一种高效制备食品级酸性脲酶的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效制备食品级酸性脲酶及其应用的方法及其应用，属于生物工程【技术领域】。利用食品级乳酸乳球菌表达系统成功实现了酸性脲酶的高效表达制备方法及应用，酸性脲酶酶活达到10200U/L，纯化后酸性脲酶比酶活为325.6U/mg。纯化后的酶对氨基甲酸乙酯底物的比酶活达到243.4U/mg，在黄酒中加入本发明制备的酸性脲酶可高效降解尿素(2天降解率100%)和氨基甲酸乙酯（3天降解率72%）。本发明制备的重组酸性脲酶可以用于发酵食品中尿素和氨基甲酸乙酯的消除，可高效解决发酵食品中氨基甲酸乙酯的残留问题，本发明为实现食品级酸性脲酶的工业化生产奠定了基础。
【专利说明】一种高效制备食品级酸性脲酶的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及在乳酸菌中高效表达酸性脲酶的方法，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]脲酶(Urease，EC3.5.1.5)又称氨基水解酶，广泛存在与生物界的动物、植物、细菌、真菌等中，其能专一性的催化尿素水解产生两分子氨和一分子碳酸。自从1926年Summer首次从刀豆中提取出结晶态的脲酶，各国对脲酶进行了广泛的研究。根据脲酶作用的最适PH值，可将脲酶分为酸性脲酶、中性脲酶和碱性脲酶。
[0003]进入80年代后，研究证实在酒精类(如我国的黄酒类)的发酵生产中，酵母细胞由于氮源利用的先后次序导致精氨酸代谢产生的尿素被分泌的细胞外，同时，原材料中的尿素也残留在酒类中。而生成的乙醇和尿素会自发发生反应生成一种具有致癌的物质——氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate，简称EC)。长期饮用含有较高浓度氨基甲酸乙酯的酒类容易诱发多种癌症，如肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。因此国外如加拿大、日本以及欧洲纷纷制定了酒中EC的限量标准，而我国迟迟不能制定相应的标准。因此，如何尽快解决氨基甲酸乙酯的问题已经提上了议事日程。国内外已有多种相关报道，其中，通过人为添加制备的酸性脲酶是一个非常实际、可行的方法，2005年OIV (国际葡萄.葡萄酒组织)通过了允许添加酸性脲酶降低酒中尿素的决议。
[0004]我国拥 有十分悠久的酿酒历史，尤其是黄酒，其与葡萄酒和啤酒并称为世界三大古酒。我国黄酒因其品质优良，口感醇厚，营养丰富，具有深厚的文化底蕴而远销日本，韩国，东南亚和欧美等国家，但近年来，由于EC残留问题遭到了严重的技术贸易壁垒威胁。我国黄酒PH值为3.5-5.5，且有一定的乙醇浓度，中性脲酶和碱性脲酶在此条件下酶活力几乎或者完全丧失，酒用脲酶在我国尚未形成生产能力，绍兴黄酒集团至今仍需从日本进口昂贵的酒用酸性脲酶，因此获得具有耐酸和耐乙醇的酸性脲酶是问题解决的关键。
[0005]目前，许多课题组已从自然界中筛选获得了多种产酸性脲酶的菌株，研究表明，菌株多为肠杆菌属、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯氏菌，由于这些菌多为致病菌或者条件致病菌，从而限制了其进一步的应用。而日本商业化的酸性脲酶生产依然是利用野生菌进行发酵生产的，产酶水平较低，这也是现在酒用酸性脲酶价格居高不下的原因。
[0006]鉴于此，构建具有自主知识产权的新型食品级重组工程菌高效生产酒用酸性脲酶的方法更有利于酸性脲酶今后的工业化生产，也更有利于我国酿酒业的发展和国际市场拓展。
[0007]本发明从一株食品安全级的乳杆菌中克隆获得酒用酸性脲酶的全长基因，并实现利用重组乳酸乳球菌，异源高效表达酒用酸性脲酶及其纯化制备的方法。本发明的实现为食品级酒用酸性脲酶的工业化制备生产奠定了基础。
【发明内容】
[0008]本发明解决的技术问题是提供了一种高效制备食品级酸性脲酶的方法，技术方案为:从罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)基因组上克隆获得酸性脲酶基因，将重组质
粒导入乳酸乳球菌、植物乳杆菌或嗜热链球菌中任--种，构建高效表达酸性脲酶的重组
菌，利用重组菌发酵生产脲酶。
[0009]所述酸性脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受Nisin启动子调控，据此制备食品级酸性脲酶的方法步骤如下:
[0010]I)根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
[0011]2)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒酶切、连接构建重组质粒；
[0012]3)将步骤2)构建的重组质粒导入乳酸乳球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受Nisin启动子调控；
[0013]4)利用重组乳酸乳球菌发酵生产脲酶。
[0014]依据上述制备食品级酸性脲酶的方法，具体步骤如下:
