基于拟南芥pri-miR828基因的植物表达载体及其构建和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于拟南芥pri-miR828基因的植物表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828，以及该植物表达载体的构建方法和应用，所述植物表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828中含有At-pri-miR828基因以及pOT2克隆载体CaMV35s启动子，具有SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。本发明所构建的植物表达载体转染植物后，可获得高表达At-pri-miR828基因的植株，并调控植物中花青素的生物合成。
【专利说明】基于拟南芥Pr 1-mi R828基因的植物表达载体及其构建和
应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种拟南芥pr1-miR828基因的植物重组表达载体，以及该重组表达载体的构建及应用。
【背景技术】
[0002]MicroRNA (miRNA)，也称微小RNA，是一类内源性的单链非编码小分子RNA，长度约为21-24个核苷酸。miRNA介导了一种新的基因表达调控模式，在植物体内，主要在转录后水平通过与靶mRNA的互补配对来负调控靶mRNA的转录或翻译。miRNA的表达比蛋白基因更迅速，并且不受翻译过程的影响，所以对目标基因的表达调控效率更高。作为重要的调节分子，miRNA介导的基因表达调控在植物器官的形态建成、生长发育、激素分泌、信号转导以及与环境互作等多种生理生化过程中起重要作用。
[0003]MicroRNA828 (miR828)是新近测序发现的生物学功能还未全面研究的一种miRNA。在拟南芥thaliana, At)中，通过生物信息学预测和5’ RACE体外剪切实验发现，miR828 的靶基因为SiRNA 4)、PAP1/MYB75 琳 PAP2/MYB90 {PRODUCTION OF ANTHOCYANIN PIGMENT I and 2)以及 MYBl 13 (Rajagopalan etal., Genes Dev,2006,20:3407-3425 ;Luo et al., Plant Mol Biol,2012,80:117-129)。PAPl和#7377J属于MYB转录因子，在植物发育过程中参与花青素、黄酮类、苯基丙酸类等次生代谢物的合成。Zuluaga等(Funct Plant Biol, 2008, 35:606-618)发现超表达/^/^/#7沒75转录因子导致转基因番茄植株花青素合成增加。谢烨等(植物生理学报，2013年02期)的最新研究表明，miR828负调控拟南芥蔗糖诱导下花青素的生物合成。通过生物信息学方法预测，在番爺中，miR828的祀基因为乙烯不敏感基因{ethylene-1nsensitive`2,EIN2, SGN-U319128)和花青素合成相关基因 (SGN-320618)，这预示着miR828可能参与番茄花青素合成途径的调控网络。
[0004]在番茄植株中，通过超表达单个异源参与类黄酮合成途径的酶基因和调苄基因，以提高果实花青素含量的方法效果欠佳。Butelli等在番茄果实中同时特异共表达由E8启动子驱动的2个转录因子，即源于金鱼草的(bHLH-type TF)和Rosl (R2R3MYB-type TF)，获得了果肉组织中花青素含量显著增加的表型(Nat Biotechnol, 2008,26:1301-1308)。但目前还未见应用miRNA调控策略提高普通番茄花青素合成积累的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种含有拟南芥pr1-miR828基因(At-pri_miR828基因)的植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828，以及该植物表达载体的构建方法。
[0006]本发明的另一发明目的在于提供上述构建的植物表达载体的应用。
[0007]为深入解析miR828的生物学功能和建立通过遗传修饰miRNA调控番茄果实花青素含量的技术策略，本发明从拟南芥中分离到At-pr1-miR828基因，并构建过量表达载体。该载体的构建可以为miR828基因功能的研究和从miRNA角度研究番茄花青素生物合成积累机制提供重要的研究资料和研究基础。
[0008]本发明提供的植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828中含有At-pri_miR828基因以及P0T2克隆载体CaMV35s启动子，具有SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，其中，所述At-pr1-miR828基因连接于p0T2克隆载体CaMV35s启动子下游，p0T2-At-pri_miR828基因连接于起始表达载体PC2300的I单酶切位点处。
[0009]所述At-pr1-miR828基因来源于拟南芥，含有AT4G27765.1所示的核苷酸序列(SEQ ID N0.3) ο所述起始表达载体为PCAMBIA2300，简称pC2300，由美国密歇根理工大学
唐贵良教授惠赠。
