基于dns分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，所述方法包括培养基的制备、固态发酵、粗酶液的制备、酶催化反应、DNS法分析还原糖生成量等步骤，所述DNS法是采用2,4-二硝基水杨酸即DNS分析所述酶催化反应的还原糖生成量，即取0.2mL反应液与0.6mLDNS溶液混合，摇匀，100°C水浴15min，随即取出用自来水冷却，再用蒸馏水定容至5mL，于520nm波长下测定吸光值，依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量。本方法可实现快速优化柚苷酶催化柚皮苷的目的，并进一步优化了催化条件，在此条件下，柚皮苷的转化率得到了很大的提高。
【专利说明】基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物催化的【技术领域】，尤其涉及一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法。
【背景技术】
[0002]柚皮苷(4，5，7-trihydroxyf lavanone-7- β -L-rhamnoglucoside- (I, 2) - a -D-glucopyranoside)是一种二氢黄酮糖苷类化合物,它是芸香科植物,如葡萄柚、蜜柚、酸橙等的主要苦味物质，具有抗溃疡、消炎、抗氧化及抑菌等一系列的生物活性，在食品、药品及化妆品等领域具有很好的应用前景。然而，柚皮苷在常温下的溶解性较差，以致其在工业上的应用受到了较大程度的限制，为改善其水溶性或脂溶性，或提高其生理活性、增加新的功能等，进而提高其生物利用度，目前国内外主要采用化学法和酶法对柚皮苷进行改性研究，相比于化学改性法，酶法改性柚皮苷具有选择性强，反应条件温和，产物易分离及对环境危害小等优点，因而具有更好的研究意义和价值。
[0003]柚苷酶是由a-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成的复合酶，它催化柚皮苷的水解反应主要有两个过程:首先，柚皮苷在a -L-鼠李糖苷酶的作用下分解成鼠李糖和普鲁宁，其次，普鲁宁又在β-D-葡萄糖苷酶的作用下分解成葡萄糖和柚皮素。
[0004]在现有技术中，通常采用高效液相色谱法检测柚皮苷的减少量或柚皮素的生成量，来分析柚皮苷的水解过程。在中国专利号为200510014880.9，名称为《一种胃肠安丸中柚皮苷含量的测定方法》及中国专利号为200910073856.0，名称为《接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法》两篇专利文献中，均是通过高效液相色谱法的方法来测定柚皮苷的含量，虽然，此方法准确度高，但是这种方法较为繁琐耗时，对于柚皮苷的大规模测定，例如，在发酵条件优化时，需要消耗大量的人力物力。
[0005]鉴于柚苷酶催化柚皮苷生成柚皮素的过程同时也是还原糖生成的过程，且在此过程中还原糖的生成应与柚皮苷的水解和柚皮素的生成具有相关性。因此，本发明人研究和设计了一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，本案由此产生。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，通过DNS分析柚苷酶催化柚皮苷反应过程中产生的鼠李糖还原糖及葡萄糖还原糖的含量，达到快速优化柚苷酶催化柚皮苷的目的，并进一步分析了不同工艺参数对柚皮苷转化过程的影响，进而为利用柚苷酶改性柚皮苷获得特定生物活性的改性产物提供了研究基础。
[0007]为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下:
一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，本方法包括以下步骤:步骤一、培养基的制备:所述培养基的制备包括斜面培养基的制备及固态培养基的制备，其中:所述斜面培养基的制备，按以下质量体积浓度的组分制备=MgSO4.7Η20 1.0 g/L,KH2PO4 1.0 g/L, (MM)2SO4 1.5 g/L,KCl 0.5 g/L,KNO3 1.5 g/L，无水 CaCl2 0.1 g/L，酵母提取物2.0 g/L，柚皮苷2.5 g/L，琼脂20 g/L，初始pH 6.0,1X105 Pa灭菌20 min ;所述固态培养基的制备，按以下重量的组分制备:柚皮粉160g，豆饼粉24g，麸皮1%，KNO3 1%，固水比为 1:1.5,IXlO5 Pa 灭菌 20 min ；
