ω-氨基脂肪酸的生产的制作方法
【专利摘要】本发明涉及全细胞催化剂，其表达重组α-双加氧酶、或重组脂肪酸还原酶和将所述脂肪酸还原酶进行磷酸泛酰巯基乙胺化的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的组合，且其除了表达α-双加氧酶和/或脂肪酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的组合以外还表达转氨酶，其中，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和/或转氨酶优选地为重组体；还涉及用于将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯转化成胺的方法，所述方法包括下述步骤：通过与烷烃羟化酶和/或醇脱氢酶接触，将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯氧化成氧化产物，使所述氧化产物与磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶或α-双加氧酶接触以产生醛，和使所述醛与转氨酶接触。
【专利说明】ω-氨基脂肪酸的生产
[0001]本发明涉及全细胞催化剂，其表达重组α-双加氧酶、或重组脂肪酸还原酶和将所述脂肪酸还原酶进行磷酸泛酰巯基乙胺化的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的组合，且其另外表达转氨酶，其中，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和/或转氨酶优选地为重组体；还涉及用于将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯转化成胺的方法，所述方法包括下述步骤:通过与烷烃羟化酶和/或醇脱氢酶接触，将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯氧化成氧化产物，使所述氧化产物与磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶或α -双加氧酶接触以产生醛，和使所述醛与转氨酶接触。
[0002]聚酰胺是一类以重复的酰胺基为特征的聚合物。术语“聚酰胺”不同于化学上有关的蛋白，通常涉及合成的、商购可得的热塑性塑料。聚酰胺源自伯胺或仲胺，所述伯胺或仲胺常规地在烃裂化中得到。但是，衍生物(更精确地讲，氨基羧酸、内酰胺和二胺)也可以用于聚合物生产。也感兴趣的是作为起始物(Edukt)的短链气态烷烃，其可以通过生物技术方法从可再生原料开始得到。
[0003]许多具有巨大商业需求的聚酰胺从内酰胺生产。例如“聚酰胺6”可以通过ε -己内酰胺的聚合得到，“聚酰胺12”可以通过月桂内酰胺的聚合得到。其它商业上感兴趣的产物包括内酰胺的共聚物，例如ε-己内酰胺和月桂内酰胺的共聚物。
[0004]胺的常规工业化学生产依赖于化石原料的供给，且是低效的，并且在该过程中，形成大量不希望的副产物，在许多合成步骤中，多达80%。这样的过程的一个例子是月桂内酰胺的生产。常规地，这通过多级过程来实现，所述多级过程不仅提供低产率，而且同时需要提供昂贵的基础设施。
[0005]考虑到这些缺点，开发了使用生物催化剂从可再生原料得到胺的方法。可能的可再生原料具体地是脂肪酸源，其可以以下述形式得到:菜油、大球花蓟油、棕榈坚果油、椰子油、葵花子油和得自许多生物学来源(尤其是植物)的类似天然产物。
[0006]PCT/EP2008/067447描述了使用细胞来生产化学上有关的产物(更精确讲，ω-氨基羧酸)的生物技术系统，所述细胞具有许多合适的酶活性，且能够将羧酸转化成对应的ω -氨基羧酸。所述方法包括一系列酶促催化的反应，尤其是将末端碳原子处的脂肪酸氧化为醛，随后使用转氨酶和作为胺供体的氨基酸进行胺化，所述胺供体可以通过氨基酸脱氢酶再生。
[0007]但是,在其中使用的得自恶臭假单胞菌iPseudomonas putida) GPOl的AlkBGT氧化酶系统的已知缺点在于，它不能执行脂族烷烃至伯醇的选择性氧化。相反，形成大量氧化产物，尤其是，更高度氧化的产物(诸如对应的醛、酮或对应的羧酸)的比例随着反应时间增加而增加(C.Grant, J.M.Woodley 和 F.Baganz (2011), Enzyme and MicrobialTechnology 48，480-486)，这会相应地降低期望的胺的产率。
[0008] 形成的氧化产物在结构上非常类似的事实，会加重相对非选择性氧化的问题。这意味着，非常难以有效地和在没有显著产率损失下将它们与期望的氧化产物分离。
[0009]该方法的另一个缺点在于，过度氧化的副产物(例如用作起始物的脂肪酸的二羧酸)、疏水溶剂和疏水液体阳离子交换剂(根据PCT/EP2011/071491，其可以用于从水性反应混合物中分离产物)的重复利用是以资源利用效率为代价。
[0010]在这方面，应当强调的是，如PCT/EP2008/067447所述的具有一系列反应(其中的每个单独反应由一种特定酶催化)的生物技术系统的复杂性使得难以优化反应条件。因此，在基本上以反应性的ω-氨基脂肪酸作为产物的情况下，存在从细胞内部的某种临界浓度起它们将与生物体的必需组分反应的可能性，并因而具有毒性效应。如果这是事实，那么生物体的生长和合成能力会受损，甚至导致细胞的死亡，而开发者不能直接识别毒性或甚至将它归因于特定起始物、中间体或产物。也难以预测何种生物体耐受化学反应性物质的何种浓度。