[0015]I)根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
[0016]2)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ8148或pNZ8149酶切、连接构建重组质粒;
[0017]3)将步骤2)构建的重组质粒导入乳酸乳球菌NZ9000或NZ3900构建产脲酶重组乳酸乳球菌NZ9000 (pNZ8148-ureLR)或NZ3900 (pNZ8149_ureLR)，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受Nisin启动子调控；
[0018]4)利用重组乳酸乳球菌 NZ9000(pNZ8148-ureLR)或 NZ3900 (pNZ8149_ureLR)发酵
生产脲酶。
[0019]酸性脲酶基因簇表达在乳酸乳球菌、植物乳杆菌或嗜热链球菌中受p32或p59启动子调控。其中，重组菌株酸性脲酶基因簇表达受P32启动子调控，据此制备食品级酸性脲酶的方法，具体步骤如下:
[0020]I)根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
[0021]2)根据NCBI公布的P32 (GenBank:M24764.1)启动子序列，设计引物扩增P32启动子基因，与质粒PNZ8148酶切、连接构建重组质粒pNZ32 ；
[0022]3)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ32酶切、连接构建重组质粒pNZ32-ureLR ；
[0023]4)将步骤3)构建的重组质粒导入乳酸乳球菌，植物乳杆菌或嗜热链球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P32启动子调控；
`[0024]5)利用重组菌发酵生产脲酶。
[0025]重组菌株酸性脲酶基因簇表达受p59启动子调控的制备食品级酸性脲酶的方法，具体步骤如下:
[0026]I)根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
[0027]2)根据NCBI公布的P59 (GenBank:M24806.1)启动子序列，设计引物扩增P59启动子基因，与质粒PNZ8148酶切、连接构建重组质粒pNZ59 ；
[0028]3)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ59酶切、连接构建重组质粒pNZ59-ureLR ；
[0029]4)将步骤3)构建的重组质粒导入乳酸乳球菌，植物乳杆菌或嗜热链球菌构建产脲酶重组菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P59启动子调控；
[0030]5)利用重组菌发酵生产脲酶。
[0031]以乳酸乳球菌为表达宿主，且重组菌株酸性脲酶基因簇的表达受P32或P59启动子调控，制备食品级酸性脲酶的方法，具体步骤如下:
[0032]I)根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
[0033]2)根据 NCBI 公布的 P32 或 P59 (GenBank:M24764.1,GenBank:M24806.1)启动子序列，设计引物扩增P32或P59启动子基因，与质粒pNZ8148酶切、连接构建重组质粒pNZ32或pNZ59 ；
[0034]3)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ32或pNZ59酶切、连接构建重组质粒pNZ32-ureLR 或 pNZ59_ureLR ；
[0035]4)将步骤3)构建的重组质粒导入乳酸乳球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P32或P59启动子调控；
[0036]5)利用重组菌发酵生产脲酶。
[0037]以嗜热链球菌或植物乳杆菌为表达宿主制备食品级酸性脲酶的方法，具体步骤如下:
[0038]I)根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
[0039]2)根据 NCBI 公布的 P32 或 P59 (GenBank:M24764.1,GenBank:M24806.1)启动子序列，设计引物扩增P32或P59启动子基因，与质粒pNZ8148酶切、连接构建重组质粒pNZ32或pNZ59 ；
[0040]3)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ32或pNZ59酶切、连接构建重组质粒pNZ32-ureLR 或 pNZ59_ureLR ；
[0041]4)将步骤3)构建的重组质粒导入植物乳杆菌或嗜热链球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P32或P59启动子调控；
[0042]5)利用重组菌发酵生产脲酶。
[0043]同时，本发明对发酵制得的酸性脲酶产物，采用60%乙醇沉淀，DEAE离子交换，疏水层析进行纯化，并测定重组酸性脲酶的酶活及酶学性质。