步骤二、固态发酵:将棘孢曲霉菌种接种于所述斜面培养基上，28° C培养3-4d，使所述斜面培养基上长满孢子，用无菌生理盐水洗下孢子，并用无菌生理盐水调整菌悬液OD值至0.2，将I mL单孢子菌悬液接入装有所述固态培养基的250 mL的三角瓶中，每瓶装样量为5 g，于28° C下培养7-8 d； 步骤三、粗酶液的制备:以1:20的固液比，用磷酸盐缓冲液对固态发酵物进行浸泡Ih，搅匀后抽滤并收集滤液，将所述滤液于4° C以12000Xg离心10 min，收集上清液即得粗酶液，于0-4° C下保藏备用；
步骤四、酶催化反应:所述酶催化反应为游离柚皮苷的酶催化反应和/或固定化柚皮苷的酶催化反应，其中，所述游离柚皮苷的酶催化反应为:在50 mL的反应体系中，柚皮苷浓度为0.04-0.24g/100 mL，酶用量为4-12 U/mL，以浓度为0.02 mol/L醋酸-醋酸钠溶液为缓冲液，反应PH值为3.0-7.0，置于恒温振荡水槽中，反应温度为30-70° C，振荡反应4h,振速为0-160次/min,从加入酶液开始计时,每30 min取反应液一次,沸水灭活后,冷却至室温；所述固定化柚皮苷的酶催化反应为:在50 mL的反应体系中，加入I g湿重的树脂，柚皮苷浓度为0.08-0.24g/100 mL，酶用量为4-12 U/mL，以浓度为0.02 mol/L醋酸-醋酸钠溶液为缓冲液，反应PH值为3.0-7.0，置于恒温振荡水槽中，反应温度为30-70° C，振荡反应4 h，振速为0-160次/min，期间从加入酶液开始计时，每隔一段时间取反应液一次，并立即用沸水浴灭活20 min，冷却至室温；在其他条件不变的情况下，分别对所述的柚皮苷浓度、酶用量、反应PH值、反应温度及振速进行单因素试验，以确定最佳反应条件；
步骤五、DNS法分析还原糖生成量:采用2，4- 二硝基水杨酸即DNS分析所述酶催化反应的还原糖生成量:取0.2 mL所述反应液与0.6 mL DNS溶液混合，摇匀，100° C水浴15min,随即取出用自来水冷却,再用蒸懼水定容至5 mL,于520 nm波长下测定吸光值,依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量，其中，绘制标准曲线时，以等摩尔比的鼠李糖和葡萄糖组成的混合溶液为标准溶液，其浓度为0-2 mg/mL。
[0008]作为实施例的优选方式，所述步骤四中，所述游离柚皮苷的酶催化反应中，柚皮苷浓度为0.2 g/100 mL，酶用量为8 U/mL, pH值为5.0，反应温度为50° C，酶解反应120 min。
[0009]作为实施例的优选方式，所述步骤四中，所述固定化柚皮苷的酶催化反应中，柚皮苷浓度为0.2 g/100 mL，酶用量为8 U/mL, pH值为5.0，反应温度为50° C，振速为80次/min,酶解反应6 h。
[0010]作为实施例的优选方式，所述方法还包括酶解产物的分离纯化步骤，即在酶催化反应结束后，立即沸水浴灭活20 min，冷却至室温，过滤收集树脂，装柱后，先用蒸馏水以ImL/min的流速进行清洗，然后用一定体积浓度的乙醇进行洗脱，用分步收集器分段收集洗脱液，同时采用薄层色谱法对洗脱液中的成分进行跟踪检测定性，将成分相同，即斑点相同的洗脱液进行合并，并将洗脱液进行减压蒸馏浓缩得浓缩物，同时回收乙醇，然后再将浓缩物用甲醇重结晶，得酶解产物纯品，即柚皮素纯品。
[0011]作为实施例的优选方式，所述方法还包括酶解产物的定性分析步骤，即在收集所述柚皮素纯品后，称取所述柚皮素纯品及柚皮素标准品，用甲醇溶解并定容后，分别采用紫外分光光度、红外光谱和高效液相色谱HPLC法对所述柚皮素纯品进行定性分析和纯度测定。
