一种人胃癌多药耐药细胞株的制作方法
【专利摘要】本发明采用人胃癌细胞BGC-823为诱导对象，采用大剂量冲击法，后采用逐步递增ADR浓度、间歇作用的体外诱导法，建立了人胃癌细胞多药耐药细胞株人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/ADR该细胞株已经于2013年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.8454。本发明的细胞株具有典型多药耐药特性，为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。
【专利说明】一种人胃癌多药耐药细胞株
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞工程【技术领域】，涉及一种人类细胞株，具体涉及一种人胃癌多药耐药细胞株及其建立方法。
【背景技术】
[0002]胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，致死率居各类肿瘤的第二位，我国是胃癌的高发区，胃癌年患病率和死亡率均为世界平均水平的2倍多。
[0003]由于早期胃癌的发现率低，大约2/3患者的病情在确诊时已属于进展期胃癌，而单纯性手术治疗常难以根治，化疗在综合治疗中发挥了重要作用，因此成为治疗胃癌的主要方法之一。但鉴于多药耐药(multi drug resistance, MDR)对胃癌化疗的影响,相当一部分病例化疗效果不理想。故研究胃癌的多药耐药产生机制对提高胃癌的化疗效果、延长病人的生存期有着重要的意义。
[0004]多药耐药是指肿 瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药。克服肿瘤多药耐药性，寻找逆转恶性肿瘤细胞多药耐药的新途径，提高肿瘤细胞对化疗的敏感性是当前肿瘤领域的重要课题之一。成功建立耐药肿瘤细胞模型是开展此研究的前提和基础。
[0005]瘤细胞耐药株的建立方法通常有两种，一是逐步增加药物浓度、持续诱导法，二是大剂量冲击法。通过耐药细胞株的建立可以进一步构建体内外肿瘤耐药模型，从而深入研究MDR耐药机制，甚至发现其他新的耐药机制。通过耐药细胞株的建立的体内外肿瘤耐药模型，可以用于抗肿瘤药物的筛选。
[0006]通过检索发现，目前国内外还没有关于以人胃癌细胞BGC-823为诱导对象，建立人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/ADR的文献报道。
【发明内容】
[0007]鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人胃癌多药耐药细胞株及其建立方法。本发明的细胞株具有典型多药耐药特性，为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。
[0008]本发明的目的是这样实现的:
[0009]本发明采用人胃癌细胞株BGC-823为诱导对象，前期诱导采用大剂量冲击法，后期诱导采用持续诱导法，建立了一种人胃癌细胞阿霉素耐药株BGC-823/ADR。该细胞株已经于2013年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CGMCCN0.8454。
[0010]具体地，本发明涉及的人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/ADR是按照如下方法建立获得:
[0011](I)人胃癌细胞株BGC-823用培养液(含10%小牛血清的RPM1-1640培养液)，5% C02, 37°C条件下，培养至70%~90 %贴壁率时，去上清，加入ADR50ng/ml冲击培养I小时，去ADR50ng/ml培养液，空白RPM1-1640培养液洗涤2次后，更换增殖培养液培养72_96h扩增存活细胞。至存活细胞扩增至70%~90%贴壁率时，再重复用ADR1000ng/ml培养液冲击培养I小时9次，即总共完成10次ADR50ng/ml培养液冲击培养I小时，进一步以此细胞为基础，1000ng/ml持续培养7天。
[0012](2)重复上述操作，将筛选条件依次改为ADR100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml培养液。
[0013]本发明通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、药物敏感试验、细胞内Rh-123研究及细胞周期的测定，评价人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/ADR的生物学特性，结果成功建立了 BGC-823/ADR耐药株，耐药指数为55.635，对顺钼(cDPP)、紫杉醇(Taxo I)、长春新碱(YCR)、氟尿嘧啶(5-FU )和依托泊苷(VP16 )产生了明显的交叉耐药性。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为BGC-823、BGC-823/ADR的细胞生长曲线图。
[0015]图2为BGC-823细胞株的细胞周期图
[0016]图3为BGC-823/ADR细胞株的细胞周期图
[0017]图4为罗丹明123在BGC-823细胞内的含量图
[0018]图5为罗丹明123在BGC-823/ADR细胞内的含量图
[0019]图6为本发明BGC-823/ADR细胞株的显微图。
【具体实施方式】
[0020]下面通过实施例进一步说明本发明。本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
