一种脑梗塞早期诊断标志物及其应用的制作方法

一种脑梗塞早期诊断标志物及其应用的制作方法【专利摘要】一种脑梗塞早期诊断标志物及其应用。由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列；所述的多种核酸分子至少包含编码hsa-miR-106B-5P、hsa-miR-4306、hsa-miR-320e、hsa-miR-320d中的任一个核酸分子。还提供了一种用于区分至少一个脑梗塞患者的血浆和至少一个健康个体的血浆的试剂盒，包含上述的脑梗塞早期诊断标志物，其中，所述的至少一种对照血浆来自健康个体。本发明的有益效果是，有效用于观察脑梗塞早期发生及发展，提供了一种脑梗塞早期诊断标志物。【专利说明】一种脑梗塞早期诊断标志物及其应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种脑梗塞诊断标志物。【
背景技术：
】[0002]脑血管病是一类严重威胁人类健康和寿命的常见病。在我国，血管性疾病、肿瘤和慢性呼吸系统疾病是导致死亡的主要病因。与西方国家不同，我国脑血管病占绝大多数，因脑卒中死亡的人数超过冠心病死亡人数的3倍；而年龄调整后的首次脑卒中发病率与发达国家比较并无明显差异(LiuWP,NgKC,HuangJJ.Carotidarteryinjurywithcerebralinfarctionfollowingheadandnckblunttruma:reportofacas.TheYaleJournalofBiologyandMedicine,2005，78:149-153.)。缺血性脑血管病约占全部脑血管病的60%-80%，主要由脑动脉粥样硬化引起管腔狭窄，是一种发病率、致残率、致死率、复发率较高的疾病。近年来，国内外文献表明脑梗死有年轻化趋势，通常将18-45岁发病的脑梗死定义为青年脑梗死，年发病率为6-20/10万(KittnerSJ.Strokeintheyoung:comingofage.Neurolosy,2002,59(I):6_7.)。研究资料提示,青年脑梗死的发病率在欧美发达国家占全部脑血管患者的5%~8%。在我国及发展中国家约占10%左右；男性明显高于女性，国外研究男女分别为71%和29%，国内报道男:女=2.63:1(KwonSU,KimJS,LeeMC,etal.1schemicstrokeinkoreanyoungaults.ActaNeurolScand,2000,101(I):19-24.)。[0003]脑梗塞严重危害患者的生活质量，溶栓治疗是目前最科学有效的方法(国家“九五”攻关课题协作组.急性脑梗塞六小时以内的静脉溶栓治疗[J].中华神经科杂志，2002,35(4):210-213.)。尽早进行溶栓治疗，以抢救缺血半暗带，尽快使闭塞血管再通，恢复脑组织血供是目前治疗急性缺血性脑卒中较好方法，并取得了良好的效果，治疗后并发症、致残率较传统被动的支持疗法有明显减低。静脉溶栓静脉推注或静脉滴注仍是目前国内外应用最广泛的溶栓方法。静脉溶栓要求的技术设备简单、方便快捷、操作技术容易掌握、创伤相对较小，可在短时间内完成、费用较低、患者易于接受。但静脉溶栓用药剂量较大，对纤溶系统影响大，出血较多，尤其对大血管的血栓溶栓效果较差，再通率较低，比较合适弥散性微血栓的溶栓。动脉溶栓的一般方法是采用Seldinger技术穿刺股动脉或颈动脉，借助DSA图像示踪，将微导管导航进入脑血管，可进行超选择性动脉内溶栓治疗(LisboaRC,JovanvicBD,AlbertsMJ.AnalysisoftheSafetyandEfficacyofIntra-ArterialThrombolyticTherapyinIschemicstroke.Stroke,2002,33(12):2866-2871.)。大脑中动脉是高度特异性的、易形成血栓栓塞的部位，在脑梗发作6h内施行动脉内溶栓，能够在脑组织不可逆性损伤之前对缺血性脑组织进行缺血再灌注，从而改善脑梗的预后。超选择性动脉内溶栓治疗用药剂量小、局部药物度高、溶栓效果确切、再通时间短、对纤溶系统影响小、时间窗长，较为适合大血管的单一血栓或少量血的栓塞以及术后暂不适宜静脉溶栓的患者。但动脉溶栓需要DSA等昂贵的检查设备、操作复杂、耗时长、需训练有索的介入和神经专科医师的配合，这使得动脉溶栓难以在更多医院开展，甚至许多符合条件的患者也不能及时被施行动脉溶栓治疗。最近几年的研究证明脑梗死动脉内溶栓较静脉内溶栓的血管再通率高，为55%-78%。根据RejaneC等对1988年-2002年的27个动脉溶栓试验的结(其中包括852例动脉溶栓患者和100例对照患者)，再通率较高为72.2%，死亡率较低(27.2%-40%)，症状性颅内出血率略高(9.5%-9.3%)。结论认为:脑梗死动脉溶栓的临床疗效显著。