引物及其该引物用于制备比格犬抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD127的方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种引物及其该引物用于制备比格犬抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD127的方法；该引物序列如下：上游引物：5’-ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3’，下游引物：5’-TTATGTAGAATTTGTCTTG-3’；制备方法包括：（1）比格犬β防御素基因CBD127的克隆及测序；（2）表达载体的构建与鉴定；（3）重组蛋白的融合表达；（4）重组蛋白的鉴定；（5）表达产物的可溶性分析；（6）融合蛋白的纯化；（7）比格犬重组蛋白的生物学活性检测。本发明操作难度小，可控性强，成本低，为防御素的免疫学研究及工业批量生产奠定了基础。
【专利说明】引物及其该引物用于制备比格犬抗菌肽β-防御素重组蛋
白CBD127的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种引物及其该引物用于制备比格犬抗菌肽β -防御素重组蛋白CBD127的方法。
【背景技术】
[0002]防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子活性肽，广泛分布于动物、植物和昆虫体内。由于其具有广谱的抗微生物活性，因此被命名为“防御素”(defensins)。体外抑菌试验表明，防御素能对革兰氏阳性和阴性细菌、真菌、分枝杆菌、螺旋体、披膜病毒等病原微生物产生较强的杀伤作用，构成宿主抵抗外来病原菌感染的第一道防线。
[0003]比格犬是国际上公认的通用实验犬，因其体型小、性情温顺、均质性好、易保定、遗传性能稳定、生理生化指标稳定及实验重复性好等优点，被广泛应用于医药卫生科研和军事医学领域，是理想的实验动物模型。开展对其β_防御素的实验基础性研究，对将来的临床应用提供理论依据。更加预示了其有着广阔的应用前景。
[0004]防御素依据其半胱氨酸空间排布及二硫键大小和形成方式的不同，可分为哺乳动物防御素、昆虫防御素和植物防御素3种类型。哺乳动物防御素又分为α-、β_、Θ-防御素3种类型。β_防御素最早从牛气管粘膜上皮中分离得到，广泛分布于人、鼠、牛、羊、猪的多种器官上皮细胞内。目前，在脊椎动物、无脊椎动物和植物中发现的防御素已超过500多种，Patil等报道了犬染色体基因组编码了 42种β-防御素基因及其拟基因。目前，关于犬β_防御素的基因克隆在国内报道较少，靳慧君等报道了从健康西施犬睾丸组织中扩增出防御素基因，其基因在NCBI上检索名称为DEFB3L (cBD3)，并构建了真核表达载体，证实了其能在HEK293T细胞中得到表达。国外Sang等报道在犬的睾丸组织内克隆到了犬β -防御素基因CBD1，并通过化学合成小肽的方法证实了其对革兰氏阳性、阴性菌有抑菌作用，对支原体也有抑制作用。
[0005]随着耐药菌的出现，内源性的抗微生物肽越来越受到重视。防御素(β-defensin)作为抗菌肽的一种，借助其独特的生物学特性，极易被肠道吸收，也因其特殊的抗菌机制，不会诱导产生耐药性微生物。另一方面，动物食品安全越来越受到重视，使用无污染、无残留、无毒副作用的添加剂是解决该问题的关键。防御素是动物体成分之一，参与生命过程，是小分子短肽，具有安全无毒副作用的生物学特征。用基因工程方法生产环保型β -防御素饲料添加剂，或通过日粮添加，对畜牧业生产具有极为重要的现实意义。
[0006]大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、目前掌握最为成熟的原核表达系统。该项技术主要是将已克隆入外源基因的载体转化到细菌中，通过诱导表达、纯化获得所需的目的蛋白。其优点是能够在较短时间内获得基因表达产物，且所需的成本相对较低。与其他表达系统相比，大肠杆菌还具有遗传背景清楚，表达周期短、操作简便和使用安全等特点，成为外源基因表达的首选系统。
[0007]天然获取犬β -防御素的量极其有限，从机体中提取的步骤繁琐、成本高，β -防御素主要通过化学合成和基因工程方法获取。化学合成法可以方便地在合成过程中改变多肽的一级结构，但化学合成法的成本昂贵，同时也难以保证分子中三对二硫键的正确配对，从而影响其生物活性，严重影响了防御素的研究和应用。基因工程法是获得大量、廉价防御素的最佳途径。所以基因工程方法已经成为获取β-防御素的主要方法。基因融合表达载体的应用是目前加强防御素稳定表达的较好手段。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种引物及其该引物用于制备比格犬抗菌肽β_防御素重组蛋白CBD127的方法。
[0009]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种引物，该引物序列如下:
[0010]SEQIDN0:15 ’ -ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3，
[0011]SEQIDN0:25 ’ -TTATGTAGAATTTGTCTTG-3，
[0012]本发 明的另一目的是提供一种制备比格犬抗菌肽β_防御素重组蛋白CBD127的方法，包括如下步骤:
[0013](I)比格犬β -防御素基因CBD127的克隆及测序；
[0014](2)表达载体的构建与鉴定；
[0015](3)重组蛋白的融合表达；
[0016](4)重组蛋白的鉴定；
[0017](5)表达产物的可溶性分析；
[0018](6)融合蛋白的纯化；
[0019](7)比格犬重组蛋白的生物学活性检测。
[0020]进一步的，所述步骤(1)比格犬β -防御素基因CBD127的克隆及测序包括如下步骤:
[0021]①从比格犬睾丸组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；
[0022]②设计引物及PCR反应，利用Primer5.0软件设计引物:
[0023]SEQIDN0:15 ’ -ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3，
[0024]SEQIDN0:25’ -TTATGTAGAATTTGTCTTG-3’
[0025]用cDNA为模板进行梯度PCR操作扩增比格犬抗菌肽β -防御素重组蛋白CBD127基因序列，PCR反应体系为30 μ L体系，反应条件为95°C预变性5min，94°C变性40s，55 °C退火30s，72°C延伸90s，共30个循环，而后72°C延伸8min ；
[0026]③、PCR产物的回收和纯化；
[0027]④、克隆；
[0028]⑤、测序鉴定。
[0029]进一步的，所述比格犬β -防御素基因CBD127的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
[0030]进一步的，所述比格犬β -防御素基因CBD127编码的蛋白序列如SEQIDNO:7所
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[0031]本发明的有益技术效果是:本发明运用分子生物学技术，从比格犬睾丸组织内克隆到犬β -御素基因CBD127，选用合适的表达宿主在体外表达犬β -御素基因CBD127蛋白，在国内外第一次通过实验证实了 CBD127融合蛋白的具有广谱的抗菌活性。体外抑菌试验表明，其对金黄色葡萄球菌(图1)、大肠杆菌(图2)、粪肠球菌(图3)、酵母菌(GS115)(图4)都有一定程度的抑制作用。
[0032]本发明操作难度小，可控性强，成本低，为防御素的免疫学研究及工业批量生产奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0034]图1是pGEX-6p-l_CBD127对金色葡萄球菌的抑菌效果，注:1:阴性对照；2~3:重组蛋白 pGEX-6p-l-CBD127 ；
[0035]图2是pGEX-6p-l-CBD127对大肠杆菌的抑菌效果，注:1:阴性对照；2、4:重组蛋白 pGEX-6p-l-CBD127 ；3:空载体 pGEX_6p_l ；
[0036]图3是pGEX-6p-l_CBD127对粪肠球菌的抑菌效果，注:1:阴性对照；2~4:重组蛋白 pGEX-6p-l-CBD127 ；
[0037]图4是pGEX-6p-l-CBD127对酵母菌(GS115)的抑菌效果，注:1:阴性对照；2~3:重组蛋白 pGEX-6p-l-CBD127 ；
[0038]图5是比格犬β -防御素CBD127的PCR扩增图，注:M: NDA2000分子Marker ；1:CBD127基因；2:阴性对照；
[0039]图6 是重组质粒 pGEX-6p-l-CBD127 酶切图；注:M:NDA5000 分子 Marker ；1:酶切后的 PGEX-6p-l-CBD127 ；
[0040]图7是CBD127蛋白诱导表达的SDS-PAGE分析，注:1:未诱导的重组载体；2_5:分别为2h、4h、6h、8h诱导的重组蛋白pGEX-6p-l-CBD127 ；6:pGEX-6p-l空载体；M:蛋白质相对分子质量标准；
[0041]图8是融合蛋白的Western-Blot结果，注:M:蛋白分子质量标准；1:融合蛋白pGEX-6p-l-CBD127 ；
[0042]图9是CBD127蛋白存在形式的SDS-PAGE分析，注:1:包涵体蛋白；2:上清蛋白；M:蛋白分子质量标准；3:GST标签蛋白；
[0043]图10是蛋白纯化后SDS-PAGG分析，注:M:蛋白分子量标准；1-2:纯化后蛋白pGEX-6p-l-CBD127。
【具体实施方式】
[0044]下面结合实施实例对本发明作进一步说明:
[0045]实施实例一
[0046](1)、比格犬β -防御素基因CBD127的克隆及测序
