利用rt-lamp快速检测甘蔗花叶病毒的方法
【专利摘要】一种利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法，包括如下步骤：根据NCBI上提供的甘蔗花叶病毒的序列设计4条LAMP特异引物F3、B3、FIP、BIP，样品提取RNA反转录成cDNA之后进行RT-LAMP反应，通过对反应体系的设计和优化，在一个恒温水浴锅反应1h可以完成扩增，扩增产物可以通过电泳或者荧光染料实现检测，是一种操作简单、快速、灵敏而经济的检测方法。
【专利说明】利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及快速检测甘蔗花叶病毒的方法，具体是一种利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法。
技术背景
[0002]甘鹿花叶病毒(Sorghum mosaic virus)是甘鹿的一种主要病毒病,属于马铃薯Y病毒属的甘蔗花叶病毒亚组成员。甘蔗花叶病的症状主要表现在叶片上。但染病蔗株可使整丛发病，病毒遍及全株。主要是叶绿素受到破坏或不正常发展而使叶部产生许多与叶脉平行的纵短条纹。其长短不一，有的浅黄色、有的浅绿色，与正常部分参差间隔成“花叶”。尤以新叶症状最为明显。染病蔗株矮化，分蘖减少；宿根病蔗则发芽缓慢、生长不良。本病造成的损失主要是蔗种感病后，萌芽率低；病株生长差，汁液量减少。
[0003]环介导恒温核酸扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是由Notomi T等在2000年发明的，是一种基于高灵敏链置换技术的恒温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件^1_65°C左右)下保温几十分钟，即可实现核酸的扩增。反应结果可通过反应副产物焦磷酸镁白色沉淀的形成进行肉眼观察，或者通过浊度仪检测焦磷酸镁白色沉淀的混浊度来判定，也可在反应管中加入荧光染色试剂目测判定，无需特殊的仪器PCR仪，具有特异性强、灵敏度高等优点，是一种快捷而有效的检测方法。目前已广泛的应用于人类和动植物各种病毒、细菌、真菌、寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断。
[0004]目前鉴定植物病毒常用的方法有:生物学接种实验，血清学检测，电镜观察及分子生物学检测。其中分子生物学方法以PCR最为常见，但是PCR费时且需要昂贵的仪器PCR仪；而血清学检测方法中，较为常见的有ELISA及DIBA等，但是灵敏度不够高，特异性易受到限制。目前尚未见到使用LAMP方法检测甘蔗花叶病毒的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法，能够灵敏、特异的检测出甘蔗花叶病毒。
[0006]为解决上述问题，本发明采用的技术方案是:一种利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法，包括如下步骤:
[0007]I)根据NCBI已报道的甘蔗花叶病毒的CP蛋白的核苷酸序列，通过多序列比对选择相对保守序列，通过在线LAMP引物设计软件primerExplorer V4设计4条引物,其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP ；
[0008]2)利用RNAiso Plus法提取甘蔗植株的总RNA ；
[0009]3 )利用M-MLV反转录酶把提取的RNA转化为cDNA ；
[0010]4)设置不同的Mg2+浓度、dNTPs的浓度以及甜菜碱的浓度，确定最佳反应体系；分别改变反应的温度进行RT-LAMP扩增反应，RT-LAMP反应温度为63°C，反应时间为60_80min ；
[0011]5) RT-LAMP反应体系为:外引物F3和B3各0.25 μ M，内引物FIP和BIP各
1.5 μ M，Bst DNA 聚合酶(8U) I μ L, IOXBst buffer2.5 μ L，甜菜碱 2 μ L，25mM MgS041 μ L,dNTPl.4mM，模版2μ L，DEPC处理的灭菌水加至25 μ L，63°C条件下反应时间为60min，80°C灭活5min ;以未感染样品作为阴性对照验证这一方法的特异性；
[0012]6)实验结果通过肉眼判断和利用1.5%的电泳检测进行验证或者荧光染料检测可以检测出甘蔗花叶病毒。
[0013]所述2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP的序列为:
[0014]F3:5-TGGAYGGAGATGAACAAAGA-3
[0015]B3:5-AATGCATACCGCGCTAAG-3
[0016]FIP:5-GCTGCATCACTGAAATGATGCATTA-CCRTTAAAACCAGTTA
[0017]TTGAAAACG-3
[0018]BIP:5-TCGAGTAYAGAAACTCTACAGAGCG-TATAGTCGGTGAGATTT
