一种新克隆载体pAT3733的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一个同时具有氨苄青霉素和四环素抗性基因标记的插入失活型克隆载体pAT3733。该载体是通过双酶切去除pBR322上的Rop基因，补平末端后自连而获得。pAT3733不仅保留了pBR322的插入失活筛选标记，而且分子量更小，稳定性更高，质粒拷贝数提高3倍以上，便于基因克隆操作，工作效率更高。可替代目前广泛使用的pBR322质粒，成为通用的高效克隆载体。
【专利说明】—种新克隆载体PAT3733
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及生物工程【技术领域】，具体涉及一种克隆载体质粒。
[0003]
【背景技术】
[0004]质粒PBR322是最早用人工方法构建成功的一种较理想的克隆载体，至今仍是基因工程中最常用和最具代表性的质粒，被广泛地用于基因工程，有“万能载体”之称。它是由博利瓦(Bolivar)等人于1977年构建而成的，是一个典型的人工质粒载体。它具有较小的相对分子质量，因而装载较大量的外源DNA ;它具有较高的拷贝数，这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便；它还具有两种抗菌素抗性基因，即氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。这为检测重组体质粒提供了方便。但pBR322质粒中的R0P(Repressor Of Primer)因子控制了 PBR322质粒的拷贝数，从而降低了其质粒的复制能力，一般只能有15~20个拷贝。目前，虽然从PBR322中已经开发研制出了诸如pUC序列等许多应用广泛的质粒，但由于PBR322同时含有氨苄青霉素和四环素两种抗性筛选基因，非常便于筛选克隆，依然是许多研究者的首选克隆载体。在PBR322中，由于沿设基因的存在，质粒DNA复制受到严重影响，DNA的拷贝数低，产 量低，从而影响实验研究工作效率和效果。
[0005]
【发明内容】
[0006]为了克服pBR322质粒拷贝数低的缺点，本发明提供一种克隆载体，该克隆载体不仅保留了便于筛选重组子的氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，而且去除了抑制质粒DNA复制的基因，分子量较小，在同等培养条件下的大肠杆菌宿主细胞中，其质粒拷贝数和产量均比pBR322增加了 3倍以上。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
1、质粒PBR322经过限制性内切酶I +Aor 13H I双酶切后，得到两个DNA片段，大小分别为632bp和3729bp。其中632bp的小片段是含有沿设基因的DNA片段，弃除。而3729bp大片段含有完整的办?//、Tetjf,以及7?印基因，回收该片段备用。
[0008]2、用DNA聚合酶I (Klenow fragment)在dNTP存在的条件下,将回收的3729bpDNA片段末端补平，在T4 DNA连接酶的催化下自连，自连产物用热击转化法转化到大肠杆菌JM109中。在含有氨苄青霉素和四环素的双抗LB培养基上筛选。获得的转化子，提取质粒DNA进行酶切鉴定验证。
[0009]3、最终获得的新质粒pAT3733，其分子量大小为3733bp。该新质粒不含有沿设基因。
所述的PAT3733属于大肠埃希氏菌，拉丁文名称为Escherichia coli，于2013年7月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为:7918。
[0010]本发明的有益效果是，该克隆载体不仅保留了便于筛选重组子的氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，而且去除了抑制质粒DNA复制的办/7基因，分子量较小，在同等培养条件下的大肠杆菌宿主细胞中，其质粒拷贝数和产量均比PBR322增加了 3倍以上。
[0011]【专利附图】
【附图说明】 [0012]附图是本发明的限制性内切酶图谱。
[0013]图中I~39分别表示pAT3733上的39个限制性内切酶酶切位点，依次代表-.CleiI (24)(括号内为酶切位点所在的整个分子内核苷酸位置，下同III (29), Afa I(165)、&oR I (187)、船e I (229), Bfa I (230)、^a?H I (375), Ban II (475), Ban II(489)、&o0109 I (524)、5^ I (566),Sal I (651),Nine II (653),Bgl I (935)、&o52I (939),Bgl I (1169)、&oT14 I (1369)、I (1425)、&o0109 I (1439)、&o0109 I(1481)、及fa I (1489)、々?aL I (2159)、及fa I (2430)、及fa I (2593)I (2604)I(2623),BgI I (2858)、/^^Β I (2910)、及fa I (2928),Pst I (2983),Pvu I (3108)^/aI (3218),Sca I (3218)、历ic II (3279)I (3315)I (3405)II (3660)、
0109 I (3714)、&oR I (3731)。
[0014]图中A表不四环素抗性基因，所在核苷酸位置是86~1276bp,分子大小1190bp ;B表不氨节青霉素抗性基因，所在核苷酸位置是2665~3525bp,分子大小为860bp ；C表不复制子，所在核苷酸位置是1891~2505bp，分子大小为614bp。
[0015]
【具体实施方式】
[0016]本发明中所涉及的生物材料pBR322为已公开或商品化的材料，具体购于Takara公司。
[0017]在附图所示的实施例中，第86_1276bp为四环素抗性基因，大小为1190bp，其中有&oR V (187bp)、汉.Η I (375bp),5a7 I (651bp)等多个限制性内切酶酶切位点。第1891-2505bp 为 Tfe/?基因，大小为 614bp，其中有I (2159bp)、及fa I (2340bp)等限制性内切酶酶切位点。第2665-3525为氨苄青霉素抗性基因，大小为860bp，其中有汝./ I(2858)、I (2963bp)、A^ I (3108)等多个限制性内切酶酶切位点。整个质粒的大小为 3733bp。
【权利要求】
1.一种克隆载体质粒，由一个四环素抗性基因和一个氨苄青霉素抗性基因，以及一个复制子构成，其特征是在四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因之间只有一个复制子序列，不含有 Rop基因序列。
2.权利要求1所述的质粒，其分子大小为3733bp。
【文档编号】C12N15/63GK103602694SQ201310486521
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月17日 优先权日:2013年10月17日
【发明者】韦建福 申请人:云南农业大学