动脉溶栓组较对照组有较好的预后，再通率较高(72.2%);死亡率较低(27.2%-40%)?[0004]超早期脑梗死诊断已成为治疗脑梗死成功的关键(MoonisM.ThrombolyticTherapyforAcuteIschemicStroke:IssuesandAnswers[J].NeuralIndia,2002,50Suppl:S50-56.)。为及时确诊脑梗塞以便及时实施溶栓治疗，核磁共振是目前最重要和常用的辅助检查。在安全有效实施溶栓治疗的同时，我们发现部分超急性脑梗塞患者的核磁共振检查早期无明显异常改变，临床决策常因此受影响，导致错失及时溶栓、获得良好预后的机会，针对此类病例进行整理分析并对照以往溶栓病例进行研究。如果100%严格执行磁共振检查符合标准，必然会有部分病例失去及时溶栓的机会。对于影像学检查而言，CT排除出血和明显梗塞征象是必须的，MRI上DWI高信号是确诊超急性脑梗塞的可靠依据、但不应当是绝对和必须的要求。如果由于复查MRI延时过多，即使能够行溶栓处理，血管再通机会也会减少、可能失去获得良好预后的机会。对于病情相对较严重的脑梗塞病例，症状体征符合超急性脑梗塞诊断，应及时调整诊断。[0005]据此，我们认为时间窗概念示含糊的，影像学的检查是滞后的。脑梗死的发生发展首先示缺血脑组织的病理生理的改变。从缺血脑组织发生病理生理的改变到患者出现不适，再到患者肢体相应功能出现障碍的时间往往要显著大于时间窗。因为没有人能确定脑梗从哪一时间点开始发生，即使患者一感觉不适就去就诊，这种感觉因人差异太大，而且往往被误诊为高血压等其他疾病，若待出现肢体功能障碍再开始计算时间窗，我们认为时间窗已被大大延迟，拖延了治疗的最佳时机。因此，从分子水平来检测脑梗塞应该无论从特异性及灵敏度均较目前的时间窗来说更为准确，甚至可以从分子水平来推算出其实际的时间窗。[0006]作为新的切入点，miRNA为疾病诊断与治疗开辟了新途径。目前常用的血清标志物几乎都是蛋白质，而且检测它们的传统方法需要繁重的实验室劳动，没有任何基于血清的检测广泛适用于疾病的诊断，特别是用于肿瘤的早期诊断。自1993年在线虫中发现miRNA以来，人们逐渐认识到miRNA与人类多种疾病的发生、发展密切相关；在不同类型疾病中，miRNA的水平及调节作用是不同的。近年来，科学家们开始注意到血液中的miRNA具有稳定性高、可重生性及在不同疾病中的特异性，并进行了一系列研究，取得了重要进展。血清miRNA作为诊断和预后的标记物，可应用于多种疾病的早期检测，且检测损伤小、灵敏度高、稳定性好(HuZhibin,XiChen,GuangfuJin,KeZen,ChenYuZhang,andHongbingShen.SerummiRNAsignaturespredictsurvivalofNSCLC.CancerRes.,2010;70:3002;PatriciaA.Porter-Gill,Y1-PingFu,AlpanaKaushiva,DouglasPrice,WilliamDahut,WilliamFigg,andLudmilaProkunina-01sson.TissueandserummiRNAprofilingfordetectionofbladder,breastandprostatecancer.CancerRes.，2011;71:LB-350.)。MiRNA几乎参与了各种疾病发生的所有重要信号通路，参与了疾病发生发展的各个阶段，[0007]在疾病的发生发展中具有重要的作用。[0008]外周血miRNA的表达稳定性:Patrick等(PatrickS.Mitchell,RachaelK.Parkin,EvanM.KrohjBrianR.Fritz,StaciaK.Wyman,EraL.Pogosova-AgadjanyanjAmeliaPeterson,JenniferNoteboom,KathyC.0’Briant，AprilAlien，DanielW.Lin,NicoleUrban,CharlesW.Drescher,BeatriceS.Knudsen，DerekL.Stirewalt,RobertGentleman,RobertL.Vessella,PeterS.Nelson,DanielB.Martin,andMuneeshTewar1.CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection.PNASj2008;105:10513-10518.)在人工miRNA与内源性miRNA对照实验中，分别在2类miRNA中直接加入血浆或加入抗核糖核酸酶制剂后加入血浆。反应前后的TaqmanRT-PCR定量检测数据显示。外周血中存在核糖核酸酶。而内源性miRNA本身的结构形态决定了其具有对抗核糖核酸酶的能力。