[0012]作为实施例的优选方式，所述方法还包括柚苷酶活力的测定步骤，即在收集所述粗酶液后，在1.9 mL ,pH 5.0磷酸盐缓冲液试管中，加入0.1 mL粗酶液混匀，于50° C水浴中预热5 min，再加入2 mL，300 mg/L柚皮苷标准液，50° C，反应5 min后，于100° C水浴加热20 min使酶失活，取出后迅速冷却至室温，将反应得到的样品移至1.5 mL离心管，12 000Xg离心15 min，HPLC待测，对照组为先将粗酶液灭活后再加入柚皮苷标准液，其他操作相同；以在50° C、pH 5.0的条件下,每分钟生成I μ g柚皮素所需的酶量定义为一个柚苷酶活力单位。
[0013]作为实施例的优选方式，所述最佳反应条件是以柚皮苷的最大转化率得出的，计算柚皮苷转化率的方法为:其中，HPLC法:柚皮苷转化率(%)=柚皮苷的催化量(mg) X 100/酶催化反应前柚皮苷的总量(mg) ；DNS法:柚皮苷转化率(%)=酶催化反应中还原糖的生成量(mg) X 100/柚皮苷被完全催化时还原糖的生成量(mg)。
[0014]采用上述方法后，本发明通过通过DNS分析柚苷酶催化柚皮苷反应过程中产生的鼠李糖还原糖及葡萄糖还原糖的含量，达到快速优化柚苷酶催化柚皮苷的目的，并进一步分析了不同工艺参数对柚皮苷转化过程的影响，确定了最佳优化条件，所得的柚皮苷转化率高，其中，游离柚皮苷的酶催化反应柚皮苷的转化率达到了 85.1%，固定化柚皮苷的酶催化反应柚皮苷的转化率达到了 93.5%，进而为利用柚苷酶改性柚皮苷获得特定生物活性的改性产物提供了研究基础。
[0015]【专利附图】
【附图说明】
图1为本发明HPLC法和DNS法测得的柚皮苷转化率的关系；` 图2为本发明柚苷酶催化游离柚皮苷过程优化中，酶用量对柚皮苷酶解作用的优化； 图3为本发明柚苷酶催化游离柚皮苷过程优化中，底物浓度对柚皮苷酶解作用的优
化；
图4为本发明柚苷酶催化游离柚皮苷过程优化中，pH值对柚皮苷酶解作用的优化；
图5为本发明柚苷酶催化游离柚皮苷过程优化中，温度对柚皮苷酶解作用的优化；
图6为本发明柚苷酶催化游离柚皮苷过程优化中，振荡速率对柚皮苷酶解的优化；
图7为本发明固定化柚皮苷的酶解过程优化中，酶用量对柚皮苷酶解作用的优化；
图8为本发明固定化柚皮苷的酶解过程优化中，底物浓度对柚皮苷酶解作用的优化； 图9为本发明固定化柚皮苷的酶解过程优化中，pH值对柚皮苷酶解作用的优化；
图10为本发明固定化柚皮苷的酶解过程优化中，温度对柚皮苷酶解作用的优化；
图11为本发明固定化柚皮苷的酶解过程优化中，振荡速率对柚皮苷酶解作用的优化。
【具体实施方式】
[0016]本发明首先采用高效液相色谱法和DNS法对柚皮苷酶解过程中柚皮苷、普鲁宁、柚皮素和还原糖含量的变化关系进行了分析，并在此基础上探索了仅用DNS法分析柚皮苷酶解过程的可行性，继而利用该方法，分析了不同工艺参数对柚皮苷转化过程的影响，为利用柚苷酶改性柚皮苷获得特定生物活性的改性产物提供研究基础。
[0017]实施例一材料与方法一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，本方法包括以下步骤:步骤一、培养基的制备:所述培养基的制备包括斜面培养基的制备及固态培养基的制备，其中:所述斜面培养基的制备，按以下质量体积浓度的组分制备=MgSO4.7Η20 1.0 g/L,KH2PO4 1.0 g/L, (MM)2SO4 1.5 g/L,KCl 0.5 g/L,KNO3 1.5 g/L，无水 CaCl2 0.1 g/L，酵母提取物2.0 g/L，柚皮苷2.5 g/L，琼脂20 g/L，初始pH 6.0,1X105 Pa灭菌20 min ;所述固态培养基的制备，按以下重量的组分制备:柚皮粉160g，豆饼粉24g，麸皮1%，KNO3 1%，固水比为 1:1.5,IXlO5 Pa 灭菌 20 min ；
步骤二、固态发酵:将棘孢曲霉菌种接种于所述斜面培养基上，28° C培养3-4d，使所述斜面培养基上长满孢子，用无菌生理盐水洗下孢子，并用无菌生理盐水调整菌悬液OD值至0.2，将I mL单孢子菌悬液接入装有所述固态培养基的250 mL的三角瓶中，每瓶装样量为5 g，于28° C下培养7-8 d ；
步骤三、粗酶液的制备:以1:20的固液比，用磷酸盐缓冲液对固态发酵物进行浸泡Ih，搅匀后抽滤并收集滤液，将所述滤液于4° C以12000Xg离心10 min，收集上清液即得粗酶液，于0-4° C下保藏备用；
