非标记snp检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种非标记SNP检测方法，包括：(1)提供两种以上寡核苷酸探针，并将其中至少一种寡核苷酸探针通过三硫代金刚烷衍生物连接至金基体表面；(2)将该两种以上寡核苷酸探针置于适于进行DNA杂交反应的环境中，并加入目标DNA进行杂交反应；(3)在杂交反应过程中和/或杂交反应完成后，通过对杂交反应体系和/或杂交反应形成的产物的相关特征性参数进行检测，实现对目标DNA的检测。本发明以三硫代金刚烷衍生物连接寡聚核苷酸探针和金基体，使寡聚核苷酸探针系通过三个硫对金属表面进行螯合，可获得极高金属表面包被稳定性(如化学、光学、温度、生物、电化学和电学稳定性)，既利于相关试验的顺利进行，且提升了相关试验结果的精确度。
【专利说明】非标记SNP检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物分子检测方法，特别涉及一种非标记基因单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)检测方法。
【背景技术】
[0002]目前业界已经发展出多种通过将生物分子连接于金纳米粒子，钼表面的金纳米粒子，金电极、金纳米薄膜等材料的表面，继而构建生物检测试剂盒、传感器或者三维纳米结构材料的技术。在现有的这些技术中，生物分子与金材料的连接通常是通过连接在生物分子上的单个或多个巯基对金表面的强吸附实现的，但因巯基化学稳定性差，极易受氧气、光照作用而降解，并产生副产物，继而干扰后续反应的进行或影响试验的精密度。
[0003]例如，对于现有的SNP检测方法，其大多是通过将寡聚核苷酸探针连接于金纳米粒子、金薄膜等基体上，再通过观测该等寡聚核苷酸探针与目标DNA的结合情况而实现的，但由于前述的缺陷，往往导致检测结果不甚理想。
【发明内容】
[0004]鉴于现有技术中的不足，本发明的主要目的在于提供一种非标记SNP检测方法。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案:
[0006]一种非标记SNP检测方法，包括:
[0007](I)提供两种以上寡核苷酸探针，并将其中至少一种寡核苷酸探针通过三硫代金刚烷衍生物连接至金基体表面；`
[0008](2)将该两种以上寡核苷酸探针置于适于进行杂交反应的环境中，并加入目标DNA进行杂交反应；
[0009](3)在杂交反应过程中和/或在杂交反应完成后,通过对杂交反应体系和/或杂交反应形成的产物的相关特征性参数进行检测，实现对目标DNA的检测。
[0010]作为较为优选的实施方案之一，步骤(1)包括:将两种以上寡核苷酸探针分别通过三硫代金刚烷衍生物连接至金基体表面，所述金基体包含金纳米粒子。
[0011]进一步的，该方法包括:
[0012](2)将两种寡核苷酸探针置于适于进行寡核苷酸杂交反应的环境中，并分别加入目标DNA、具有与该两种寡核苷酸探针完全互补的序列的DNA标准品、具有一个以上与该两种寡核苷酸探针非匹配位点的DNA标准品以及与该两种寡核苷酸探针完全非互补的DNA标准品，并进行杂交反应；
[0013](3)对由所述目标DNA、具有与该两种寡核苷酸探针完全互补的序列的DNA标准品、具有一个以上与该两种寡核苷酸探针非匹配位点的DNA标准品以及与该两种寡核苷酸探针完全非互补的DNA标准品与该两种寡核苷酸探针反应形成的杂交产物的熔点分别进行检测，并确定所述非匹配位点的数量与所述杂交产物的熔点之间的对应关系，进而实现对目标DNA的检测。[0014]作为具体应用方案之一，步骤(3)中检测所述杂交产物熔点的方法包括:将所述杂交产物置于适于进行寡核苷酸杂交反应的环境中，调整环境温度，并实时测量吸收光谱随温度的变化情况，进而测得所述杂交产物的熔点。
[0015]作为较为优选的实施方案之一，步骤(1)包括:将一种寡核苷酸探针分别通过三硫代金刚烷衍生物连接至金基体表面，所述金基体包含金薄膜芯片。
[0016]进一步的，步骤⑵包括:
[0017]1.将连接在金薄膜芯片上的一种寡核苷酸探针置于适于进行寡核苷酸杂交反应的环境中，并加入目标DNA进行杂交反应，同时以SPR光谱实时观测所述杂交反应过程；
[0018]i1.将另一种寡核苷酸探针加入步骤i形成的混合反应体系中，并继续进行杂交反应，同时以SPR光谱实时观测所述杂交反应过程。
[0019]作为较为优选的实施方案之一，该方法包括:
[0020](2)
