一种鲍氏不动杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鲍氏不动杆菌及其应用，本发明的鲍氏不动杆菌命名为鲍氏不动杆菌DD1（Acinetobacter?baumannii?DD1），保藏号为CCTCC?NO:M?2013560，于2013年11月8日保藏于位于中国·武汉·武汉大学内的中国典型培养物保藏中心。将所述鲍氏不动杆菌接种至含有二噁烷的废水或者通入二噁烷废气的无机盐培养基中中培养，能够实现二噁烷的完全降解，还可以降解甲苯、苯酚、四氢呋喃等污染物。本发明菌株为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，能够以二噁烷为唯一碳源和能源生长同时高效降解该底物；该菌株能降解甲苯、苯酚、四氢呋喃等多种污染物；本发明为采用生物法净化含有二噁烷废水、废气的工程应用奠定了基础。
【专利说明】一种鲍氏不动杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种二B,惡烧的降解方法,具体涉及一种鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)及其应用。
【背景技术】
[0002]I, 4- 二氧杂环己烷(1，4-dioxane)，别名二噁烷，具有很好的水溶性，是一种良好的有机溶剂，可与乙醇、乙醚、丙酮、苯酚等相容，被广泛应用于油漆、染料、制药等行业，也应用于食品、化妆品和洗涤剂等消费产品中。二噁烷对皮肤、眼部和呼吸系统有刺激性，可在人体内累积，对肝脏、肾和神经系统有严重的损害，慢性累积中毒可导致尿毒症、肾衰竭等疾病，急性中毒可能导致死亡，被美国环保署(U.S.EPA)和世界卫生组织国际肿瘤研究中心(IARC)归类为B2级(可能的)人类致癌物。
[0003]二噁烷的大量应用，导致地表水和地下水的污染日益严重。目前，在美国、加拿大和日本等多个发达国家的地下水和填埋场中均检测到二噁烷的污染；在加拿大渥太华、安大略湖及加拿大附近的垃圾填埋场的地下水中检测出高浓度二噁烷；我国黄河也检测出大量二噁烷，且在兰州段的土著鱼类内脏中检测亦出二噁烷的累积。更有研究表明，即使在人烟罕至的北极冻土和地下水中也检测到了二噁烷的存在。因此，地表水和地下水中二噁烷的去除刻不容缓，亟需一种行之有效的方法将其去除。
[0004]目前国内外对于去除二噁烷的方法主要是化学氧化法，包括臭氧、UV光照、过氧化氢和Fenton氧化等，这些方法都具有各自的优点，但是此类方法处理成本过高，不适用于二噁烷的环境污染治理。由于二噁烷具有环醚结构、C-O高能键、低亨利常数和低辛醇-水分配系数等理化性质，一度被归为“不易生物降解物质”。
[0005]1991年，德国学者Bemhardt等从二噁烷化工厂的污泥中首次分离出了具有二噁烧降解能力的菌株Rhodococcu s ruber219,第一次实现了生物降解二噁烧。从而,越来越多的研究者开始关注生物法处理二噁烷的研究。1993年，Burback等有分离出一株具有二n惡烧降解能力的菌株Mycobacterium vaccae,但是该菌株的二噁烧降解能力有限且不能持续生长。Young-Mo Kim等报道的分支杆菌PH-06可以在15天内将1000mg/L的二Il惡烧降解90%,但是降解周期过长。Nakamiya等分离出的真菌Cordyceps sinensis也可以将二噁烷作为唯一碳源和能源持续生长。目前报道的二噁烷降解菌还有Pseudonocardiadioxanivorans CBl 190,Pseudonocardia B5,Bacillus pumilus D4 以及Xanthobacter D7
坐寸ο
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)及其应用，该鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)对二噁焼的降解率达到99.9%以上，还可以降解甲苯、苯酚、四氢呋喃等污染物。
[0007]一种鲍氏不动杆菌，命名为鲍氏不动杆菌DDl(Acinetobacter baumanniiDDl )，保藏号为 CCTCC N0:M2013560o
[0008]本发明的鲍氏不动杆菌DDl (Acinetobacter baumannii DDl)于 2013 年 11 月 8日保藏于位于中国.武汉.武汉大学内的中国典型培养物保藏中心。