[0044]本发明还提供了一种用于消除黄酒等发酵食品中的尿素和氨基甲酸乙酯的方法。将重组制备的酸性脲酶加入黄酒或含有尿素和氨基甲酸乙酯的食品中，用以降低食品中尿素和氨基甲酸乙酯的含量。本发明成功从乳杆菌中克隆获得酸性脲酶全长基因，并实现利用重组乳酸乳球菌，异源高效表达酸性脲酶及其纯化制备方法和应用。本发明为实现食品安全级酸性脲酶的工业化制备生产奠定了基础。
[0045]本发明具有如下有益效果:
[0046]本发明利用食品级乳酸乳球菌表达系统成功实现了酸性脲酶的高效表达，酸性脲酶酶活达到10200U/L，纯化后酸性脲酶比酶活为325.6U/mg。纯化后的酶对氨基甲酸乙酯底物的比酶活达到243.4U/mg，在黄酒中加入本发明制备的酸性脲酶可高效降解尿素(2天降解率100%)和氨基甲酸乙酯(3天降解率72%)。本发明制备的重组酸性脲酶可以用于发酵食品中尿素和氨基甲酸乙酯的消除，可高效解决发酵食品中氨基甲酸乙酯的残留问题，本发明为实现食品级酸性脲酶的工业化生产奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0047]图1所示为酸性脲酶基因克隆的电泳结果；
[0048](M, marker ;1，酸性脲酶基因)。
[0049]图2所示为构建的不同酸性脲酶工程菌发酵结果。
[0050]图3 所示为 L.1actis NZ3900 (pNZ8149_UreLR)上罐发酵结果。
[0051]图4所示为重组酸性脲酶的蛋白纯化SDS-PAGE电泳结果；
[0052](M,蛋白 marker ；1, L.1actis NZ3900 (pNZ8149_UreLR)全细胞液；2,重组菌株L.1actis NZ3900 (pNZ8149-UreLR)酒精沉淀；`3，DEAE纯化后活性部位；4，疏水层析纯化后活性部位)。
[0053]图5所示为重组表达的酸性脲酶分别以尿素和EC为底物时的比酶活。
[0054]图6重组酸性脲酶酶学性质测定结果；
[0055](A，温度对酶活的影响；B，pH对酶活的影响；C，酒精浓度对酶活的影响；D，温度对脲酶稳定性的影响；E，pH对脲酶稳定性的影响；F，酒精浓度对脲酶稳定性的影响)。
[0056]图7所示为酸性脲酶在黄酒中降解尿素和EC的结果。
【具体实施方式】
[0057]材料与方法
[0058]1.GMl7培养基:M17培养基(青岛海博生物技术有限公司)，0.5%葡萄糖，PH7.0-7.2，固体培养基添加15%琼脂。
[0059]2.LMl7培养基:M17培养基(青岛海博生物技术有限公司)，0.5%乳糖，pH7.0-7.2，固体培养基添加15%琼脂。
[0060]3.MRS培养基(青岛海博生物技术有限公司)。
[0061]4.酸性脲酶酶活测定方法:用移液管准确吸取由pH4.550mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释至适当浓度的纯化后酶液各0.2mL于2支25mL的比色管中，其中一支作为对照，加塞，沸水浴处理5min，使酶失活，冷却后将2支比色管于37°C水浴中保温平衡lOmin，分别加入0.8mL3%EC底物溶液(pH4.5,0.05mol.L—1的柠檬酸缓冲液配制)，摇匀，于37°C下恒温反应20min，立即用移液管加ImL终止剂(10%三氯乙酸)于比色管中，振荡混匀，再向比色管中依次加入ImL显色剂(15g苯酹和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL)和ImL显色剂11(13.125gNaOH和7.5mLNaC10用超纯水定容至250mL)，每加入一种显色剂均需强烈振荡，使之充分混匀，37°C下恒温反应20min，然后用超纯水定容至25mL，在625nm下比色测定OD值，计算酶活(采用氯化铵绘制标准曲线)。
[0062]5.酸性脲酶酶活力单位定义:在常压，pH4.5 (50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)和37°C下，每分钟降解尿素产生Ιμπιο? NH3+所需的酶量为一个酶活力单位。
[0063]表1
【权利要求】
1.一种高效制备食品级酸性脲酶的方法，其特征在于，从罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)基因组上克隆获得酸性脲酶基因,将重组质粒导入乳酸乳球菌、植物乳杆菌或嗜热链球菌中任一一种，构建高效表达酸性脲酶的重组菌，利用重组菌发酵生产脲酶。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，所述酸性脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受Nisin启动子调控。
3.权利要求2所述方法，其特征在于，制备步骤如下: O根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒； 2)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒酶切、连接构建重组质粒； 3)将步骤2)构建的重组质粒导入乳酸乳球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受Nisin启动子调控； 4)利用重组乳酸乳球菌发酵生产脲酶。
