一种利用浮萍为原料制备2,3-丁二醇的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用浮萍为原料制备2,3-丁二醇的方法，属于环境生物技术和生物质能源领域。本发明以水生植物浮萍为主要原料，采用液态发酵方法制备2,3-丁二醇。生产工艺包括：添加α-淀粉酶和糖化酶对浮萍悬液进行糖化处理；向液体种子培养基中接种多黏芽孢杆菌，通过摇床震荡培养获得液态种子；向装有预处理好的浮萍细胞液发酵罐中接种体积比为6-8%的液态种子，通过发酵得到液态发酵产物。本发明不仅解决了浮萍在污水净化过程中因大量繁殖而可能导致的二次污染，而且也为2,3-丁二醇的生物炼制提供了可再生的原料来源。特别是该法作为非粮作物的2,3-丁二醇发酵的替代法，还可以有效缓解世界范围内粮食短缺的紧张局面。
【专利说明】—种利用浮萍为原料制备2, 3- 丁二醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用浮萍为原料制备2，3-丁二醇的方法，属于环境生物技术和生物质能源领域。
【背景技术】
[0002]当今世界面临资源短缺和环境污染两大难题，发展低碳、环保的循环经济发展模式已经迫在眉睫，而生物制造产业已成为当前发展低碳经济的重要途径之一。2，3- 丁二醇作为一种重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、能源、食品以及航空航天等多个等领域，因此它已经成为当前生物制造产物发展的重要领域之一。就其自身而言，它是一种极具价值的液体燃料，因而常备用作航空燃料山-2，3- 丁二醇由于极低的凝固点而用作抗冻剂。作为合成前体，由它合成的化合物则具有更广泛的功能，如双乙酰是一种具有很高价值的风味剂，3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)是一种天然食用香料，二者广泛应用在食品工业中；1，3- 丁二烯则用于合成橡胶、合成树脂的生产；甲乙酮不仅是一种高价值的液体燃料添加剂，而且也常用作低沸点溶剂，在粘结剂、涂料、燃料、润滑剂、油墨等行业应用十分广泛(戴建英，孙亚琴，孙丽慧，李丹，董悦生，修志龙.生物基化学品2，3-丁二醇的研究进展.过程工程学报，2010，10(1):200-208.)。目前用于2，3-丁二醇生产的方法主要有化学法和生物发酵法两大类，化学法采用的是石油化工路线，需高温高压，且工艺复杂、污染严重；相比而言，生物发酵法则可以弥补上述缺陷，特别是对于2，3-丁二醇的手性结构特征，生物发酵法则具有化学法无法比拟的优势。而生物发酵法生产又常以淀粉、乳清和糖蜜为原料，需要指出的是后两者的资源有限，而淀粉又将与我国粮食短供需的不足相矛盾，因此寻求廉价的非粮物质发酵原料已经成为制约该产业发展的瓶颈问题，特别是关于利用浮萍为原料发酵生产2，3- 丁二醇的 研究还没有报道。
[0003]浮萍是一种漂浮的单子叶水生植物，在全世界广泛分布，常见于静止或流动性不大的水体及湖泊的港湾部分，共有4属40个种，其中以芜萍、紫背浮萍、稀脉浮萍、三叉浮萍、槐叶萍和满江红较为常见。浮萍不仅可以吸收污染水体中的氮、磷等营养物质，而且其生长速率高并可以耐受多种污水条件，因此该类植物是污水处理生态工程中重要的水生植物类群(张营，郜炜，景逵，曲文杰，李崇.凤眼莲和浮萍对水中硝基苯的净化及动力学研究.辽宁大学学报自然科学版，2013,40(1):92-96)。此外，浮萍的营养成分也非常丰富，蛋白质含量高，纤维含量低，淀粉含量因不同种而有很大变化，通常约25%左右(Klass DL.Duckweed Plants for ffaste-water Reuse and Biomass Production [M].Chicago:1nstitute of Gas Technology, 1993:423-432.)。如果种植条件适宜，其生产能力也非常可观，每公顷每年大约能生产淀粉11.4t (赵昭，姚广保，张艺琼，赵玄.猪场污水中浮萍生物量和淀粉含量变化研究.四川大学学报(自然科学版)，2012，49(3):693-698)。因此，它可以作为一种非常好的天然培养基，满足微生物对碳源、氮源的需求，特别是它的再生能力很强，因此它是极好的2，3- 丁二醇非粮发酵的替代原料，目前以浮萍为原料制备燃料乙醇、生物柴油和丁醇的报道较多，但是利用它为原料发酵产2，3- 丁二醇的研究并未出现。
