副鸡嗜血杆菌的培养方法
【专利摘要】本技术发明提供了一种副鸡嗜血杆菌的培养方法，将副鸡嗜血杆菌（HPg）用生理盐水5倍稀释，接种至鸡肉汤琼脂平板,37℃含5%～10%CO2培养16～18小时,选荧光强的典型菌落接种于鸡肉汤中,培养18～20小时；长出典型HPg菌落者即为种子液。取HPg种子液,分别接种于7日龄SPF鸡胚卵黄囊,0.3mL/胚。鸡胚于37℃、56%相对湿度孵化124小时；从死亡鸡胚无菌采集发生病变的卵黄、尿囊液及绒毛膜，于研磨器中研磨，3000r/min离心20分钟，取上清液，再次接种于鸡肉汤琼脂,当生长出典型HPG菌落且无杂菌生长者，即为HPg致病菌液，-20℃保存。本技术发明具有取材容易、效率高、速度快、简便易行等优点。可用于副鸡嗜血杆菌的分离、增殖及生产疫苗等。
【专利说明】副鸡嗜血杆菌的培养方法
【技术领域】
[0001]本技术发明涉及副鸡嗜血杆菌，特别涉及一种副鸡嗜血杆菌的鸡胚培养方法，属于生物技术和微生物学领域。
【背景技术】
[0002]鸡传染性鼻炎是由副鸡嗜血杆菌gallinarum, HPg)所引起鸡的急性呼吸系统疾病。其特征是鼻腔和鼻窦炎症，打喷嚏，流鼻液，颜面肿胀，结膜炎等。鸡嗜血杆菌呈多形性，为革兰氏阴性小球杆菌，两极染色，不形成芽胞，无荚膜无鞭毛，不能运动，兼性厌氧，在含10%的大气条件下生长较好。鸡群感染后I~5天内开始出现症状，鼻青眼肿、痛苦流涕是本病的特征性症状，鼻腔与鼻窦发炎、流鼻涕、甩头、脸部肿胀。育成鸡感染传染性鼻炎，轻则生长迟缓，重则淘汰率增加，死亡率上升。蛋鸡感染后产蛋率明显下降，鸡只生长停滞、淘汰率增加。
[0003]目前细菌的培养常用包括需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法，也可同时采用两种或三种不同的培养法。对于副鸡嗜血杆菌曾有人做过液体发酵培养，然而尚无关于鸡胚培养方法的报道。鸡胚接种培养技术比组织培养容易成功，也比接种动物的来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，因此是常用的一种培养病毒的方法，此方法可用于某些病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。
【发明内容】
[0004]本发明技术涉及副鸡嗜血杆菌(HPg)的鸡胚培养方法，包括以下步骤:
将副鸡嗜血杆菌北京标准 株A型用生理盐水进行5倍稀释，作为原液，划线接种至鸡肉汤琼脂平板上，置37°C含5%~10% CO2 (体积分数)培养箱中培养16~18小时，在斜射光线的显微镜下观察，选择荧光强的典型菌落接种于鸡肉汤中，同样条件下培养18~20小时；再用鸡肉汤琼脂平板进行杂菌检验，无杂菌且生长出典型HPg菌落者即为种子液。
[0005]取HPg种子液，分别接种于7日龄SPF鸡胚卵黄囊，0.3 mL/胚。鸡胚在数字智能化孵化机中37°C、56%相对湿度下孵化，3h翻蛋一次，观察124小时；
从死亡的鸡胚分别无菌采集发生病变的卵黄、尿囊液及绒毛膜，置于组织研磨器中研磨，3000r/min离心20分钟，取上清液，再次接种于鸡肉汤琼脂平板，当生长出典型HPG菌落且无杂菌生长者，即为HPg致病菌液，_20°C保存。
[0006]按农业部颁发的兽医微生物制品规程进行细菌计数，将病菌液以10' 10_2，10_3*“10_6六个梯度稀释，然后取0.1mL稀释液均匀地涂抹在鸡肉汤琼脂平板上，每个稀释度设重复板，于37°C含5%~10% CO2的培养箱中培养18~20小时，2板的平均数即为该稀释度的细菌数。
[0007]四、技术特点
1.鸡胚的来源比自然宿主、实验动物(易感动物)和细胞等材料更容易获得，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般，培养的成本低；