[0021]实施例1人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/ADR的诱导建立
[0022]采用逐步递增ADR浓度、间歇作用的体外诱导法建立人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/ADR，具体步骤如下:
[0023]((I)人胃癌细胞株BGC-823用培养液(含10%小牛血清的RPM1-1640培养液)，5% C02,37°C条件下，培养至70%~90%贴壁率时，去上清，加入ADR50ng/ml冲击培养I小时，去ADR50ng/ml培养液，空白RPM1-1640培养液洗涤2次后，更换增殖培养液培养72_96h扩增存活细胞。至存活细胞扩增至70%~90%贴壁率时，再重复用ADR1000ng/ml培养液冲击培养I小时9次，即总共完成10次ADR50ng/ml培养液冲击培养I小时，进一步以此细胞为基础，1000ng/ml持续培养7天。
[0024](2)重复上述操作，将筛选条件依次改为ADR100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml培养液。
[0025](3)敏感细胞逐渐死亡，而耐药细胞继续生长。如此反复诱导、换液、传代，历时约6月，最终得到在800ng / mL ADR中稳定生长增殖的耐药株，命名为BGC-823/ADR。将该细胞冻存2月后复苏，在不含ADR的培养液中反复传代2月以上仍基本保持原来的耐药性。
[0026]实施例2耐药株形态学观察
[0027]取对数生长期的人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/ADR，于倒置显微镜下观察细胞形态，结果如图6所示:细胞形态变大，核皱缩，细胞易堆积成团。[0028]实施例3细胞生长曲线测定
[0029]细胞消化、计数、配制成浓度为5 X 103个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100 μ L细胞悬液(每孔500个细胞);6孔细胞培养板置于37°C，5%C02培养箱中分别培养2d、4d、6d、8d、IOd ;将96孔板进行MTT染色，λ =490nm,测定OD值；每孔加入20 μ L MTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4小时；弃去培养基，每孔加入150 μ L DMSO溶解，摇床10分钟轻轻地混匀；λ =490nm,酶标仪读出每孔的OD值以时间为横坐标、OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。BGC-823、BGC-823/ADR的细胞生长曲线见图1。
[0030]实施例4、PI染色法检测细胞周期
[0031]用0.25%胰酶消化对数生长期细胞，调节细胞密度为2 X 105/ml，接种于6孔培养板，培养24h ；0.25%胰酶消化，收取细胞；用4°C保存的0.01M PBS洗涤细胞3次，70%乙醇冰上固定5min, 2000rpm室温离心5min,重悬于冷PBSlml,备用；用流式细胞仪检测,激发波长为488nm，接收波长为575nm。结果显示，BGC-823G1期、S期、G2期细胞分别为70.96%、16.09%、12.95%, BGC-823/ADR Gl 期、S 期、G2 期细胞分别为 38.32%,28.91%,32.78%,BGC-823/ADR Gl期细胞减少，G2期、S期细胞增多，结果见图2、图3。
[0032]实施例5流式细胞仪检测罗丹明123蓄积
[0033]用0.25%胰酶消化对数生长期细胞，调节细胞密度为2 X 105/ml，接种于6孔培养板，培养24h ；0.25%胰酶消化，收取细胞；用4°C保存的0.01M PBS洗涤细胞3次，收集并调整细胞浓度为1父1071111，每管加入浓度为5呢/1111的罗丹明123500uL，37°C保温30min，500rpm离心2min，去除培养液，再用新培养液洗去细胞外的罗丹明染料，在37°C保温IOmin,使P-gp糖蛋白功能得以发挥，把药物泵出，再用培养液洗I次，放在冰冷的培养液中待检测，流式细胞仪用488nm的激发光，测试细胞荧光强度。结果见图4、图5。BGC-823细胞荧光强度为7727，BGC-823/ADR细胞荧光强度为113，BGC-823/ADR细胞内的细胞罗丹明123比BGC-823减少。
[0034]实施例6药物敏感试验
[0035]细胞消化、计数、配制成浓度为I X IO5个/ml的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入IOOul细胞悬液(每孔IX IO4个细胞)；96孔细胞培养板置于37°C，5%C02培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100 μ L相应的含药培养基，(4)96孔细胞培养板置于37°C，5%C02培养箱中培养24小时；将96孔板进行MTT染色，λ =490nm,测定OD值；计数各组别抑制率及药物IC50。
[0036]试验结果参见表1。根据表1的结果可以看出，BGC-823/ADR对阿霉素、氟尿嘧啶、顺钼、紫杉醇、长春新碱、依托泊苷的耐药指数是55.635,5.631,4.323,5.171,2.841、
3.177。
[0037]表1细胞株对各种化疗药物的IC50和耐药指数
[0038]
【权利要求】
1.一种人胃癌细胞阿霉素耐药 株BGC-823/ADR，保藏号为CGMCC N0.8454。
【文档编号】C12N5/09GK103740646SQ201310627417
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】不公告发明人 申请人:南京凯基生物科技发展有限公司