步骤四、酶催化反应:所述酶催化反应为游离柚皮苷的酶催化反应和/或固定化柚皮苷的酶催化反应，其中，所述游离柚皮苷的酶催化反应为:在50 mL的反应体系中，柚皮苷浓度为0.04-0.24g/100 mL，酶用量为4-12 U/mL，以浓度为0.02 mol/L醋酸-醋酸钠溶液为缓冲液，反应PH值为3.0-7.0，置于恒温振荡水槽中，反应温度为30-70° C，振荡反应4h,振速为0-160次/min,从加入酶液开始计时,每30 min取反应液一次,沸水灭活后，冷却至室温；所述固定化柚皮苷的酶催化反应为:在50 mL的反应体系中，加入I g湿重的树脂，柚皮苷浓度为0.08-0.24g/100 mL，酶用量为4-12 U/mL，以浓度为0.02 mol/L醋酸-醋酸钠溶液为缓冲液，反应PH值为3.0-7.0，置于恒温振荡水槽中，反应温度为30-70° C，振荡反应4 h，振速为0-160次/min，期间从加入酶液开始计时，每隔一段时间取反应液一次，并立即用沸水浴灭活20 min，冷却至室温；在其他条件不变的情况下，分别对所述的柚皮苷浓度、酶用量、反应PH值、反应温度及振速进行单因素试验，以确定最佳反应条件；
步骤五、DNS法分析还原糖生成量:采用2，4- 二硝基水杨酸即DNS分析所述酶催化反应的还原糖生成量:取0.2 mL所述反应液与0.6 mL DNS溶液混合，摇匀，100° C水浴15min,随即取出用自来水冷却，再用蒸懼水定容至5 mL,于520 nm波长下测定吸光值,依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量，其中，绘制标准曲线时，以等摩尔比的鼠李糖和葡萄糖组成的混合溶液为标准溶液，其浓度为0-2 mg/mL。
[0018]作为实施例的优选方式，所述步骤四中，所述游离柚皮苷的酶催化反应中，柚皮苷浓度为0.2 g/100 mL，酶用量为8 U/mL, pH值为5.0，反应温度为50° C，酶解反应120 min。
[0019]作为实施例的优选方式，所述步骤四中，所述固定化柚皮苷的酶催化反应中，柚皮苷浓度为0.2 g/100 mL，酶用量为8 U/mL, pH值为5.0，反应温度为50° C，振速为80次/min,酶解反应6 h。
`[0020]作为实施例的优选方式，所述方法还包括酶解产物的分离纯化步骤，即在酶催化反应结束后，立即沸水浴灭活20 min，冷却至室温，过滤收集树脂，装柱后，先用蒸馏水以ImL/min的流速进行清洗，然后用一定体积浓度的乙醇进行洗脱，用分步收集器分段收集洗脱液，同时采用薄层色谱法对洗脱液中的成分进行跟踪检测定性，将成分相同，即斑点相同的洗脱液进行合并，并将洗脱液进行减压蒸馏浓缩得浓缩物，同时回收乙醇，然后再将浓缩物用甲醇重结晶，得酶解产物纯品，即柚皮素纯品。
[0021]作为实施例的优选方式，所述方法还包括酶解产物的定性分析步骤，即在收集所述柚皮素纯品后，称取所述柚皮素纯品及柚皮素标准品，用甲醇溶解并定容后，分别采用紫外分光光度、红外光谱和高效液相色谱HPLC法对所述柚皮素纯品进行定性分析和纯度测定。
[0022]作为实施例的优选方式，所述方法还包括柚苷酶活力的测定步骤，即在收集所述粗酶液后，在1.9 mL ,pH 5.0磷酸盐缓冲液试管中，加入0.1 mL粗酶液混匀，于50° C水浴中预热5 min，再加入2 mL，300 mg/L柚皮苷标准液，50° C，反应5 min后，于100° C水浴加热20 min使酶失活，取出后迅速冷却至室温，将反应得到的样品移至1.5 mL离心管，12 000 X g离心15 min, HPLC待测，对照组为先将粗酶液灭活后再加入柚皮苷标准液，其他操作相同；以在50° C、pH 5.0的条件下,每分钟生成I μ g柚皮素所需的酶量定义为一个柚苷酶活力单位。
[0023]作为实施例的优选方式，所述最佳反应条件是以柚皮苷的最大转化率得出的，计算柚皮苷转化率的方法为:其中，HPLC法:柚皮苷转化率(%)=柚皮苷的催化量(mg) X 100/酶催化反应前柚皮苷的总量(mg) ；DNS法:柚皮苷转化率(%)=酶催化反应中还原糖的生成量(mg) X 100/柚皮苷被完全催化时还原糖的生成量(mg)。
[0024]实施例二 DNS法分析柚皮苷酶解过程的可行性