[0009]本发明的鲍氏不动杆菌DDl采集于污水处理厂的二沉池活性污泥，形状为短杆状，大小为1.0~1.5X1.5~2.5 μ m，无鞭毛，无芽孢；在固体平板培养基30°C培养48h后，单菌落呈圆球状，光滑湿润，菌苔沿划线生长；革兰氏染色为阴性，氧化酶、接触酶实验为阴性；明胶、柠檬酸盐、硝酸盐还原实验为阳性；对卡那霉素、利福霉素具有抗性，对四环素无抗性；盐度大于4%以上生长缓慢。
[0010]本发明还提供了一种如所述鲍氏不动杆菌在降解二噁烷中的应用。
[0011]该应用具体为:将所述鲍氏不动杆菌接种至含有二噁烷的废水、含有二噁烷的无机盐培养基或者通入有二噁烷废气的无机盐培养基中培养，降解二噁烷。
[0012]所述鲍氏不动杆菌DDl (Acinetobacter baumannii DDl)能利用二噁烧作为唯一的碳源和能源物质生长繁殖，将二噁烷矿化成CO2和H20。在纯培养条件下，该菌在42h内能将无机盐培养基中的100mg/L的二噁烷完全降解。
[0013]进一步优选，所述培养在pH值为5.0~8.0、温度为25 V~40°C的范围内进行。更优选为在PH值为7.0、温度为32°C的范围内进行。
[0014]进一步优选，所述废水中二噁烷的初始浓度为100mg/L~500mg/L ;所述含有二噁烷的无机盐培养基中二噁烷的初始浓度为100mg/L~500mg/L ;所述通入二噁烷废气的无机盐培养基中二噁烷的初始 浓度为100mg/L~500mg/L。更优选均为200mg/L。
[0015]所述通入二噁烷废气的无机盐培养基中二噁烷的初始浓度为100mg/L~500mg/L是指:无机盐培养基中的二噁烷初始浓度是指通入的二噁烷废气中溶于无机盐培养培养基中的二噁烷初始浓度，因此，二噁烷废气的通入量以无机盐培养基中二噁烷所需初始浓度进行计量。
[0016]进一步优选，培养时间为20~50h，更优选为42h。
[0017]进一步优选，所述无机盐培养基(MSM)包含如下物质:3.5g Na2HPO4.2H20、1.0gΚΗ2Ρ04、0.5g (NH4)2SO4'0.1g MgCl2.6Η20、0.05g Ca (NO3)2，溶于 1000mL 水中，加入 Iml 微量
元素溶液，调节pH至7.0~7.2。含有二噁烷的无机盐培养基或者通入有二噁烷废气的无机盐培养基的培养基成分部分相同。
[0018]所述微量元素溶液组成为FeSO4.7H201.0g、CuSO4.5Η200.02g、H3BO30.014g、MnSO4.4H200.10g、ZnSO4.7H200.10g、Na2MoO4.2H200.02g、CoCl2.6H200.02g，溶于 1000mL水中。
[0019]本发明的鲍氏不动杆菌还可以用于降解苯酚、甲苯、四氢呋喃或者邻二甲苯。
[0020]将所述鲍氏不动杆菌接种至含有苯酚、甲苯或四氢呋喃的无机盐培养基中培养，降解苯酚、甲苯或四氢呋喃。其他降解条件跟降解二噁烷一样，降解时间有所不同，本发明的菌株对苯酚降解20h的降解率达到99.9%，对甲苯降解24h的降解率达到50%，对四氢呋喃降解48h的降解率达到99.9%。
[0021]本发明的鲍氏不动杆菌还用于降解正丁醇、正己烷、乙醇或苯，降解率均达到99.9%。降解处理的方法同降解二噁烷一样，降解时间有所不同，正丁醇的最佳降解时间为24h,正己烧的最佳降解时间为108h,乙醇的最佳降解时间为24h,苯的最佳降解时间为24h。
[0022]本发明的有益效果为:
[0023]本发明提供了一株能高效降解二噁烷的鲍氏不动杆菌，该菌株为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，能够以二噁烷为唯一碳源和能源生长同时高效降解该底物，降解率达到99%以上；该菌株能降解甲苯、苯酚、四氢呋喃等多种污染物；本发明为采用生物法净化含有二噁烷废水或者废气的工程应用奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为Acinetobacter baumannii DDl降解二噁烧及菌体生长情况；
[0025]图2为不同pH对于菌体浓度和二噁烷降解率的影响；
[0026]图3为不同温度下二噁烷浓度随时间变化情况；
[0027]图4为不同二噁烷初始浓度下二噁烷浓度随时间变化情况；
[0028]图5为Acinetobacter baumannii DDl降解苯酚及菌种生长情况；