[0047]哺乳动物抗菌肽在动物机体固有免疫中发挥着重要作用。本发明根据Genbank已发表的犬β -防御素基因核苷酸序列(登录号:DQ011996.1),利用Primer5.0软件设计引物:SEQIDNO:15，-ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3，，SEQIDNO:25，-TTATGTAGAATTTGTCTTG-3，，从比格犬睾丸组织中扩增出CBD127基因，片段大小为303bp(SEQIDNO:3图5)。(液氮中取出睾丸组织，置于研磨器中研磨，然后分别装于50mL瓶内，-80°C保存。按TRIzoI试剂说明书提取各组织样本的总RNA。采用cDNA反转录试剂鼠源反转录酶M-MLV，按说明反转录成cDNA，然后以cDNA为模板按以下程序进行PCR扩增:94°C预变性5min ;94°C变性40s，55°C退火30s，72°C延伸90s，30个循环；72°C终延伸8min。结束后，PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳检查结果，并用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。)并克隆至PMD19-T载体上，构建CBD127模板质粒pMD19-T-CBD127，经序列测定其基因序列如SEQIDNO:4 (划线黑色部分为目的基因，加粗字体为引物，黑色斜体分别为起始密码子和终止密码子)。
[0048]CGCGTACGACGGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATT ATGkkQC
TCATCCTGATCAT TGCAATCCTGCTGTTCCAGAAGTCCAAAGTAACTGAACAACTTAAGAGATGCTGGGGTGAA
TATATACGAGGATATTGCAGGAAAATATGCAGAATAAGTGAAATACGTGAAGTACTCTGTGAAAATGGGAGATATTG
TTGCCTCAACATCGTGGAATTGGAAGCACGTAGAAAAATTACAAAGCCACCTCCTCCAGAGCCAAGGACATATGCAA
Τ6Α0ΤΤΤ000Τ0ΑΑ6ΑΤ6ΑΤ6ΑΤΑΤΑΑΤΤ6ΤΑ6ΑΑΑΑΤΤΑΤΤ0ΜTτΑΤ00ΑΑTι7\0ΑΑΑΤΤ0ΤΑ0Α7^ ^AAT
CGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCT
[0049]比格犬β -防御素基因CBD127的核苷酸序列通过同源比发现和其他哺乳动物的β -防御素基因CBD127具有很高的一致性性，翻译的蛋白氨基酸序列一致性超过99%，蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。
[0050](2)、表达载体的构建与鉴定
[0051 ] 在上下游引物5 ’分别添加EcoRI和XhoI酶切位点(SEQIDNO: 55 ’ -CGGAATTCATGAAGCTCATCCTGATCAT-3’，SEQIDNO:65’ -CGCTCGAGTTATGTAGAATTTGTCTTG-3’)，以PMD19-T-CBD127为模板，扩增CBD127基因，回收扩增PCR产物割胶纯化，将纯化产物和空载体pGEX-6p-l分别用EcoRI和XhoI双酶切，回收纯化酶切产物，经T4连接酶连接转化克隆感受态细胞DH5 α，涂布平板挑取单菌落与液体LB (Amp+)中摇菌，抽提质粒，将重组质粒进行双酶切鉴定(图6)，将酶切鉴定为阳性菌液送往北京华大基因测序，测序准确后，并将其命名为 pGEX-6p-l-CBD127。
[0052](3)、重组蛋白的融合表达
[0053]将测序正确的重组质粒PGEX-6P-1-CBD127转化到E.coli BL21 (DE3)(商购)中。挑单菌落接种于LB液体培养基中(含50 μ g/ml氨苄霉素)，37 °C过夜培养。次日按I %接种于50ml LB液体培养基中(含50 μ g/ml氨苄霉素)，37°C振荡培养至0D600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.6mM, 37°C，200rpm振荡培养，分别于诱导后2、4、6、8小时各取菌液5mL，离心保留菌体。最后用SDS-PAGE电泳检测诱导表达情况。重组蛋白带有GST标签，大小约为26KD。SDS-PAGE电泳可见，诱导后有大小相符的蛋白产生，在2h就有蛋白表达。由图所示，融合蛋白在8h表达量较大(图7)。
[0054](4)、重组蛋白的鉴定
[0055]SDS-PAGE电泳后，将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜上，利用目的蛋白上的GST标签，，用抗GST鼠单克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗鼠多克隆抗体为酶标二抗，进行Western Blot分析(图8)。从图中可观察到只有在表达产物条带大小(36KD))的位置处可见目的条带。[0056](5)、表达产物的可溶性分析
