的步骤，仅将步骤I)和2)的原料按下述替换，得到本发明提供的酶-高分子结合物:
[0080]酶为褶皱假丝酵母脂肪酶(酶活为700-1000U/mg)以重量计为10份，高分子为平均分子量为12，600的PIuroniC I '-127以重量计为72份，高分子活化剂为戴斯-马丁氧化剂以重量计为12份，还原剂为氰基硼氢化钠以重量计为7份。
[0081]该酶-高分子结合物SDS-PAGE结果如图2所示。
[0082]在甲苯中分散后粒径为25nm (图3b)。
[0083]效果评价:
[0084]1、按照如下方法测定水相中的酶活:首先将对硝基酚棕榈酸酯溶解在丙酮中，然后在搅拌下缓慢加入到含有1.25%(w/v)的Triton X-100的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(50mM，pH7.0)中配制成0.5mM的底物溶液，溶液中丙酮浓度控制在5% (v/v)。测活时，一定量酶液加入到0.5mM的底物溶液中，混合10秒后在紫外分光光度计上测定348nm处的吸收值在I分钟时间内的变化，获得吸光度-时间曲线，不同酶催化剂的曲线的斜率之比即酶活之比。
[0085]所得结果为:室温下，该实施例所得酶-高分子结合物的水相生物催化活性为等当量天然酶粉(褶皱假丝酵母脂肪酶，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为L1754)的70%。
[0086]2、按照如下方法测定有机相中的酶活:5ml棕榈酸(0.lmol/L)和正辛醇(0.1mol/L)的甲苯溶液置于摇床(40°C，200转/分钟)中，加入酶含量为0.5mg的酶-高分子结合物，对照组加入等当量的天然酶粉(褶皱假丝酵母脂肪酶，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为L1754)。20min后加入IOml乙醇/丙酮(1/1，v/v)混合溶剂终止反应。未反应的己酸的量通过0.05mol/ml的氢氧化钠溶液滴定(苯酚为指示剂)测定，从而计算酶活。
[0087]所得结果为:40°C下，以棕榈酸、正辛醇作为底物在甲苯溶剂(有机相)中测量酶-高分子结合物的生物催化活性为天然酶粉(褶皱假丝酵母脂肪酶，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为L1754)的58倍。
[0088]实施例3
[0089]酶为细胞色素C (酶活为12U/mg)以重量计为10份,高分子化合物为PIumnicWF-127以重量计为300份，活化剂为戴斯-马丁氧化剂以重量计为50份，还原剂为氰基硼氢化钠以重量计为30份。
[0090]后续步骤与实施例1相同。
[0091]该结合物SDS-PAGE结果如图2所示，其在甲苯中分散后粒径为30nm (图3c)。
[0092]效果评价:
[0093]1、按照如下方法测定水相中的酶活:960 ii L ABTS水溶液(2.8mg/mL)和20 y L酶-高分子结合物(酶含量为0.lmg/ml)混合，对照组加入等当量的天然酶水溶液(细胞色素C，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为C7752)。加入20ii L过氧化氢水溶液(0.3%v/V )引发反应，测定415nm的吸光度随时间变化曲线(一分钟内为一直线)，其斜率即代表相对酶活。
[0094]所得结果为:室温下，该实施例所得酶-高分子结合物的水相生物催化活性为等当量天然酶细胞色素C (购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为C7752)的580%。
[0095]2、按照与测定水相酶活的方法相同的步骤，即将底物和酶的溶液中的溶剂替换为甲醇后，测定在有机相中的酶活。
[0096]所得结果为:室温下，该实施例所得酶-高分子结合物在甲醇溶剂(有机相)中的生物催化活性为天然酶粉(细胞色素C，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为C7752)的670 倍。
[0097]实施例4
[0098]将实施例1中的高分子改为40份平均分子量为8，350的IMutOiiic叱[6S:
[0099]其余配方和步骤与实施例1相同。
[0100]所得酶-高分子结合物的粒径为30nm。
[0101]效果评价:
[0102]1、按照实施例1中测定水相和有机相中的酶活的方法，所得结果为:室温下，该实施例所得酶-高分子结合物的水相生物催化活性为等当量天然酶粉(南极假丝酵母脂肪酶B，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为62288)的90%。
[0103]40°C下，以脂肪酸、醇类作为底物在甲苯溶剂(有机相)中测量酶-高分子结合物的生物催化活性为天然酶粉(南极假丝酵母脂肪酶B，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为62288)的 62 倍。
[0104]实施例5
[0105]将实施例1中的高分子化合物替换为15份平均分子量为2，800的PIuronic?L-81；
[0106]其余配方和步骤与实施例1相同。
[0107]所得酶-高分子结合物的粒径为50nm。
[0108]效果评价:
[0109]1、按照实施例1中测定水相和有机相中的酶活的方法，所得结果为:该实施例所得酶-高分子结合物的水相生物催化活性为等当量天然酶粉(南极假丝酵母脂肪酶B，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为62288)的95%。40°C下，以脂肪酸、醇类作为底物在甲苯溶剂(有机相)中测量酶-高分子结合物的生物催化活性为天然酶粉(南极假丝酵母脂肪酶B，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为62288)的40倍。
[0110]实施例6-8
[0111]将实施例1中的缓冲液分别改为pH为8的IOmM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、pH为9的IOmM硼酸-硼砂缓冲液、pH为10的IOmM硼酸-硼砂缓冲液；
[0112]其余配方和步骤与实施例1相同。
[0113]所得酶-高分子结合物的粒径为20nm。
[0114]此时，得到的产物的水相和有机相催化活性与实施例1相当。
[0115]比较例1:酶为南极假丝酵母脂肪酶B (酶活为9U/mg)以重量计为10份，高分子为Pluronic妒F-!27以重量计为60份。