[0010]本发明还提供了一种构建上述植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的方法，是先以At-pr1-miR828基因片段连接p0T2克隆载体，得到p0T2-At-pri_miR828重组质粒；再连接线性化的PC2300表达载体和p0T2-At-pr1-miR828重组质粒，得到植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828 重组质粒。
[0011]具体的，所述植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的构建方法包括如下步骤:
1)以At-pr1-miR828基因片段连接历/2dIII和&oR I双酶切的p0T2克隆载体，重组产物转化疋colimb α感受态细胞，得到p0T2-At-pr1-miR828重组质粒；
2)重组质粒p0T2-At- pr1-miR828和起始表达载体pC2300备PacI单酶切，用T4DNA连接酶连接线性化的pC2300表达载体和p0T2-At-pri_miR828质粒，酶连产物转化E.coliDm α感受态细胞，得到植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828重组质粒。
[0012]本发明所构建的植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828可以用于调控植物花青素的生物合成。其中，所述的植物包括番茄、拟南芥、小麦、水稻等。
[0013]将上述构建得到的植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828应用农杆菌介导法转染到番茄的子叶外植体中，获得过表达转基因植株。移栽成活后，用CTAB法提取嫩叶DNA，进行At-pr1-miR828基因的PCR扩增。对PCR鉴定结果为阳性的miR828过表达转基因植株及野生型植株分别进行则7--货及其靶基因Sly-myb-likel表达水平的荧光定量PCR分析。结果显示，转基因植株中的表达量增加，而靶基因Sly-myb-likel的表达量下降。观察转基因番茄植株与野生型植株的生长情况发现，过表达转基因番茄植株较野生型颜色发绿。提取叶片中的花青素，计算其相对含量，结果显示，-7?&货过表达转基因番茄植株的花青素含量均明显低于野生型。
[0014]本发明构建了能够高表达At-pri_miR828基因的植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828,以本发明所构建的表达载体转染植物后，可获得则7?货过表达转基因植株，且该At-pr1-miR828基因能够调控植物中花青素的生物合成。
[0015]本发明以植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828构建的则7?货过表达植株还可以用于检测何种因子对miR828的表达量和代谢途径有影响的实验研究。
[0016]相对于转录因子直接参与花青素合成的调控，植物体内MicroRNA抑制靶基因表达为我们提供了一种全新的花青素合成调控机理，对完善花青素代谢途径及其调控机制具有非常重要的生物学意义。本发明提供了植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828在调控植物(包括番茄、拟南芥、小麦、水稻等)花青素合成上的应用。花青素生物合成的调控，将为植物花色改造、农作物品质改良等提供更多的有效途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为At-pr1-miR828基因PCR扩增产物的电泳鉴定。
[0018]图中，M:Tans2K? Plus II DNA Marker ；miR828:野生型拟南芥At-pri_miR828基因PCR扩增产物。
[0019]图2为p0T2-At-pr1-miR828质粒PCR扩增产物的电泳鉴定。
[0020]图中，M:DL1000 DNA Marker ；1:p0T2-At-pri_miR828 质粒阳性对照；2:阴性对照；3 ~6:p0T2-At-pr1-miR828 质粒 PCR 扩增产物。[0021]图3为p0T2-At-pr1-miR828质粒双酶切后的电泳鉴定。
[0022]图中，M:DL5000 DNA Marker ;1、3、5:没有酶切的p0T2-At-pri_miR828质粒；2、4、6 -.Hind III 和 EcoR I 双酶切的 p0T2-At-pri_miR828 质粒。
[0023]图4为重组质粒p0T2-At-pri_miR828构建示意图。
[0024]图5为植物表达载体pC2300-p0T2-At-pri_miR828的PacI酶切后电泳鉴定。
[0025]图中，M:Tans2KTM Plus II DNA Marker ; 1、3、5:未酶切的pC2300-p0T2-pr1-miR828 质粒；2、4、6 -.Pacl 酶切的 pC2300-p0T2-pri_miR828 质粒。
[0026]图6为植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828构建示意图。
[0027]图7为带有愈伤组织的番茄子叶外植体图。
[0028]图8为番茄子叶外植体抗性芽的诱导、伸长(左)及生根(右)图。
[0029]图9为抗性植株的盆栽培育图。
[0030]图10为At-pr1-miR828转基因番茄植株的PCR检测电泳图。其中A为目的基因At-pr1-miR828的检测；B为载体上Cmr基因的检测。
[0031]图中，M:DL1000 DNA Marker ；1:野生型番茄；2 ~10:miR828_l ~miR828_9 转基
因番爺植株。