[0004]浮萍是一类可再生资源，它在净化污水的同时，也为生物能源的炼制提供了丰富的原料，特别是浮萍在净化污水后将大量繁殖，其巨大的数量如果不能及时处理，也将造成水体的二次污染，因此将浮萍的生物能源处理与污水治理耦合进行，将会取长补短，起到事半功倍的效果，因此该技术具有广阔的发展前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种利用浮萍为原料制备2，3- 丁二醇的方法。
[0006]技术解决方案:
[0007]制备方法如下:
[0008]I)发酵培养基的制备:采用下列原料，质量体积比为:浮萍淀粉水解液总糖浓度80.0g/L,酵母膏 6.0g/L, (NH4)2HPO4L Og/L, KC10.2g/L, MgSO4 ? 7H200.3g/L, CaC033g/L,pH6.0，将上述培养基在115°C下，高压灭菌30min备用；
[0009]2)发酵条件的设定:然后按6%_8%(V:V)的接种量接入液态种子，先在30°C、200r/min条件下发酵24h，接着在温度不变的情况下调整转速160r/min，发酵24h，以利于2，3- 丁二醇的合成，最后通过高效液相色谱检测2，3 一丁二醇的含量。
[0010]本发明生产的2，3-丁二醇具有环境友好的特点，不仅解决了浮萍在污水净化过程中因大量繁殖而可能导致的二次污染，而且也为2，3-丁二醇的生物炼制提供了可再生的原料来源。特别是该法作为非粮作物的2，3-丁二醇发酵的替代法，还可以有效缓解世界范围内粮食短缺的紧张局面。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为本发明流程图。
【具体实施方式】
[0012]浮萍淀粉水解液的制备:将浮萍洗净、干燥，然后粉碎过60目筛，利用无菌水按1:8的体积比例将其调制成悬浊液，然后向其中加入中温a -淀粉酶和0.2%的CaCl2,于60°C液化数分钟，期间用碘液检测淀粉的降解效果，直至颜色由蓝色变为棕橙色为止。接着在沸水浴状态下将过量的a-淀粉酶酶活灭活。
[0013]待其冷却后，在pH值约为4.5的条件下再向其中加入糖化酶使其充分降解为单糖，多余的糖化酶再在沸水浴条件下灭活，最后利用3，5- 二硝基水杨酸法测定其还原糖的含量(具体方法参照陈毓荃主编.生物化学实验方法和技术，北京:科学出版社，2002)。其原理是利用还原糖能在碱性条件下与二硝基水杨酸发生氧化还原反应，而反应终产物3-氨基-5-硝基水杨酸在沸水浴条件下呈现出棕红色，且该产物颜色的深浅与还原糖的量成正比。
[0014]种子制备及培养:发酵菌种选取多黏芽孢杆菌(Bacillus polymyxa),其原因主要是因为该菌种不仅能够利用多种还原糖碳源，特别是它还能够分泌淀粉酶。利用液体种子培养基制备发酵所需液态种子。培养基(g/L)配制方法如下:取浮萍淀粉水解液还原糖浓度为 2.0，葡萄糖 3.0，酵母膏 5.0，(NH4) 2HP041.0，KC10.2，MgSO4 ? 7H200.3，pH6.0，用高压灭菌锅在115°C灭菌25-30min备用。接种方法是先用接种环将目的菌种接种到100ml液体种子培养基中，再用摇床在30°C、150r/min条件下培养24h即得到液态种子。