Chen等(ChenSuo,AgusSalim,Kee-SengChia,etal.Modifiedleast-variantsetnormalizationformiRNAmicroarray.RNA,2010;16:2293-2303.)研究获得了类似的结论。[0009]另有一些系列实验(例如:室温下过夜、反复冻存-解冻、煮沸、过酸或过碱等)，论证了外周血miRNA在温度、酸碱环境及物理状态等条件改变的情况下，其表达仍能维持稳定(BaggishAL,HaleA,WeinerRB,LewisGD,SystromD,WangF，WangTJ,andChanSY.DynamicregulationofcirculatingmicroRNAduringacuteexhaustiveexerciseandsustainedaerobicexercisetraining.J.Physiol.，2011;589:3983-3994.)。[0010]此外，外周血miRNA的表达不存在明显的性别差异.也不存在显著的个体差异，因此便于设定参照值以进行检测比对。血清和血浆中miRNA的表达不存在差异。因此在临床实践中可通过提取血清或血浆来检测miRNA。[0011]miRNA作为肝、肌肉、脑损伤的诊断标志物:研究人员将肝、肌肉、脑特异性的miRNA作为组织损伤的标志进行了研究。采用高敏感度的聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术检测循环血液中的特异性miRNA(miR-122、miR_133a及miR-124)浓度，样本来源于外伤性鼠(接受肝或肌肉毒性药物)的血清。结果显示，肝、肌肉、脑损伤会相应地引起血浆中miR-122、miR-133a及miR-124浓度升高；肝损伤时miR-122的特异性及敏感性较丙氨酸氨基转移酶要高，因为在其他器官损伤中并未发现血miR-122升高，而以往检测方法中丙氨酸氨基转移酶及谷氨酸氨基转移酶的升高也会出现在其他损伤组织中。在小鼠外伤所致脑损伤的8h内血miR-124浓度开始升高，并于24h达到高峰。这说明血miRNA可作为组织损伤新的诊断标志物。在对乙酰氨基酚导致的肝损伤鼠模型中发现，miR-192、miR-122的血清水平在对照组和实验组的血浆及肝组织中也极大不同(OmarF.Laterza,LeeLim,Philipff.Garrett-Engele,KaterinaVlasakova,NagarajaMuniappa,WesleyK.Tanaka,JasonM.Johnson,JosephF.Sina,ThomasL.Fare,FrankD.Sistare,andWarrenE.Glaab.PlasmaMicroRNAsasSensitiveandSpecificBiomarkersofTissueInjury.Clin.Chem.，2009;55:1977-1983;KaiWang,ShileZhang,BruzMarzolf,PamelaTroisch,AmyBrightman,ZhiyuanHu,LeroyE.Hood,andDavidJ.Galas.CirculatingmicroRNAs,potentialbiomarkersfordrug-1nducedliverinjury.PNAS,2009;106:4402-4407.)。[0012]血清中含有来自各种组织器官及各种疾病的游离miRNA，这些血清miRNA表达谱可以作为疾病诊断新的血清标记物，并且其可能比目前所应用的疾病的早期诊断方法更为灵敏特异。【
发明内容】[0013]本发明提供了一种脑梗塞早期诊断标志物，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列；所述的多种核酸分子至少包含编码hsa-miR-106B_5P、hsa-miR-4306、hsa_miR-320e、hsa_miR-320d中的任一个核酸分子。[0014]本发明提供了一种脑梗塞早期诊断试剂盒，包含上述的脑梗塞早期诊断标志物。[0015]本发明提供了一种用于区分至少一个脑梗塞患者的血浆和至少一个健康个体的血浆的试剂盒，包含上述的脑梗塞早期诊断标志物，其中，所述的至少一种对照血浆来自健康个体。[0016]优选地，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-106B-5P、hsa-miR-4306、hsa_miR-320e、hsa_miR-320d的四个核酸分子。[0017]本发明的有益效果是:有效用于观察脑梗塞早期发生及发展，提供了一种脑梗塞早期诊断标志物。【专利附图】【附图说明】[0018]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。