分别采用HPLC法和DNS法对柚皮苷的酶解反应进行分析，在两种情况下测得的柚皮苷的转化率随酶解时间的变化关系如图1所示。
[0025]由图1可知，由DNS法和HPLC法测得的柚皮苷的转化率随酶解时间的变化曲线基本重合，也就是说由DNS测得的柚皮苷转化率与HPLC法测定的结果一致，因此采用DNS法对柚皮苷的酶解过程进行分析，其结果准确可靠。
[0026]实施例三游离柚皮苷的酶催化反应过程优化
1.加酶量对柚皮苷酶解过程的优化
在2 mL反应体系中，其它条件不变的情况下，以柚苷酶粗酶液(酶活为100 U/mL)用量分别为4、6、8、10、12 U/mL酶解反应210 min，测定柚皮苷的转化率随时间的变化情况，其结果如图2所示。
[0027]从图中可以看出，在不同的酶用量下，反应终了时柚皮苷的转化率基本一致。随着酶用量的增加，酶反应达到平衡所需要的时间逐渐变短。这是由于在底物浓度一定的情况下，随着酶用量的增加，酶分子在单位体积、单位时间内接触底物分子的机会增加，从而酶分子催化底物转化的速率加快，酶反应达到平衡的时间缩短。实验结果显示，在8 U/mL酶用量下，反应至120 min时，柚皮苷的转化率达到了 85.1%。而当酶用量超过8 U/mL后，酶反应达到平衡所需的时间虽有所缩短，但变化幅度不大。从经济的角度考虑，选择8 U/mL作为最适酶用量。
[0028]2.底物浓度对柚皮苷酶解作用的优化
在最佳酶用量的基础上，考察底物浓度对柚皮苷酶解作用的影响，柚皮苷转化率的变化情况如图3所示。
[0029]从图3中可以看出，当其它条件固定时，柚皮苷的酶解反应达到平衡所需时间随着柚皮苷浓度的增加而延长，而柚皮苷的转化率则随之下降。当柚皮苷的浓度较低时，底物很容易被酶所饱和，酶反应则很快就能达到平衡，而当柚皮苷浓度增大时，酶与底物接触的机会也随之增加，酶反应初速率相对加快，但反应达到平衡的时间则会变长。当底物浓度为0.04 g/100 mL,反应平衡时柚皮苷转化率达到94.5%，随着底物浓度的增加，柚皮苷的转化率呈现持续下降趋势。柚苷酶催化柚皮苷是一个可逆过程，产物对反应的进行具有一定的抑制作用，因此，随着底物柚皮苷浓度增加，反应得到的产物浓度也增加，抑制作用增强，从而导致柚皮苷的转化率随底物浓度增加而下降。为尽可能多的获得酶解产物柚皮素，故选择柚皮苷在本实验条件下能达到的最大浓度0.2 g/100 mL作为底物浓度来进行后续的酶解反应。
[0030]3.pH值对柚皮苷酶解作用的优化
生物酶的活性受环境PH影响较大，其最大活力只有在其最适的pH条件下才能得以表现，过酸或过碱都会使其活力降低，甚至丧失。故考察PH值对柚皮苷酶解作用的影响十分必要。当体系的PH值分别为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0时，酶解反应体系中还原糖生成量及柚皮苷的转化率随时间的变化曲线如图4所示。
[0031]由图4可知，pH值对酶反应的初始速率及柚皮苷的转化率均有着显著的影响。当pH值为5.0时，酶反应的初始速率和达到平衡时柚皮苷的转化率均为最大。而当pH值增大或减小时，酶反应的初始反应速率及柚皮苷的转化率都会出现不同程度的减小。
[0032]4.温度对柚皮苷酶解作用的优化 每一种酶在一定条件下都有其最适反应温度，在低于最适温度范围内，酶反应速率随温度的升高而增大，但由于大多数酶都是蛋白质，当温度超过其最适温度后，随着温度的升高，酶蛋白会逐渐变性而失活，从而引起酶反应速率下降。在其它条件不变时，于不同温度下，测定酶解液中还原糖含量及柚皮苷的转化率随时间的动态变化情况，其结果如图5所
/Jn ο
[0033]从图5中可以看出，当温度由30°C增至50°C时，随着温度的升高，酶反应初始速率随之加快,达到平衡所需的时间变短,而柚皮苷的转化率也随之增高。60° C时的初始酶反应速率虽略高于50°C，但随着反应时间的延长，酶反应速率显著下降，柚皮苷转化率也随之下降。这是由于在酶反应的最初阶段，酶蛋白的变性尚未表现出来，反应速率随温度的升高而增加，但随着酶解反应的进行，酶蛋白变性逐渐突出，反应速率随温度升高的效应逐渐被酶蛋白变性效应所抵消，反应速率迅速下降，且酶蛋白的变性是随时间的延长而累加的，从而致使酶反应到达平衡的时间延长，柚皮苷转化率降低，柚皮素生成量减少。因此，该柚苷酶转化柚皮苷的最适温度是50° C，在此条件下，柚皮苷转化率达到85.1%。