[0032]图11为心7--?过表达转基因番茄的心7--货和》知-7/知7基因的荧光定量PCR结果。
[0033]图12为转基因番茄植株的表型图，MIR828-1、MIR828-2 -jniR828过表达转基因番茄；Wt:野生型番茄。
[0034]图13为转基因番茄叶片中的花青素含量图。
[0035]图中，Wt:野生型番茄；1~6:转基因番茄植株。
【具体实施方式】
[0036]为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的构建以及At-pri_miR828基因在调控花青素生物合成中的应用作进一步的说明。
[0037]本发明利用质粒的体外酶切及连接技术，将线性化的克隆载体P0T2与At-pr1-miR828基因连接，转化疋co7iDH5 α感受态细胞进行扩增，所得重组质粒可通过Chl筛选出，并通过质粒大小和限制性内酶切分析鉴定。继而，用I内切酶分别单酶切带有I单酶切位点的pC2300表达载体和p0T2-At-pr1-miR828重组质粒，并连接，转化E.colimb α感受态细胞进行扩增，所得植物表达载体可通过Chl和Kan筛选出，并通过双酶切分析鉴定。
[0038]实施例1:植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的构建。
[0039]植物材料:哥伦比亚生态型(Columbia-O)野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)种子及野生型番爺{Solanum lycopersicum L.Ailsa Craig)种子。
[0040]菌株和质粒:大肠杆菌(疋coli)菌株DH5 α，农杆菌菌株GV3101，改造后带有35s启动子的克隆载体P0T2，以及改造后带有I单酶切位点的表达载体PC2300。
[0041]酶和化学试剂:LA Taq DNA聚合酶、普通7? DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒、反转录试剂盒、突光定量试剂盒、Marker DL2000和MarkerDL2000均购自中国TakaRa公司；Tans2K? Plus II DNA Marker购自北京全式金公司；DNA限制性内切酶IIUcoR l、Pac I购自英国NEB公司；TRizol购自美国Invitrogen。PCR引物在生工生物工程(上海)有限公司合成，其它药品、试剂均为生工生物工程(上海)有限公司的BBI系列产品。
[0042]一、At-pri_miR828原始转录本序列的获得及引物设计与PCR扩增。
[0043]查询拟南芥基因组数据库TheArabidopsis Information Resource,获得miR828的原始转录本序列AT4G27765.1。借助Primer 3.0软件对基因序列及载体序列进行分析，并设计如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的扩增引物。为了便于miR828过表达载体的构建，在上下游引物的5'端分别引入历id III酶切位点和I酶切位点(下划线部分)及保护碱基。
[0044]引物序列如下:
miR828-PF:5/ -CCGAIAGCTTTGGTAGCCTGGGTTGGTG-3'；
miR828-PR:5/ -CCCGIAATTC TTAAAGGCTTGACTCATACGACA-3'。
[0045]参照常规CTAB法从幼嫩的野生型拟南芥叶片中提取DNA。以提取的拟南芥DNA为模板，用上下游引物进行PCR扩增，得到长度467bp的At-pr1-miR828 DNA片段(SEQ IDN0.3) JCR反应体系:拟南芥基因组DNA I μ L, IOXLA PCR缓冲液 5 μ L，2.5mmol.1/1 dNTPs5 μ L, 10 μ mo I.L-1 上下游引物各 5 μ L，5U.μ L-1 LA Taq 酶 0.5 μ L，ddH20 28.5 μ L。扩增条件如下:94°C 2min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0
[0046]PCR反应结束后，取2 μ L反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，扩增出约467bp的At-pr1-miR828基因特异条带，如图1所示。PCR产物经PCR产物纯化试剂盒回收后送华大基因公司测序，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。结果表明已成功扩增出拟南芥miR828的原始转录本At-pri_miR828序列。
[0047]二、重组质粒 p0T2-At-pri_miR828 的构建。
[0048]用高保真限制性内切酶历fld III和&oR I对p0T2克隆载体和At-pri_miR828基因的纯化产物分别进行双酶切。将At-pr1-miR828基因的酶切产物进行PCR产物纯化，P0T2载体的酶切产物进行凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收大片段。回收产物用T4 DNA连接酶16°C连接过夜，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。在含有Chloramphenicol (Chl)的LB平板上挑选阳性单克隆，采用At-pr1-miR828基因的扩增引物进行质粒PCR，Hind III和EcoR I双酶切和测序验证后命名为p0T2-At-pr1-miR828，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，图4为p0T2-At-pr1-miR828重组质粒的构建示意图。[0049]采用At-pr i-miR828基因扩增引物miR828_PF和miR828_PR进行质粒的PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1, HinA III和I双酶切后凝胶电泳检测结果显示目标基因片段大小正确(图3)，说明重组质粒pOT2-At-pr1-miR828构建成功。