[0019]图1为三组样品正常人(ZC)，CT_脑梗塞(CT-)患者和CT+脑梗塞(CT+)患者相关的miRNA芯片聚类图；[0020]图2为标志物表达量梯度变化图。【具体实施方式】`[0021]实施例1[0022]总RNA抽提(mirVanaTMRNAIsolationKit(AppliedBiosystemp/nAM1556))[0023]1.取100~200ill低温冷藏的血清样本，置于冰上融化，且充分混匀。加入10倍体积的lysis/bindingbuffer匀衆器彻底混匀。[0024]2.加入1/10体积的Homogenateadditive,润旋混均,冰上放置10分钟。以上操作均在冰上。[0025]3?力[]A与Iysis(不计Homogenateadditive)相同体积的acid-phenol:chloroform(300ullysis/300ulacid-phenol:chloroform),润旋30-60秒，室温1000Og离心5分钟,如分相不好，则重新离心。取上清置一新管中，记体积。[0026]4.加入1.25倍体积100%乙醇，涡旋混均，反复过纯化柱，体积不超过700ul，1000Og离心15秒。[0027]5.加入350ulwashI,离心5~10秒,清洗纯化拄，1000Og离心15秒,弃过滤液。[0028]6.DNaseIlOuI和BufferRDD70UI加入膜上(QIAGEN#79254)，20_3(TC放置15分钟。[0029]7.加入350ulwashI,离心5~10秒,清洗纯化拄，1000Og离心15秒，弃过滤液。[0030]8.加入500ulwash2/3,离心5~10秒,清洗纯化柱二次，1000Og离心15秒,弃过滤液，离心I分钟。[0031]9.将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加入IOOiiL95°C预热的ElutionSolution或nuclease-free水，室温最高转速离心20-30秒，收集管中液体即为提取的TotalRNA，可放置在-70°C保存。[0032]实施例2[0033]miRNA芯片的制备[0034]1.样品RNA荧光标记[0035]实验采用微阵列杂交芯片miRCURYTMLNAArray(Exiqon,V10.0)包含人类已经确定的677个miRNA探针，每个探针重复4次。将miRCURYTMLNAArrayPowerLabeling试剂盒各组分置于冰上解冻15~20min，短暂离心后漩涡混匀。将IUg总RNA(溶于3uL水)，0.5uL缓冲液和0.5uLCIP酶加入离心管，冰上混匀，PCR仪上37°C孵育30min,95°C灭活酶活性并使RNA变性，冰上迅速冷却，混合物置冰上2min，短暂旋转混匀反应物，再加入L标记缓冲液，1.5iiL荧光标记物(Hy3TM)，2iiLDMSO和2yL标记酶，冰上混匀；混合物置PCR仪上16°C避光反应Ih，65°C孵育15min。反应停止后，标记物混匀置冰上待用。[0036]2.芯片杂交[0037]将12.L上述标记的RNA样品，90iiL2X杂交缓冲液，77.5iiL无核酸酶缓冲液(共180yL)加入PCR管，混匀，95°C避光孵育2min;将混合物置冰上2min，轻柔旋转混匀。将试剂盒中的杂交载片取出，取180yL杂交样品加至预先准备好的杂交带上，并用IX杂交缓冲液补充液体至低于杂交带上缘5mm处；将另一个杂交带剪去一半，套入杂交装置上端，整个杂交装置顺向倒置迅速浸入95°C热水3~5s，取出，置于56°C烤箱内，以2r/min旋转过夜。彻底杂交后，拆除装置，以试剂盒提供的洗涤缓冲液A、B、C及蒸馏水室温下洗漆玻片，最后玻片1000r/min离心5min干燥,随即进行芯片信号扫描。[0038]3.芯片扫描与数据处理及分析[0039]绿色突光信号用AxonGenePix4000Bmicroarrayscanner扫描，GenePixproV6.0软件分析绿色荧光强度。采用中值校正法获得校正数值。以两样本miRNA荧光校正值之比值≥1.5为表达上调，比值<0.67为表达下调。[0040]实施例3[0041]生物信息学分析[0042]数据预处理后，根据各张芯片的全局均值进行片间校正，使得个各张芯片的全局均值相同；用芯片显著性分析挑选差异表达基因。筛选条件为:错误发现率FDR控制在5%以内，倍数变化不低于2倍。采用Clusterf.0对芯片数据进行聚类分析。分析结果发现，三组样品(每组100个标本)中存在两两差异的miRNA总共有42个。具体参见图1。图1为三组样品正常人(ZC)，MR1-脑梗塞(MR1-)患者和MRI+脑梗塞(MRI+)患者相关的miRNA芯片聚类图。[0043]实施例4[0044]荧光实时定量PCR验证芯片结果[0045]1.cDNA的制备[0046]使用ABI公司的TaqMan?MicroRNAReverseTranscriptionKit进行反转录，所有操作在冰上完成。