[0015]发酵培养基(g/L)的制备:浮萍淀粉水解液总糖浓度80.0，酵母膏6.0，(NH4)2HPO4L 0，KC10.2，MgSO4 ? 7H200.3，CaC0s3, pH6.0。同样，以上培养基在 115。。下，高压灭菌30min备用。然后按5-10%(V:V)的接种量将入液态种子，先在30°C、200r/min条件下发酵24h，使其有利于种子的菌体生长，接下来在温度不变的情况下调整转速160r/1^11，发酵2411，以利于2，3-丁二醇的合成(杨欢欢，高健，徐虹，邵荣.利用菊芋菊粉制备R，R-2，3-丁二醇发酵工艺条件的优化?食品与发酵工业，2011，37(11):6-10)。从而提高目的产物产量。
[0016]2，3-丁二醇的提取和定量分析:采用高效液相色谱法从发酵液中分离纯化2，3-丁二醇。具体方法参照张媛丽的方法((张媛丽.菊芋发酵液中2，3—丁二醇的盐析萃取.大连理工大学2011届硕士毕业论文，16-25)。其工艺流程如下:先将发酵液在8000r/min的条件下离心20min，以去除发酵液中大量的残渣和细小微粒，再用滤膜过滤，之后再将所得上清液经高效液相色谱分离纯化。鉴于检测浓度的问题，所得上清液要进行适当的倍数稀释。色谱条件如下:玻璃管填充色谱柱，填料为ChromsorblOl, 5mmX 2m ;检测器为FID，柱温为170°C，汽化室的温度为200°C，检测器的温度为220°C ;载气为N2，流速50ml/min，样品进样量为lul，采用外标法测定产物的含量。
[0017]实施例1
[0018]用250ml的三角瓶进行摇瓶发酵培养。发酵培养基的总体积为60ml,其中各成分的质量体积比例如下:浮萍淀粉水解液总糖浓度80.0g/L，酵母膏6.0g/L, (NH4)2HPO4L Og/L，KC10.2g/L，MgSO4 ? 7H200.3g/L，CaC033g/L, pH6.0。将上述培养基在 115°C下，高压灭菌30min备用。然后按8%(V: V)的接种量将入液态种子，先在30°C、200r/min条件下发酵24h，接着在温度不变的情况下调整转速160r/min,发酵24h,以利于2，3- 丁二醇的合成,最后通过高效液相色谱检测2，3 一丁二醇的含量。
[0019]实施例2
[0020]取8g浮萍粉(淀粉含量30%，蛋白质含量15%)、3.6g酵母膏、6.0g(NH4)2HPO4U.2gKC1、1.8gMgS04 WH2OjPTv 48.4ml的蒸馏水，置于250ml的三角瓶中，用盐酸和氢氧化钠调节PH值至6.0，并向制备好的液体培养基中加入质量体积浓度为0.2%的CaCl2以保证酶解效果，然后分别用中温a -淀粉酶和糖化酶使淀粉糖化，115°C灭菌30分钟，最后向其中加入经过干热灭菌的，CaC034.8g，然后按6%(V:V)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在30°CU60r/min条件下于发酵60h后，利用高效液相色谱检测发酵产物的类型并对其进行定量。
【权利要求】
1.一种利用浮萍为原料制备2，3- 丁二醇的方法，其特征在于，I)发酵培养基的制备:采用下列原料，质量体积比为:浮萍淀粉水解液总糖浓度80.0g/L,酵母膏6.0g/L,(NH4)2HPO4L 0g/L，KC10.2g/L,MgSO4 *7H200.3g/L, CaC033g/L, pH6.0，将上述培养基在 115°C下，高压灭菌30min备用；2)发酵条件的设定:然后按6%_8%(V:V)的接种量接入液态种子，先在30°C、200r/min条件下发酵24h，接着在温度不变的情况下调整转速160r/min，发酵24h，以利于2，3- 丁二醇的合成，最后通过高效液相色谱检测2，3 一丁二醇的含量。
【文档编号】C12R1/12GK103614419SQ201310627393
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】潘建刚, 蔡禄, 张艾艾, 高国日, 张金艳 申请人:内蒙古科技大学