[0050]三、植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828 的构建。
[0051]用高保真限制性内切酶I分别单酶切带有I单酶切位点的起始表达载体PC2300和重组质粒p0T2-At-pr1-miR828，分别用PCR产物纯化试剂盒纯化。纯化产物用T4DNA连接酶连接，16°C过夜，获得核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示的At-pri_miR828过表达的植物表达载体，命名为pC2300-p0T2-At-pr1-miR828。载体构建示意图如图6所示。转化DH5 α感受态细胞，在含有Chl和Kanamycin (Kan)的双抗生素LB平板上挑选单克隆，提取质粒，进行I酶切，凝胶电泳检测结果如图5，测序结果说明，实验所得序列与GenBank中 At-pr1-miR828 (AT4G27765.1)序列一致，说明 pC2300-p0T2-At-pri_miR828 植物表达载体构建成功。
[0052]实施例2:植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828对番茄的遗传转化。
[0053]一、农杆菌介导的叶盘法转化番爺。
[0054]无菌苗培养:先用75%乙醇浸泡番爺种子5min,倒掉乙醇后用无菌水冲洗一遍；再用饱和Na3PO4.12H20溶液浸泡20min，无菌水冲洗一次；最后用50%NaC10溶液浸泡lOmin，用无菌水冲洗4-6次。将灭好菌的种子均匀接种于MSR3培养基(4.4g.L-1 MS+30g.L-1蔗H +ImL.L-1 R3 vitamins+lOg.L-1 琼脂粉，ρΗ5.9)上，置于 26°C (16h 光照)/18°C (8h 黑暗)的培养箱中培养大约8-10d。
[0055]预培养:待无菌苗长至子叶完全展开但真叶没有长出时，将子叶切下并切掉子叶的两个尖端，置于MS+2-4D液体培养液(4.4g.L—1 MS+30g.L—1蔗糖+0.2g.L—1KH2PO4+1mL.L-1 R3 vitamins+0.1mg.L-1 Kinetin+0.2mg.L-1 2_4D, pH5.7)中浸泡，然后将浸泡后的子叶外植体放置在Ml预培养基(MSR3培养基+0.87mg.L—1 IAA+1.75mg.L—1Zeatin)上弱光(用布遮盖)下预培养ld，培养皿要倒置以防止水凝聚流出。
[0056]制备农杆菌:使用热激法将构建的pC2300-p0T2-At-pr1-miR828质粒转化进农杆菌菌株GV3101中，并筛选阳性菌株。取转染pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的农杆菌菌种，于装有5mL液体LB的50mL离心管中过夜培养。
[0057]侵染与共培养:将培养好的农杆菌4200rpm离心5min，用等体积的LB重悬后再次4200rpm离心5min，用约50mL液体MS培养基重悬至OD6tltl=0.2-0.3。将预培养的子叶外植体转移到农杆菌悬液中侵染，振荡培养15min。倒掉侵染液,用MS+2-4D液体培养基冲洗残留的农杆菌，用灭菌滤纸吸去多余菌液，取一张灭菌滤纸铺在原来的预培养基上，将侵染过的子叶外植体置于其上，弱光下与农杆菌共培养I天，第二天换到新鲜的预培养基上，继续弱光培养I天。
[0058]选择培养:将共培养2天的子叶外植体转移到M13筛选培养基(MSR3培养基+0.87mg.L-1 IAA+1.75mg.L-1 Zeatin+75mg.L-1Kana+400mg.L-1 Augment in)上筛选培养，每个培养皿上大约15片，7天后转到新鲜的选择培养基上，并去掉遮布正常光照，每两个星期换一次，以保持抗生素的抗性，直到长出愈伤组织。
[0059]芽诱导及伸长和根诱导的培养:将长出直径l-2cm大愈伤组织的子叶外植体经过常规芽诱导、生根培养 后，移栽成活长成具有卡那霉素抗性的At-pr1-miR828转基因番茄植株(图9)。
[0060]参照常规CTAB法从幼嫩的番茄叶片中提取DNA。以转基因番茄叶片的基因组DNA为模板，以野生型番茄叶片的基因组DNA为阴性对照模板，以pC2300-p0T2-At-pri-miR828质粒为阳性对照模板，分别PCR扩增At-pri-miR828目的基因及pC2300载体上的氯霉素抗性基因Cmr，进行阳性转基因植株的鉴定。
[0061]目的基因的扩增引物为miR828-PF和miR828_PR，扩增片段长度467bp。
[0062]扩增Cmr基因的上游引物为Cmr-PF:5' -TGGAAGCCATCACAAACG-3'，下游引物为Cmr-PR:5/ -ATCGCTCTGGAGTGAATACC-3'，扩增片段长度 291bp。
[0063]图10为9棵转基因番茄植株miR828-l~miR828_9的PCR检测结果，除野生型及转化株miR828-8外，其它转基因番茄植株均扩增出约467bp的At-pri_miR828基因特异条带和约291bp的Cmr基因特异条带，表明At-pri_miR828基因已整合进番茄基因组。
[0064]实施例3:转基因番茄植株的实时荧光定量PCR分析。