[0116]在pH为7的IOmM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中混合冻干，得到酶与高分子物理混合的产物。该混合物在有机相中不形成纳米颗粒，但对有机相催化活性有一定的促进作用。[0117]40°C下，以脂肪酸、醇类作为底物在甲苯溶剂(有机相)中测量酶-高分子结合物的生物催化活性为天然酶粉(南极假丝酵母脂肪酶B，购自西格玛奥德里奇公司，产品编号为62288)的 5 倍。
[0118]比较例2:将实施例1中的加入还原剂的步骤去掉，其余配方和步骤与实施例1相同。
[0119]所得酶-高分子结合物中，酶与高分子共价连接效率低，产物在有机相中不形成纳米颗粒。40°C下，以脂肪酸、醇类作为底物在甲苯溶剂(有机相)中测量酶-高分子结合物的生物催化活性与比较例I相当。
[0120]本发明可用其它的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含有和范围内的任何改变，都应当认 为是包括在权利要求书的范围内。
【权利要求】
1.一种制备酶-高分子结合物的方法，包括如下步骤: 1)将高分子化合物和活化剂溶于有机溶剂中进行氧化反应后，加入沉淀剂进行沉淀，所得沉淀即为活化的高分子化合物； 2)将步骤I)所得活化的高分子化合物和酶于缓冲溶液中进行醛基与氨基的偶联反应0.5-4小时后，再加入还原剂进行碳-氮双键的还原反应10-20小时，得到所述酶-高分子结合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤I)中，所述高分子化合物为嵌段结构为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯的聚醚类嵌段共聚物； 所述高分子化合物的平均分子量为500-20000，具体为1100-12600 ； 所述高分子化合物具体选自
Pluronic? F-127、 Pluronic? F-68、Pluronic? P-123、Plurcmic.? L-81 和
Pluronic? L-31中的至少一种； 其中，所述Pluronic? F-127的平均分子量为12，600 ； 所述Pluronic? F-68的平均分子量为8，350 ； 所述Pluronic? P-123的平均分子量为5，800 ； 所述Pluronic? L-81的平均分子量为2，800 ； 所述Pluronic? L-31的平均分子量为I, 100 ； 所述活化剂为能将羟基氧化为醛基的试剂；具体选自铬类氧化剂和高价态碘化合物中的至少一种； 其中，所述铬类氧化剂具体选自重铬酸吡啶盐和氯铬酸吡啶盐中的至少一种； 所述高价态碘化合物具体选自戴斯-马丁氧化剂和2-碘酰基苯甲酸中的至少一种； 所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿和甲苯中的至少一种； 所述沉淀剂选自乙醚、石油醚和正己烷中的至少一种； 所述步骤2)中，所述酶选自南极假丝酵母脂肪酶B、褶皱假丝酵母脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、猪胰腺脂肪酶、胰凝乳蛋白酶、乙醇脱氢酶、细胞色素C、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和漆酶中的至少一种； 所述南极假丝酵母脂肪酶B的酶活为5-15U/mg，具体为9U/mg ； 所述褶皱假丝酵母脂肪酶的酶活为> 700U/mg，具体为700-1，000U/mg ； 所述米黑根毛霉脂肪酶的酶活为> 20，000U/g，具体为20，000-25, 000U/g ； 所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的酶活为≥100, 000U/g，具体为100，000-180, 000U/g ； 所述猪胰腺脂肪酶的酶活为≥100, 000U/g，具体为100，000-400, 000U/g ； 所述胰凝乳蛋白酶的酶活为≥40U/mg，具体为40-60U/mg ； 所述乙醇脱氢酶的酶活为≥10.0U/mL，具体为10-16U/mL ； 所述细胞色素C的酶活为8-20U/mg,具体为12U/mg ； 所述葡萄糖氧化酶的酶活为100，000-250, 000U/g，具体为150，000U/g ； 所述辣根过氧化物酶的酶活为250-330U/mg，具体为300U/mg ； 所述漆酶的酶活为≥0.5U/mg，具体为0.5-0.8U/mg ； 所述缓冲溶液的pH值为7-10 ;具体选自下述化合物的水溶液中的至少一种:磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硼酸、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾； 所述缓冲溶液的浓度为5-100mM，具体为10-50mM ； 所述还原剂为能将亚胺结构还原为胺的试剂； 所述还原剂具体选自硼氢化钠和氰基硼氢化钠中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述高分子化合物、活化剂、酶和还原剂的质量比为 5-500:5-100:10:5-50，具体为 10-350:5_60:10:10-40。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述步骤I)中，所述高分子化合物在有机溶剂中的质量百分浓度为I-5%。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述步骤I)中，反应温度为室温，时间为10-24小时； 所述步骤2)中，反应温度均为室温。
6.权利要求1-5任一所述方法制备得到的酶-高分子结合物。
7.根据权利要求6 所述的酶-高分子结合物，其特征在于:所述酶-高分子结合物在有机溶剂中形成的颗粒粒径为10-200nm，具体为20_80nm。
8.根据权利要求7所述的酶-高分子结合物，其特征在于:所述有机溶剂选自甲苯、甲醇、氯仿和四氢呋喃的至少一种。
9.以权利要求6-8任一所述酶-高分子结合物为活性成分的催化剂。
【文档编号】C12N11/08GK103451174SQ201310431680
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】朱晶莹, 戈钧, 张一飞, 卢滇楠, 刘铮 申请人:清华大学