[0029]图6为Acinetobacter baumannii DDl降解四氢呋喃及菌种生长情况。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例对发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0031]无机盐培养基(MSM)包含如下物质:3.5g Na2HPO4.2Η20、1.0g KH2PO4'
0.5g (NH4)2SO4'0.1g MgCl2.6Η20、0.05g Ca (NO3)2，溶于 1000mL 水中，加入 Iml 微量元素溶液，调节pH至7.0~7.2。
[0032]微量元素溶液组成为FeSO4.7H201.0g、CuSO4.5Η200.02g、H3BO30.014g、MnSO4.4H200.10g、ZnSO4.7H200.10g、Na2MoO4.2H200.02g、CoCl2.6H200.02g，溶于 1000mL水中。
[0033]实施例1:Acinetobacter baumannii DDl 的分离与鉴定
[0034](1)样品采集及驯化
[0035]现场采集杭州七格污水处理厂二沉池的活性污泥，以二噁烷为唯一碳源和能源，进行驯化、富集。数月后，经富集后的活性污泥，接种到含有IOOmL MSM培养基的250mL三角锥形瓶中，以二噁烷作为唯一碳源和能源物质，继续培养、富集。实验需恒温(30土1C)，并保持在好氧条件下进行。
[0036](2)菌株分离与鉴定
[0037]将经过多次传代富集的混合菌液进行梯度稀释，用涂布法的形式接种到仅以二噁烧作为唯一碳源的无机盐琼脂培养基上，置于恒温培养箱(30°C )中培养。挑取单菌落。对单菌落进行多次划线分离后，再接回含二噁烷100mg/L的MSM培养基)中进行培养，测试其是否具有降解二噁烷的能力。选取具有降解能力的菌种进行进一步的分离纯化，直至分离出具有二噁烷降解能力的菌株DD1。
[0038]菌株形状为短杆状,大小为1.0~1.5 X 1.5~2.5 μ m,无鞭毛,无芽孢；在固体平板培养基30°C培养48h后，单菌落呈圆球状，淡黄色，光滑湿润，菌苔沿划线生长；革兰氏染色为阴性；明胶、柠檬酸盐、硝酸盐还原实验为阳性；氧化酶、接触酶实验为阴性；对卡那霉素、利福霉素具有抗性，对四环素无抗性；盐度大于4%以上生长缓慢。
[0039]上述特征与《伯杰细菌鉴定手册》编录的不动杆菌属的生理生化性状相吻合。该菌株经Biolog微生物鉴定以及16S rDNA同源性分析，结合以上的生理生化的菌学特征，将其鉴定为鲍氏不动杆菌，16S rDNA的全基因序列如SEQ ID NO:1所示，GenBank登录号为KF713537。
[0040]将该鲍氏不动杆菌命名为鲍氏不动杆菌DDl (Acinetobacter baumannii DDl),于2013年11月8日保藏在位于中国.武汉.武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC NO:M2013560o
[0041]实施例2:Acinetobacter baumannii DDl 降解二噁烧的特性
[0042](I)二噁烧作为 Acinetobacter baumannii DDl 的唯一碳源，接种 Acinetobacterbaumannii DDl菌体至IOOmL无机盐培养基中，初始菌体0D_为0.01 ;加入二噁烷使初始二噁烷浓度为100mg/L。置于温度为30°C，转数为130r/min的摇床中培养，定期取样，培养42h时，菌株的OD值达到最大值0.183，结果见图1。
[0043]由图1可知，随着时间的延长，菌种的浓度也不断增大。本实施例说明降解菌Acinetobacter baumanniiDDl可利用二噁烧作为唯一碳源和能源进行生物繁殖,并且具有高效降解二噁烷的能力。
[0044](2)用NaOH或者HCl溶液调节无机盐培养基至不同pH值(5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、
8.0)，在初始的二噁烷浓度为100mg/L的条件下，接入菌株使初始菌体0D_为0.01。将样品置于30°C、130r/min恒温摇 床里振荡培养，培养35h后取样，结果见图2。
[0045]由图2可见，在pH5.0~8.0范围内，微生物均可较好的降解二噁烷，并伴随细胞浓度的增长；随着PH的不断增大，菌株浓度及二噁烷降解率先升高后下降，降解的最适pH为 7.0。