[0034]5.振荡速率对柚皮苷酶解作用的优化
一般而言，使反应体系处于振荡的环境中，可能会增加反应物之间的接触机会，从而加快反应的进行。考察不同振荡速率下柚皮苷转化率随时间的变化情况，其结果如图6所示。
[0035]由图6可知，当水槽的振荡速率由O次/min增至160次/min时,酶解反应的速率、酶解反应达到平衡的时间及柚皮苷的转化率均基本未发生变化。
[0036]实施例四固定化柚皮苷的酶解过程优化
1.酶用量对固定化柚皮苷酶解过程的优化
在50 mL反应体系中，其它条件不变的情况下，以柚苷酶粗酶液(酶活为100 U/mL)为催化剂，在其用量分别为4、6、8、10、12 U/mL时，催化柚皮苷酶解反应8 h，测定酶解液中柚皮苷的转化率随时间的变化情况，其结果分别如图7所示。
[0037]从图7中可以看出，随着酶用量的增加，酶反应达到平衡所需要的时间逐渐变短。这是由于在底物浓度一定的情况下，随着酶用量的增加，酶分子在单位体积、单位时间内接触底物分子的机会增加，从而酶分子催化底物转化的速率加快，酶反应达到平衡的时间缩短。于此同时，柚皮苷的转化率也呈现出同步的变化趋势。但在不同的酶用量下，反应终了时柚皮苷的转化率基本是一致的。实验结果显示，在8 U/mL的酶用量下，反应6 h时，柚皮苷的转化率可高达90.3%。而当酶用量超过8 U/mL后，酶反应达到平衡所需的时间虽有所缩短，但变化幅度不大。从经济的角度考虑，选择8 U/mL作为最适酶用量。然而，与游离柚皮苷的酶解转化反应相比，固定化柚皮苷的酶解反应到达平衡则需要更长的时间，这可能是由于树脂载体的存在阻碍了柚苷酶与底物柚皮苷的接触所致。
[0038]2.底物浓度对固定化柚皮苷酶解作用的优化
在最佳酶用量及其它条件一定的情况下，不同底物浓度的柚皮苷转化率的变化情况如图8所示。
[0039]从图8中可以看出，柚皮苷的酶解反应达到平衡所需时间随着柚皮苷浓度的增加而延长，但柚皮苷的转化率则呈现下降趋势。当柚皮苷的浓度较低时，底物很容易被酶所饱和，酶反应则很快就能达到平衡，而当柚皮苷浓度增大时，酶与底物接触的机会也随之增加，酶反应初速率相对加快，但反应达到平衡的时间则会变长。由图中可知，当底物浓度为
0.08 g/100 mL，反应平衡时柚皮苷转化率达到98.3%，但随着底物浓度的增加，柚皮苷的转化率呈现持续下降趋势。为尽可能多的获得酶解产物柚皮素，故选择柚皮苷在本实验条件下能达到的最大浓度即0.2 g/100 mL作为底物浓度来进行后续的酶解反应。
[0040]3.pH值对固定化柚皮苷酶解作用的优化
生物酶作为一种蛋白质，其活性`受环境的PH影响较大，其最大活力只有在其最适的pH条件下才能得以表现，过酸或过碱都会使其活力降低，甚至丧失。故考察PH值对柚皮苷酶解作用的影响则显得十分必要。当体系的PH值分别为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0时，酶解反应体系中柚皮苷的转化率随时间的变化曲线如图9所示。
[0041]由图9可知，pH值对酶反应的初始速率及柚皮苷的转化率均有着显著的影响。且随着体系PH值的变化，柚皮苷转化率的变化趋势是一致的。当体系的pH值为5.0时，酶反应的初始速率及柚皮苷的转化率均为最大。而当PH值增大或减小时，酶反应的初始反应速率及柚皮苷的转化率都会出现不同程度的减小或降低。
[0042]4.温度对固定化柚皮苷酶解作用的优化
在化学反应中，绝大多数化学反应的速率，都与温度有关，酶催化反应当然也不例外。每种酶在一定条件下都有其最适温度，在低于或高于其最适温度范围时，酶的活力都会出现不同程度的下降，甚至丧失活力。在其它条件不变时，于不同温度下，测定酶解液中柚皮苷的转化率随时间的动态变化情况，其结果如图10所示。
[0043]从图10中可以看出，当温度由30° C增至50° C时，随着温度的升高，酶反应初始速率随之加快,达到平衡所需的时间变短,而柚皮苷的转化率也随之增高。60° C时的初始酶反应速率虽略高于50°C，但随着反应时间的延长，酶反应速率显著下降，柚皮苷转化率也随之下降。这是由于在酶反应的最初阶段，酶蛋白的变性尚未表现出来，反应速率随温度的升高而增加，但随着酶解反应的进行，酶蛋白变性逐渐突出，反应速率随温度升高的效应逐渐被酶蛋白变性效应所抵消，反应速率迅速下降，且酶蛋白的变性是随时间的延长而累加的，从而致使酶反应到达平衡的时间延长，柚皮苷转化率降低，柚皮素生成量减少。因此，该柚苷酶转化柚皮苷的最适温度是50° C，在此条件下，柚皮苷转化率达到93.0%。