总反应体系为15ill:1OOmMdNTPs0.15uI,MultiScribeTMReverseTranscriptasel.00UI,IOXReverseTranscriptionBufferl.50UI,RNaseInhibitor0.19uI,Nuclease-freewater4.16uI,miRNA或U65XRTPrimer3uI,RNAsample5uI。反应条件为16°C30min,42°C30min,85°C5min。[0047]2.实时荧光定量PCR样品模板浓度的优化[0048]取待测各样品的cDNA分别稀释5、10和15倍。不同稀释浓度的样本cDNAl.33UI,分别加入miRNA或U620XRealTimelUI,TaqMan2XUniversalPCRMasterMixlOUI,Nuclease-freewater7.67uI，总反应体系为20yI。7300HT荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，设置反应条件为95°CIOmin,95°C15s及60°Clmin，共40个循环。同时行荧光定量，检测目的基因miRNA和内参基因(U6)在不同浓度稀释样本中的扩增情况。选择当反应达到域值时，目的基因和内参基因扩增循环数均位于15~30个循环之间的样本浓度为最佳稀释浓度。[0049]3.实时荧光定量PCR[0050]最适稀释浓度的样本cDNAl.33UI,加入miRNA或U620XRealTimelU1，TaqMan2XUniversalPCRMasterMixlOUI,Nuclease-freewater7.67UI,总反应体系为20ill。设置反应条件为95°C10min，95°C15s及60°Clmin，共40个循环。反应结束后分析PCR反应曲线，得到Ct值，即荧光达到阈值所需的PCR循环数。PCR完成后，在ABI7300SystemSDSSoftwarel.3.1.21软件上分析,查看每个基因的扩增情况,记录相应的Ct值。计算方法:以U6rRNA为阳性内对照基因来校正PCR模板的细胞拷贝数(目标基因ACt值=目标基因Ct值-同一样本U6Ct值)，消除组间的加样量误差，重复3次。目标组的ACt平均值减去其对照组的ACt平均值得到每个目的基因相对循环数(AACt值)，即AACt目标基因=处理组ACt目标基因-对照组ACt目标基因，基因相对表达量采用2-AACt方法计算。[0051]结果我们发现仅hsa-miR-25_5P,hsa-miR-22_3P，hsa-miR-21_5P，hsa-miR-16_5P，hsa-miR-1246,hsa-miR-122_5P，hsa-miR-106B_5P,hsa-miR-71-5P,hsa-miR-7b_5P,hsa-miR-92a_3P,hsa-miR-574_5P,hsa_miR-451a,hsa-miR-4306,hsa_miR-320e,hsa_miR-320d,hsa-miR-30d_5P,hsa-miR-26b_5p等17个miRNA存在两两差异。[0052]实施例5[0053]荧光实时定量PCR检测临床样本[0054]1.临床收集107患者血清样本，利用miRNAPurificationKit(CW0627,cwbiotech)取200UI血衆或血清样本,加入5倍体积BufferRLM,震荡混匀30秒。[0055]2.样品中加入BufferRLM后反复吹打几次，使其充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。[0056]3.可选步骤:4°C12,OOOrpm(~13，400Xg)离心5分钟,取上清,转入一个新的离心管(自备)中(如样品中含较多蛋白、脂肪、多糖等，可选做此步骤)。[0057]4.以每200UIBufferRLM加入200UI氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟。[0058]5.4°C，12000rpm离心15分钟，样品分为三层:红色有机相，中间层，无色水相，将上层无色水相移到一个新的离心管(自备)中。[0059]6.向步骤5得到的溶液中加入1/3倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入已装入收集管(CollectionTube2ml)的吸附柱RM(SpinColumnRM)中。若一次不能将全部溶液加入吸附柱，请分多次转入。12，OOOrpm离心30秒，离心后弃掉吸附柱RM，保留流出液。[0060]7.向步骤6得到的溶液中加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀。[0061]8?