[0057]取500ml诱导6_8小时的菌液离心收集菌体，按10: I比例重悬于PBS中，超声破碎(300-400W，超声3s，间隔5s，工作15分钟)，然后12000rpm离心10分钟，分别保留上清和沉淀，用SDS-PAGE电泳检测分析目的蛋白是否为可溶性蛋白。在菌体超声破碎上清检测到少量蛋白，目的蛋白大多以包涵体的形式存在(图9)。
[0058](6)、融合蛋白的纯化
[0059]1000mL上述诱导表达的菌液，离心收集菌体后，用STE洗涤菌体，加入20mL菌体裂解液重悬菌体，4°C作用30min，使溶菌酶充分裂解细菌细胞壁，可以观察到菌液变得十分粘稠，呈丝状。超声破碎直至菌液不再粘稠，12000rpm离心30min,用Novagen公司ProteinRefolding Kit蛋白纯化试剂盒处理包涵体后进行透析，获得具有生物学活性的蛋白。然后利用带GST凝胶的柱子(上海生工)进行纯化回收目的蛋白。纯化后结果如图10所示。[0060](7)、比格犬重组蛋白的生物学活性检测
[0061]用超滤浓缩管将CBD127融合蛋白进行浓缩，用BCA法测定蛋白浓度。
[0062]CBD127融合蛋白的活性检测用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定。分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌分别接种于5mL无氨苄抗性LB液体培养基，37 °C摇床培养过夜。酵母菌(GS115)接种于5mL无抗YH)液体培养基中，30°C摇床培养过夜。分别取0.5mL上述培养液接种于新鲜的5mL无氨苄抗性LB和YPD培养基中，分别与37°C、30°C摇床培养至对数生长中期。取200 μ L此细菌培养液，涂于无氨苄抗性LB和YH)琼脂平板，放置片刻。待菌液稍干后，用直径为6_的灭菌打孔器打孔若干个，分别在孔中加入100 μ L PBS作对照，100 μ L此重组蛋白。将平板正面向上37°C培养2h后，倒置继续培养18h (酵母菌培养40h)，观察抑菌效果。
[0063]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.引物，其特征是，该引物序列如下:
SEQIDNO:15’ -ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3’
SEQIDN0:25’ -TTATGTAGAATTTGTCTTG-3’
2.一种制备比格犬抗菌肽β_防御素重组蛋白CBD127的方法，其特征是，包括如下步骤: (1)比格犬β-防御素基因CBD127的克隆及测序； (2)表达载体的构建与鉴定； (3)重组蛋白的融合表达； (4)重组蛋白的鉴定； (5)表达产物的可溶性分析； (6)融合蛋白的纯化； (7)比格犬重组蛋白的生物学活性检测。
3.根据权利要求2所述制备比格犬抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD127的方法，其特征是，所述步骤(1)比格犬β -防御素基因CBD127的克隆及测序包括如下步骤: ①从比格犬睾丸组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA； ②设计引物及PCR反应，利用Primer5.0软件设计引物:
SEQIDN0:15’ -ATGAAGCTCATCCTGATCAT-3’
SEQIDN0:15’ -TTATGTAGAATTTGTCTTG-3’ 用cDNA为模板进行梯度PCR操作扩增比格犬抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD127基因序列，PCR反应体系为30 μ L体系，反应条件为95°C预变性5min，94°C变性40s，55 °C退火30s，72。。延伸90s，共30个循环，而后72°C延伸8min ； ③、PCR产物的回收和纯化； ④、克隆； ⑤、测序鉴定。
4.根据权利要求3所述制备比格犬抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD127的方法，其特征是，所述比格犬β -防御素基因CBD127的核苷酸序列如SEQIDN0:3所示。
5.根据权利要求3所述制备比格犬抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD127的方法，其特征是，所述比格犬β -防御素基因CBD127编码的蛋白序列如SEQIDN0:7所示。
【文档编号】C12Q1/68GK103540669SQ201310500692
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】尹燕博, 冯培祥, 潘福星 申请人:青岛农业大学