2.接种方法简便易行，SPF鸡胚无杂菌，无病毒隐性感染，培养纯度高，培养时间短。
[0008]3.副鸡嗜血杆菌(HPg)繁殖速度快，扩增量大。
[0009]总之，本技术发明具有取材容易、效率高、速度快、简便易行等优点。可用于副鸡嗜血杆菌的分离、增殖及生产疫苗等。
[0010]五、【专利附图】
【附图说明】
图1是本技术“副鸡嗜血杆菌的培养方法”的流程图
图2是副鸡嗜血杆菌(HPg)鸡胚接种后的主要病变，可见绒毛膜变浑浊、变厚及形成的痘斑。
[0011]六、【具体实施方式】
1.副鸡嗜血杆菌的鸡胚培养
1.1种子液的培育将副鸡嗜血杆菌北京标准株A型培养液进行5倍稀释，作为原液，划线接种至鸡肉汤琼脂平板上，置37°C含5%~10% CO2 (体积分数)培养箱中培养16~18小时，在斜射光线的显微镜下观察，选择突光强的典型菌落接种于鸡肉汤中，同样条件下培养18~20小时。
[0012]1.2用鸡肉汤琼脂平板进行杂菌检验，无杂菌而生长出典型HPg菌落者即为种子液。
[0013]1.3鸡胚接种与收获取繁殖好的HPg种子液，接种于7日龄SPF鸡胚卵黄囊，0.3 mL/胚。鸡胚在数字智能化孵化机中37°C、56%相对湿度下孵化，3h翻蛋一次，观察124小时。
[0014]从死亡的鸡胚分别无菌采集发生病变的卵黄、尿囊液及绒毛膜，置于组织研磨器中研磨，3000r/min离心20分钟，取上清液，再次接种于鸡肉汤琼脂平板，进行杂菌检验，当生长出典型HPG菌落且无杂菌生长者，即为HPg致病菌液，-20°C保存。
[0015] 1.4细菌计数细菌计数按农业部颁发的兽医微生物制品规程进行，以10' IO-2, 10_3……10_6稀释，然后取0.1mL稀释液均匀地涂抹在鸡肉汤琼脂平板上，每个稀释度做I个重复板，置于37°C含5%~10% C02的培养箱中培养18~20小时，两板的平均数即为该稀释度的细菌数。
[0016]2.鸡胚半数致死量(ELD50)测定
取死亡鸡胚的卵黄、尿囊液及绒毛膜的离心上清液，按10'10_2、10_3、10_4、10_5的梯度稀释后接种鸡胚。
[0017]采用FT-K数字智能化孵化机。所用SPF鸡胚为自行孵化，取7日龄鸡胚50枚。每个鸡胚分别接毒^^、^^、川人川气^^梯度的稀释液匕2mL，每个稀释梯度用10枚鸡胚37°C，56%相对湿度下孵化，3h翻蛋一次。弃去48h内死亡鸡胚，观察124h，详细记录死亡与存活数。无菌收集72-148h死亡鸡胚，3500r/min离心，取上清液，-20°C保存待用。
[0018]按Reed-Menuch氏法计算HPg鸡胚半数致死量(ELD50)。
[0019]表1.HPg的ELD50测定结果
【权利要求】
1.本技术发明涉及一种“副鸡嗜血杆菌的培养方法”，包括以下步骤: 将副鸡嗜血杆菌(HPg)北京标准株用生理盐水进行5倍稀释，划线接种至鸡肉汤琼脂平板上，置37°C含5%~10% CO2培养箱中培养16~18小时后，在斜射光线的显微镜下观察，选择突光强的典型菌落接种于鸡肉汤中，同样条件下培养18~20小时；再用鸡肉汤琼脂平板进行杂菌检验，无杂菌且生长出典型HPg菌落者即为种子液。
2.取HPg种子液，分别接种于7日龄SPF鸡胚卵黄囊，0.3 mL/胚；鸡胚在数字智能化孵化机中37°C、56%相对湿度下孵化，3h翻蛋一次，观察124小时；从死亡的鸡胚分别无菌采集发生病变的卵黄、 尿囊液及绒毛膜，置于组织研磨器中研磨，3000r/min离心20分钟，取上清液，再次接种于鸡肉汤琼脂平板，当生长出典型HPG菌落且无杂菌生长者，即为HPg致病菌液，_20°C保存。
【文档编号】C12R1/21GK103667115SQ201310570995
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】魏锁成, 巩转娣, 魏黎敏 申请人:魏锁成, 巩转娣, 魏黎敏