将上步所得溶液和沉淀一起转入已装入收集管(CollectionTube2ml)的吸附柱RS(SpinColumnRS)中。若一次不能将全部溶液加入吸附柱，请分多次转入。12，OOOrpm离心30秒，倒掉收集管中废液，将吸附柱RS重新放回收集管中。[0062]9.向吸附柱RS中加入700illBufferRffT(使用前检查是否加入无水乙醇)，室温12，OOOrpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RS重新放回收集管中。[0063]10.向吸附柱RS中加入500UIBufferRW2(使用前检查是否加入无水乙醇)，室温12，OOOrpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RS重新放回收集管中。[0064]11?重复步骤10。[0065]12.12，OOOrpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱RS置于室温数分钟，以彻底晾干。[0066]13.将吸附柱RS置于一个新的无RNase离心管(CollectionTubel.5ml)中，向吸附柱中间部位加入30-50uIRNase-FreeWater,室温放置I分钟，12，OOOrpm离心I分钟，收集RNA溶液，得到的RNA溶液保存在_70C，防止降解。[0067]14.使用ABI公司的TaqMan#)MicroRNAReverseTranscriptionKit进行反转录，所有操作在冰上完成。总反应体系为15Ul:100mMdNTPs0.15yl，MultiScribeTMReverseTranscriptasel.00U1,10XReverseTranscriptionBufferl.50UI,RNaseInhibitor0.19uI,Nuclease-freewater4.16uI,miRNA或U65XRTPrimer3uI,RNAsample5uI。反应条件为16°C30min,42°C30min,85°C5min。[0068]15.最适稀释浓度的样本cDNAl.33ii1，加入miRNA或U620XRealTimelUI,TaqMan2XUniversalPCRMasterMixlOUI,Nuclease-freewater7.67UI,总反应体系为20ill。设置反应条件为95°C10min，95°C15s及60°Clmin，共40个循环。反应结束后分析PCR反应曲线，得到Ct值，即荧光达到阈值所需的PCR循环数。PCR完成后，在ABI7300SystemSDSSoftwarel.3.1.21软件上分析,查看每个基因的扩增情况,记录相应的Ct值。计算方法:以U6rRNA为阳性内对照基因来校正PCR模板的细胞拷贝数(目标基因ACt值=目标基因Ct值-同一样本U6Ct值)，消除组间的加样量误差，重复3次。目标组的ACt平均值减去其对照组的ACt平均值得到每个目的基因相对循环数(AACt值)，即AACt目标基因=处理组ACt目标基因-对照组ACt目标基因，基因相对表达量采用2-AACt方法计算。[0069]结果我们发现，仅hsa-miR-106B_5P,hsa-miR-4306,hsa_miR-320d和hsa-miR-320e四个miRNA在脑梗塞发生时其表达量呈现梯度变化，可有效用于观察脑梗塞早期发生及发展，可作为脑梗塞早期诊断标志物。[0070]上述提到的miRNA的核酸序列列在表1中。[0071]【权利要求】1.一种脑梗塞早期诊断标志物，其特征在于，由多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列；所述的多种核酸分子至少包含编码hsa-miR-106B_5P、hsa-miR-4306、hsa_miR-320e、hsa_miR-320d中的任一个核酸分子。2.一种脑梗塞早期诊断试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的脑梗塞早期诊断标志物。3.一种用于区分至少一个脑梗塞患者的血浆和至少一个健康个体的血浆的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中所述的脑梗塞早期诊断标志物，其中，所述的至少一种对照血浆来自健康个体。4.如权利要求1所述的脑梗塞早期诊断标志物，其特征在于，所述的多种核酸分子包含编码hsa-miR-106B-5P、hsa-miR-4306、hsa-miR-320e、hsa-miR-320d的四个核酸分子。【文档编号】C12Q1/68GK103667445SQ201310485722【公开日】2014年3月26日申请日期:2013年10月16日优先权日:2013年10月16日【发明者】石磊,王万华申请人:石磊