4.权利要求3 所述方法，其特征在于，具体步骤如下: O根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒； 2)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ8148或pNZ8149酶切、连接构建重组质粒； 3)将步骤2)构建的重组质粒导入乳酸乳球菌NZ9000或NZ3900构建产脲酶重组乳酸乳球菌NZ9000 (pNZ8148-ureLR)或NZ3900 (pNZ8149_ureLR)，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受Nisin启动子调控； 4)利用重组乳酸乳球菌NZ9000 (pNZ8148-ureLR)或 NZ3900 (pNZ8149_ureLR)发酵生产脲酶。
5.权利要求1所述方法，其特征在于，所述酸性脲酶基因簇受p32或p59启动子调控。
6.权利要求5所述方法，其特征在于，具体步骤如下: O根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒； 2)根据NCBI公布的P32(GenBank:M24764.1)启动子序列，设计引物扩增P32启动子基因，与质粒PNZ8148酶切、连接构建重组质粒pNZ32 ； 3)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ32酶切、连接构建重组质粒pNZ32_ureLR； 4)将步骤3)构建的重组质粒导入乳酸乳球菌，植物乳杆菌或嗜热链球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P32启动子调控； 5)利用重组菌发酵生产脲酶。
7.权利要求5所述方法，其特征在于，具体步骤如下: O根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；2)根据NCBI公布的P59(GenBank:M24806.1)启动子序列，设计引物扩增P59启动子基因，与质粒PNZ8148酶切、连接构建重组质粒pNZ59 ； 3)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒pNZ59酶切、连接构建重组质粒pNZ59_ureLR； 4)将步骤3)构建的重组质粒导入乳酸乳球菌，植物乳杆菌或嗜热链球菌构建产脲酶重组菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P59启动子调控； 5)利用重组菌发酵生产脲酶。
8.权利要求5所述方法，其特征在于，具体步骤如下: O根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒；
2)根据NCBI 公布的 P32 或 P59 (GenBank:M24764.1，GenBank:Μ24806.I)启动子序列，设计引物扩增Ρ32或Ρ59启动子基因，与质粒ρΝΖ8148酶切、连接构建重组质粒ρΝΖ32或ΡΝΖ59 ； 3)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒ρΝΖ32或ρΝΖ59酶切、连接构建重组质粒pNZ32-ureLR 或 pNZ59_ureLR ； 4)将步骤3)构建的重组质粒导入乳酸乳球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P32或P59启动子调控； 5)利用重组菌发酵生产脲酶。
9.权利要求5所述方法，其特征在于，具体步骤如下: O根据NCBI公布的罗伊氏乳杆菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ02000001.1，G1: 194454092-194454098，从罗伊氏乳杆菌基因组上克隆获得酸性脲酶基因，目的基因连接载体得到ureLR基因的重组质粒； 2)根据NCBI 公布的 P32 或 P59 (GenBank:M24764.1,GenBank:Μ24806.I)启动子序列，设计引物扩增Ρ32或Ρ59启动子基因，与质粒ρΝΖ8148酶切、连接构建重组质粒ρΝΖ32或ΡΝΖ59 ； 3)将含有ureLR基因的重组质粒与质粒ρΝΖ32或ρΝΖ59酶切、连接构建重组质粒pNZ32-ureLR 或 pNZ59_ureLR ； 4)将步骤3)构建的重组质粒导入植物乳杆菌或嗜热链球菌构建产脲酶重组乳酸乳球菌，脲酶基因簇的表达在乳酸乳球菌中受P32或P59启动子调控； 5)利用重组菌发酵生产脲酶。
10.权利要求1所述方法用于消除黄酒等发酵食品中的尿素和氨基甲酸乙酯。
【文档编号】C12N15/74GK103571815SQ201310524588
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】陈坚, 堵国成, 康振, 杨宇清 申请人:江南大学