[0046](3)在初始的二噁烷浓度为100mg/L的无机盐培养基中，接入菌株使初始菌体OD600为0.0I。将各个样品的温度分别设置为25 °C、30°C、32 °C、37 °C、40°C，置于130r/min恒温摇床里振荡培养，定时取样，测定二噁烷的残余浓度，结果见图3。由图3可知，在25°C~40°C的范围内，菌株均可生长，降解速率随着温度的上升有一个先上升后下降的过程，在32 °C时降解速率达到最大。
[0047](4)在二噁烷初始浓度分别为 100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L 的无机盐培养基中，接入菌株使初始菌体0D_为0.01，将样品置于30°C、130r/min恒温摇床里振荡培养，定期取样，结果见图4。由图4可知，除500mg/L之外，都能完全降解，降解速率随着浓度的升高有一个先上升后下降的过程，其中在200mg/L的情况下，降解速率最快。
[0048]实施例3:Acinetobacter baumannii DDl降解苯酌二和四氢呋喃
[0049]分别以苯酌.和四氢呋喃作为Acinetobacter baumannii DDl的唯一碳源和能源，在初始浓度都为100mg/L的无机盐培养基中，接入菌株使初始菌体0D_为0.01，将样品置于30°C、130r/min恒温摇床里振荡培养,定期取样,结果见图5、图6。
[0050]由图5的结果可知，随着培养时间的延长,菌种的浓度增加,苯酹的浓度降低，当培养时间超过20h时，苯酚基本降解完全；
[0051]由图6的结果可知，随着培养时间的延长，菌种的浓度增加，四氢呋喃的浓度降低，当培养时间达到70h时，四氢呋喃基本降解完全；[0052]实施例4:Acinetobacter baumannii DDl底物广谱性降解情况
[0053]在无机盐培养基中，分别加入各种底物(即分别以表1中的底物为单一碳源)，投加量见下表1，接入菌株使初始菌体OD6tltl为0.01，将样品置于30°C、130r/min恒温摇床里振荡培养，定期取样测定，结果显示，菌株无法直接利用三氯甲烷、三氯乙烯、三氯乙酸、异辛烷等污染物，可直接利用的底物情况见下表1。
[0054]表1Acinetobacter baumannii DDl 底物广谱性降解情况
[0055]
【权利要求】
1.一种鲍氏不动杆菌，其特征在于，命名为鲍氏不动杆菌DDl (Acinetobacterbaumannii DDl)，保藏号为 CCTCC NO:M2013560。
2.一种如权利要求1所述鲍氏不动杆菌在降解二噁烷中的应用。
3.如权利要求2所述鲍氏不动杆菌在降解二噁烷中的应用，其特征在于，将所述鲍氏不动杆菌接种至含有二噁烷的废水、含有二噁烷的无机盐培养基或者通入有二噁烷废气的无机盐培养基中培养，降解二噁烷。
4.如权利要求3所述鲍氏不动杆菌在降解二噁烷中的应用，其特征在于，所述培养在pH值为5.0~8.0、温度为25°C~40°C的范围内进行。
5.如权利要求3所述鲍氏不动杆菌在降解二噁烷中的应用，其特征在于，所述废水中二噁烷的初始浓度为100mg/L~500mg/L ;所述含有二噁烷的无机盐培养基中二噁烷的初始浓度为100mg/L~500mg/L ;所述通入有二噁烷废气的无机盐培养基中二噁烷的初始浓度为 100mg/L ~500mg/L。
6.如权利要求3所述鲍氏不动杆菌在降解二噁烷中的应用，其特征在于，所述无机盐培养基包含如下物质:3.5g Na2HPO4.2Η20、1.0g ΚΗ2Ρ04、0.5g(NH4)2S04、0.1g MgCl2.6H20、0.05g Ca (NO3)2，溶于1000mL水中，加入Iml微量元素溶液，调节pH至7.0~7.2。
7.如权利要求6所述鲍氏不动杆菌在降解二噁烷中的应用，其特征在于，所述微量元素溶液组成为=FeSO4.7Η201.0g、CuSO4.5Η200.02g、H3BO30.014g、MnSO4.4H200.10g、ZnSO4.7H200.10g、Na2MoO4.2H200.02g、CoCl2.6H200.02g，溶于 1000mL 水中。
8.一种如权利要求1所述鲍氏不动杆菌在降解苯酚、甲苯、正丁醇、正己烷、乙醇、苯、四氢呋喃或者邻二甲苯中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK103695351SQ201310700768
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】周玉央, 沈东升, 黄焕林, 殷峻, 李娜 申请人:浙江工商大学