[0065]从两个PCR鉴定结果为阳性的miR828过表达转基因番爺株系中各选取一棵转基因植株的嫩叶，用TRizol提取总RNA，并用DNase I进行处理。RNA浓度和质量用核酸蛋白检测仪(Nanodrop ND-1000，thermo)和电泳鉴定。以番茄sly-U6为内参基因，用实时荧光定量法检测miR828基因表达量；以番茄Sly-CAC为内参基因，检测miR828靶基因Sly-myb-likel (SGN320618)表达量。
[0066]miR828的3个引物序列如表1所不，即miR828 stem-loop RT引物、miR828正向引物和miR828通用反向引物。cDNA第一链的合成按PrimeScript? 1st Strand cDNASynthesis试剂盒(TaKaRa,中国)方法合成。合成体系包括dNTP mixture (1OmM),miR828 stem-loop RT 引物(10 μ mol.L-1)和 U6 反向引物(10 μ mol.L-1)各 1 μ L，RNA1μ g, RNase free H2O补足到10yL。65°C温育5min，迅速冰上冷却。然后在冰上按顺序加入 5XPrimeScript II Buffer 4μ L, RNA 酶抑制剂(RNasin) (40 U.μ L_1)0.5μ L,PrimeScript II RTase (200U/ μ L) 1 μ L, RNase free H2O 补足到 20 μ L。反转录条件为:50°C 30min ；95°C 5min。荧光定量分析用 SYBR Premix Ex Taqw (Tli RNaseH Plus)试剂盒在 Stratagene Mx3005P system PCR 仪上完成。体系为 25 μ L，包含 SYBR位Taq? 12.5 μ L、2.5mmol.171 dNTPs 5 μ L, Stratagene Mx3005P system PCR miR828 正反向引物和 50XR0X Reference Dye II 各 0.5 μ L，cDNA I μ L，RNase free H2O 补足到 20 μ L。扩增条件如下:95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 20s, 72°C 15s，35 个循环；95°C Imin ；55°C 30s,95°C 30s。数据分析根据Livak和Schmittgen(2001)方法进行，即ΔCt=Ct,目标基因_ Ct,内参基因目标基因的相对表达量(相对于内参基因)为2 ΔCT"，转基因植株基因表达的变化表不为对照的2_ΔCT记为1时目标基因2_ΔcT的相对值(即2_ΔΔcT)，各基因表达量用均值土标准差表示。结果显示，两颗转基因番茄植株中，表达量分别增加为对照的52倍和14倍，而Sly-myb-likel表达量分别下降为对照的7%和28% (图11)。
【权利要求】
1.基于拟南芥pr1-miR828基因的植物表达载体，所述植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828 中含有 At-pri_miR828 基因以及 pOT2 克隆载体 CaMV35s 启动子，具有SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，其中，所述At-pr1-miR828基因连接于pOT2克隆载体CaMV35s启动子下游，pOT2-At-pri_miR828基因连接于起始表达载体pC2300的I单酶切位点处。
2.权利要求1植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的构建方法，是以At-pr1-miR828基因片段连接pOT2克隆载体，得到pOT2-At-pri_miR828重组质粒，再连接线性化的PC2300表达载体和pOT2-At-pr1-miR828重组质粒，得到植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828。
3.根据权利要求2所述的植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的构建方法，包括以下步骤: 1)以At-pr1-miR828基因片段连接历/2dIII和&oR I双酶切的pOT2克隆载体，重组产物转化疋colimb α感受态细胞，得到pOT2-At-pr1-miR828重组质粒； 2)重组质粒pOT2-At-pr1-miR828和起始表达载体pC2300备PacI单酶切，用T4DNA连接酶连接线性化的pC2300表达载体和pOT2-At-pri_miR828质粒，酶连产物转化E.coliDm α感受态细胞，得到植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828重组质粒。
4.权利要求1植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828在调控植物花青素生物合成上的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中所述植物为`番茄、拟南芥、小麦或水稻。
【文档编号】C12N15/66GK103614412SQ201310571014
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月17日 优先权日:2013年11月17日
【发明者】贾小云, 贺立恒, 丁娜, 刘慧 , 沈洁, 金雷皓, 李芳 , 唐贵良 申请人:山西农业大学