[0044]5.振荡速率对固定化柚皮苷酶解作用的优化
一般而言，振荡的环境能够促进酶促反应的进行。在其它条件一定的情况下，考察不同振荡速率下柚皮苷转化率随时间的变化情况，其结果如图11所示。
[0045]由图11可知，当水槽的振荡速率由O次/min增至160次/min时,酶解反应的初始速率基本一致，但各振荡速率下酶反应到达反应平衡的时间略有不同。总体而言，随着振荡速率的递增，酶解反应到达平衡的时间逐渐缩短，但当水槽的振荡速率由80次/min增至160次/min时，酶反应过程中柚皮苷的转化率及酶反应到达平衡的时间基本相同。从节约能源的角度考虑，本实验选择80次/min作为水槽的振荡速率。
[0046]采用上述方法后，本发明通过通过DNS分析柚苷酶催化柚皮苷反应过程中产生的鼠李糖还原糖及葡萄糖还原糖的含量，达到快速优化柚苷酶催化柚皮苷的目的，并进一步分析了不同工艺参数对柚皮苷转化过程的影响，确定了最佳优化条件，所得的柚皮苷转化率高，其中，游离柚皮苷的酶催化反应柚皮苷的转化率达到了 85.1%，固定化柚皮苷的酶催化反应柚皮苷的转化率达到了 93.5%，进而为利用柚苷酶改性柚皮苷获得特定生物活性的改性产物提供了研究基础。
[0047]上述仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
【权利要求】
1.一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，其特征在于:本方法包括以下步骤: 步骤一、培养基的制备:所述培养基的制备包括斜面培养基的制备及固态培养基的制备，其中:所述斜面培养基的制备，按以下质量体积浓度的组分制备=MgSO4.7Η20 1.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L, (MM)2SO4 1.5 g/L,KCl 0.5 g/L,KNO3 1.5 g/L，无水 CaCl2 0.1 g/L，酵母提取物2.0 g/L，柚皮苷2.5 g/L，琼脂20 g/L，初始pH 6.0,1X105 Pa灭菌20 min ;所述固态培养基的制备，按以下重量的组分制备:柚皮粉160g，豆饼粉24g，麸皮1%，KNO3 1%，固水比为 1:1.5,IXlO5 Pa 灭菌 20 min ； 步骤二、固态发酵:将棘孢曲霉菌种接种于所述斜面培养基上，28° C培养3-4d，使所述斜面培养基上长满孢子，用无菌生理盐水洗下孢子，并用无菌生理盐水调整菌悬液OD值至0.2，将I mL单孢子菌悬液接入装有所述固态培养基的250 mL的三角瓶中，每瓶装样量为5 g，于28° C下培养7-8 d ； 步骤三、粗酶液的制备:以1:20的固液比，用磷酸盐缓冲液对固态发酵物进行浸泡Ih，搅匀后抽滤并收集滤液，将所述滤液于4° C以12000Xg离心10 min，收集上清液即得粗酶液，于0-4° C下保藏备用； 步骤四、酶催化反应:所述酶催化反应为游离柚皮苷的酶催化反应和/或固定化柚皮苷的酶催化反应，其中，所述游离柚皮苷的酶催化反应为:在50 mL的反应体系中，柚皮苷浓度为0.04-0.24g/100 mL，酶用量为4-12 U/mL，以浓度为0.02 mol/L醋酸-醋酸钠溶液为缓冲液，反应PH值为3.0-7.0,置于恒温振荡水槽中，反应温度为30-70° C，振荡反应4h,振速为0-160次/min,从加入酶液开始计时,每30 min取反应液一次,沸水灭活后，冷却至室温；所述固定化柚皮苷的酶催化反应为:在50 mL的反应体系中，加入I g湿重的树脂，柚皮苷浓度为0.08-0.24g/100 mL，酶用量为4-12 U/mL，以浓度为0.02 mol/L醋酸-醋酸钠溶液为缓冲液，反应PH值为3.0-7.0，置于恒温振荡水槽中，反应温度为30-70° C，振荡反应4 h，振速为0-160次/min，期间从加入酶液开始计时，每隔一段时间取反应液一次，并立即用沸水浴灭活20 