[0019]CGC-3。
[0020]本发明的突出优点在 于:
[0021]利用LAMP方法既保证了检测的灵敏性和特异性，同时又简化了操作，并且也节省了成本，为甘蔗花叶病毒的检测提供了一种灵敏、特异、经济且简单的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为不同温度条件下RT-LAMP结果的电泳图(M:标准分子量；1、61°C ;2、62°C ；
3、63°C ;4、64°C ;5、65°C ；6 阴性对照)。；
[0023]图2为电泳检测甘蔗花叶病毒的结果(Μ:标准分子量；1、甘蔗花叶病毒；2、阴性对照)【具体实施方式】
[0024]实施例1
[0025]本发明所述的利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法，包括如下步骤:
[0026]甘蔗花叶病毒RT-LAMP反应条件的优化
[0027]1、引物的设计:
[0028]F3:5-TGGAYGGAGATGAACAAAGA-3
[0029]Β3:5-AATGCATACCGCGCTAAG-3
[0030]FIP:5-GCTGCATCACTGAAATGATGCATTA-CCRTTAAAACCAGTTATTGAA
[0031]AACG-3
[0032]BIP:5-TCGAGTAYAGAAACTCTACAGAGCG-TATAGTCGGTGAGATTTCGC-3
[0033]甘蔗花叶病毒RT-LAMP的温度梯度实验
[0034]RT-LAMP反应体系为:外引物F3和Β3各0.25 μ Μ,内引物FIP和BIP各1.5 μ M，BstDNA聚合酶(8U)1 μ L, IOXBst buffer2.5 μ L，甜菜碱2 μ L，25mM MgS041 μ L, dNTPl.4mM，模版2μ L，DEPC处理的灭菌水加至25 μ L。混匀反应物在61°C，62 °C, 63 °C，64°C，65°C五种条件下恒温反应lh，80°C反应5min终止RT-LAMP反应，实验结束之后取10 μ L扩增产物上样，在1.5%的琼脂糖胶上进行电泳，结果显示在61 °C、62°C，63°C恒温反应条件下有阶梯状扩增条带，但是63°C条带很清晰，而64°C、65°C恒温反应以及阴性对照无阶梯状扩增条带，如图1所示，因此，本发明采用的RT-LAMP的反应温度为63°C。
[0035]实施例2
[0036]甘蔗花叶病毒RT-LAMP反应的特异性试验
[0037]为了验证RT-LAMP的特异性，选择未感染甘蔗花叶病毒的材料作为对照，结果显示阴性对照没有出现阶梯状扩增条带，而有甘蔗花叶病毒的样本扩增出目的产物，如图2所示，这表明该RT-LAMP反应的特异性`较好。
【权利要求】
1.利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)根据NCBI已报道的甘蔗花叶病毒的CP蛋白的核苷酸序列，通过多序列比对选择相对保守序列，通过在线LAMP引物设计软件primerExplorer V4设计4条引物,其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP ； 2)利用RNAisoPlus法提取甘蔗植株的总RNA ； 3)利用M-MLV反转录酶把提取的RNA转化为cDNA； 4)设置不同的Mg2+浓度、dNTPs的浓度以及甜菜碱的浓度，确定最佳反应体系；分别改变反应的温度进行RT-LAMP扩增反应，RT-LAMP反应温度为63°C，反应时间为60_80min ； 5)RT-LAMP反应体系为:外引物F3和B3各0.25 μ M,内引物FIP和BIP各1.5 μ M，BstDNA 聚合酶(8U) I μ L，IOXBst buffer2.5 μ L，甜菜碱 2 μ L，25mM MgS041 μ L，dNTPl.4mM,模版2μ L，DEPC处理的灭菌水加至25μ L，63°C条件下反应时间为60min，80°C灭活5min ；以未感染样品作为阴性对照验证这一方法的特异性； 6)实验结果通过肉眼判断和利用1.5%的电泳检测进行验证或者荧光染料检测可以检测出甘蔗花叶病毒。
2.根据权利要求1所述的利用RT-LAMP快速检测甘蔗花叶病毒的方法，其特征在于，所述2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP的序列为:
F3:5-TGGAYGGAGATGAACAAAGA-3
B3:5-AATGCATACCGCGCTAAG-3
FIP:5-GCTGCATCACTGAAATGATGCATTA-CCRTTAAAACCAGTTA
TTGAAAACG-3
BIP:5-TCGAGTAYAGAAACTCTACAGAGCG-TATAGTCGGTGAGATTT
CGC-3。
【文档编号】C12Q1/68GK103484569SQ201310438344
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】温荣辉, 陈保善, 司慧娟, 吕榜丽, 周龙武, 徐正赢, 袁小宁, 唐瑶 申请人:广西大学