[0021]1.将连接在金薄膜芯片上的一种寡核苷酸探针置于适于进行寡核苷酸杂交反应的环境中，并分别加入目标DNA、具有与该两种寡核苷酸探针完全互补的序列的DNA标准品、具有一个以上与该两种寡核苷酸探针非匹配位点的DNA标准品以及与该两种寡核苷酸探针完全非互补的DNA标准品，进行杂交反应，同时以SPR光谱实时观测所述杂交反应过程;
[0022]i1.将另一种寡核苷酸探针加入步骤i形成的混合反应体系中，并继续进行杂交反应，同时以SPR光谱实时观测所述杂交反应过程；
[0023](3)确定所述SPR光谱参数变化与所述非匹配位点的数量之间的对应关系，进而实现对目标DNA的检测。
[0024]具体而言，所述三硫代金刚烷衍生物具有如下结构式:
[0025]
【权利要求】
1.一种非标记SNP检测方法，其特征在于，包括: (1)提供两种以上寡核苷酸探针，并将其中至少一种寡核苷酸探针通过三硫代金刚烷衍生物连接至金基体表面； (2)将该两种以上寡核苷酸探针置于适于进行DNA杂交反应的环境中，并加入目标DNA进行杂交反应； (3)在杂交反应过程中和/或在杂交反应完成后,通过对杂交反应体系和/或杂交反应形成的产物的相关特征性参数进行检测，实现对目标DNA的检测。
2.根据权利要求1所述的非标记SNP检测方法，其特征在于，步骤(1)包括:将两种以上寡核苷酸探针分别通过三硫代金刚烷衍生物连接至金基体表面，所述金基体包含金纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的非标记SNP检测方法，其特征在于，该方法包括: (2)将两种寡核苷酸探针置于适于进行寡核苷酸杂交反应的环境中，并分别加入目标DNA、具有与该两种寡核苷酸探针完全互补的序列的DNA标准品、具有一个以上与该两种寡核苷酸探针非匹配位点的DNA标准品以及与该两种寡核苷酸探针完全非互补的DNA标准品，并进行杂交反应； (3)对由所述目标DNA、具有与该两种寡核苷酸探针完全互补的序列的DNA标准品、具有一个以上与该两种寡核苷酸探针非匹配位点的DNA标准品以及与该两种寡核苷酸探针完全非互补的DNA标准品 与该两种寡核苷酸探针反应形成的杂交产物的熔点分别进行检测，并确定所述非匹配位点的数量与所述杂交产物的熔点之间的对应关系，进而实现对目标DNA的检测。
4.根据权利要求3所述的非标记SNP检测方法，其特征在于，步骤(3)中检测所述杂交产物熔点的方法包括:将所述杂交产物置于适于进行寡核苷酸杂交反应的环境中，调整环境温度，并实时测量吸收光谱随温度的变化情况，进而测得所述杂交产物的熔点。
5.根据权利要求1所述的非标记SNP检测方法，其特征在于，步骤(1)包括:将一种寡核苷酸探针分别通过三硫代金刚烷衍生物连接至金基体表面，所述金基体包含金薄膜芯片。
6.根据权利要求5所述的非标记SNP检测方法，其特征在于，步骤(2)包括: i.将连接在金薄膜芯片上的一种寡核苷酸探针置于适于进行寡核苷酸杂交反应的环境中，并加入目标DNA进行杂交反应，同时以SPR光谱实时观测所述杂交反应过程； ii.将另一种寡核苷酸探针加入步骤i形成的混合反应体系中，并继续进行杂交反应，同时以SPR光谱实时观测所述杂交反应过程。
7.根据权利要求6所述的非标记SNP检测方法，其特征在于，该方法包括:
(2) i.将连接在金薄膜芯片上的一种寡核苷酸探针置于适于进行寡核苷酸杂交反应的环境中，并分别加入目标DNA、具有与该两种募核昔酸探针完全互补的序列的DNA标准品、具有一个以上与该两种寡核苷酸探针非匹配位点的DNA标准品以及与该两种寡核苷酸探针完全非互补的DNA标准品，进行杂交反应，同时以SPR光谱实时观测所述杂交反应过程； ii.将另一种寡核苷酸探针加入步骤i形成的混合反应体系中，并继续进行杂交反应，同时以SPR光谱实时观测所述杂交反应过程；(3)确定所述SPR光谱参数变化与所述非匹配位点的数量之间的对应关系，进而实现对目标DNA的检测。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的非标记SNP检测方法，其特征在于，所述三硫代金刚烷衍生物具有如下结构式:
9.根据权利要求8所述的非标记SNP检测方法，其特征在于，所述三硫代金刚烷衍生物至少选自如下化合物中的任一种:
【文档编号】C12Q1/68GK103614459SQ201310485829
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月17日 优先权日:2013年10月17日
【发明者】胡军, 方晨 申请人:苏州青山生物科技有限公司