min，冷却至室温；在其他条件不变的情况下，分别对所述的柚皮苷浓度、酶用量、反应PH值、反应温度及振速进行单因素试验，以确定最佳反应条件； 步骤五、DNS法分析还原糖生成量:采用2，4- 二硝基水杨酸即DNS分析所述酶催化反应的还原糖生成量:取0.2 mL所述反应液与0.6 mL DNS溶液混合，摇匀，100° C水浴15min,随即取出用自来水冷却,再用蒸懼水定容至5 mL,于520 nm波长下测定吸光值,依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量，其中，绘制标准曲线时，以等摩尔比的鼠李糖和葡萄糖组成的混合溶液为标准溶液，其浓度为0-2 mg/mL。
2.如权利要求1所述的一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法,其特征在于:所述步骤四中，所述游离柚皮苷的酶催化反应中，柚皮苷浓度为0.2 g/100 mL,酶用量为8 U/mL, pH值为5.0，反应温度为50° C，酶解反应120 min。
3.如权利要求1所述的一种基于DNS分析实现柚苷酶酶解的快速优化方法，其特征在于: 所述步骤四中，所述固定化柚皮苷的酶催化反应中，柚皮苷浓度为0.2 g/100 mL，酶用量为8 U/mL, pH值为5.0，反应温度为50° C，振速为80次/min，酶解反应6 h。
4.如权利要求1所述的一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法,其特征在于:所述方法还包括酶解产物的分离纯化步骤，即在酶催化反应结束后，立即沸水浴灭活20 min，冷却至室温，过滤收集树脂，装柱后，先用蒸馏水以I mL/min的流速进行清洗，然后用一定体积浓度的乙醇进行洗脱，用分步收集器分段收集洗脱液，同时采用薄层色谱法对洗脱液中的成分进行跟踪检测定性，将成分相同，即斑点相同的洗脱液进行合并，并将洗脱液进行减压蒸馏浓缩得浓缩物，同时回收乙醇，然后再将浓缩物用甲醇重结晶，得酶解产物纯品，即柚皮素纯品。
5.如权利要求4所述的一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法,其特征在于:所述方法还包括酶解产物的定性分析步骤，即在收集所述柚皮素纯品后，称取所述柚皮素纯品及柚皮素标准品，用甲醇溶解并定容后，分别采用紫外分光光度、红外光谱和高效液相色谱HPLC法对所述柚皮素纯品进行定性分析和纯度测定。
6.如权利要求1所述的一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法,其特征在于:所述方法还包括柚苷酶活力的测定步骤，即在收集所述粗酶液后，在1.9 mL ,pH5.0磷酸盐缓冲液试管中，加入0.1 mL粗酶液混匀，于50° C水浴中预热5 min，再加入2mL, 300 mg/L柚皮苷标准液，50° C，反应5 min后，于100° C水浴加热20 min使酶失活，取出后迅速冷却至室温，将反应得到的样品移至1.5 mL离心管，12 OOOXg离心15 min,HPLC待测，对照组为先将粗酶液灭活后再加入柚皮苷标准液，其他操作相同；以在50° C、PH 5.0的条件下，每分钟生成I μ g柚皮素所需的酶量定义为一个柚苷酶活力单位。
7.如权利要求1或4所述的一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，其特征在于:所述步骤四中，所述最佳反应条件是以柚皮苷的最大转化率得出的，计算柚皮苷转化率的方法为:其中，HPLC法:柚皮苷转化率(%)=柚皮苷的催化量(mg) XlOO/酶催化反应前柚皮苷的总量(mg) ;DNS法:柚皮苷转化率(%)=酶催化反应中还原糖的生成量(mg) X 100/柚皮苷被完`全催化时还原糖的生成量(mg)。
【文档编号】C12P19/60GK103555797SQ201310471799
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】肖安风, 蔡慧农, 倪辉, 蒋超, 黄高凌, 朱艳冰, 杨远帆, 李利君 申请人:集美大学