[0011]也关于要提高的产物产率和要减少的副产物形成，本领域技术人员常规地不能鉴别系统(诸如在PCT/EP2008/067447中描述的系统)中的限制性因素和决定性因素。如果产物产率过低，那么这可能是因为酶之一以过低的浓度存在，而不知道这是可能的酶中的哪一种，即由于合成能力不足，在预测的时间段中或在被竞争酶降解之前，起始物未被转化。可替换地，完全可能的是，酶实际上在细胞中以多肽的形式是可检测的，但是在该特定细胞中，不具有为活性必需的折叠，或者缺乏迄今未知的、但是为活性所必需的辅因子。同样地，如已提及的，代谢产物可以是对细胞有毒的，或者被降解。最后，必须考虑与内源酶(即在用作全细胞催化剂的细胞中天然存在的那些)的干扰性相互作用。
[0012]因此，需要从脂肪酸生产ω-氨基脂肪酸的方法，其中酶促催化的反应更选择性地进行，并且使不希望的副产物的形成最小化。
[0013]在该背景下，作为本发明的基础的问题是，提供就产率、碳和/或氮平衡和/或纯度而言尽可能有效的生产ω-氨基脂肪酸的生物技术方法。
[0014]作为本发明的基 础的另一个问题是，提供就产率、碳和/或氮平衡、使用的试剂的可复用性和/或产物的纯度而言尽可能有效的将羧酸酯转化成胺化的羧酸酯的生物技术方法。在此方面下，有效的碳和/或氮平衡优选地被理解为是指，在期望的终产物中重现用于转化合适底物形式的羧酸酯而供料到细胞的尽可能高的碳和/或氮含量，而不是例如转化成不期望的产物。
[0015]作为本发明的基础的另一个问题是，提高得自羧酸酯转化的多相反应混合物的可处理性，尤其是就用于处理使用的疏水溶剂和液体阳离子交换剂的可复用性而言，和就两相系统中的相形成和相分离而言，所述两相系统包含水相(在其中进行羧酸酯的转化)和有机相(含有有机溶剂和/或液体阳离子交换剂)。
[0016]本申请的主题和尤其是附带的独立权利要求的主题解决了这些和其它问题，其中实施方案来自从属权利要求。
[0017]在第一方面，全细胞催化剂解决了作为本发明的基础的问题，所述全细胞催化剂表达重组α -双加氧酶、或重组脂肪酸还原酶和将所述脂肪酸还原酶进行磷酸泛酰巯基乙胺化的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的组合，且其另外表达转氨酶，其中所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和/或转氨酶优选地为重组体。
[0018]在第一方面的第一个实施方案中，全细胞催化剂解决了所述问题，所述全细胞催化剂另外表达优选地为重组体的氨基酸脱氢酶。
[0019]在也是第一个实施方案的一个实施方案的第二个实施方案中，全细胞催化剂解决了所述问题，所述全细胞催化剂另外表达优选地为重组体的烷烃羟化酶。[0020]在也是第一至第二个实施方案的一个实施方案的第三个实施方案中，全细胞催化剂解决了所述问题，所述全细胞催化剂另外表达优选地为重组体的AlkL家族的多肽。
[0021]在也是第一至第三个实施方案的一个实施方案的第四个实施方案中，全细胞催化剂解决了所述问题，所述全细胞催化剂另外表达优选地为重组体的醇脱氢酶。
[0022]在也是第一至第四个实施方案的一个实施方案的第五个实施方案中，全细胞催化剂解决了所述问题，其中与全细胞催化剂的野生型相比，在氧化中涉及的至少一种酶的活性降低。
[0023]在也是第一至第五个实施方案的一个实施方案的第六个实施方案中，全细胞催化剂解决了所述问题，其中与全细胞催化剂的野生型相比，BioH或其变体的活性降低。
[0024]在也是第一至第六个实施方案的一个实施方案的第七个实施方案中，全细胞催化剂解决了所述问题，其中与全细胞催化剂的野生型相比，FadL或其变体的活性增加。
[0025]在第二方面，一种用于将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯转化成胺的方法解决了作为本发明的基础的问题，所述方法包括下述步骤
a)通过与烷烃羟化酶和/或醇脱氢酶接触，将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯氧化成氧化产物，
b)使所述氧化产物与磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶或α-双加氧酶接触以产生醛,和
c)使所述醛与转氨酶接触。
[0026]在第二方面，一种方法解决了作为本发明的基础的问题，其中在步骤c)中，存在氨基酸脱氢酶。
[0027]在第二方面的第一个实施方案中，一种方法解决了所述问题，其中以根据本发明的第一方面的全细胞催化剂的形式，提供选自磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶、α-双加氧酶、转氨酶、氨基酸脱氢酶和烷烃羟化酶的至少一种酶，优选得自该组的使用的所有酶。
[0028]在也是第一个实施方案的一个实施方案的第二个实施方案中，一种方法解决了所述问题，其中所述脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯是式(I)的化合物
R1-A- COOR2(I)
其中 R1 选自-H、-CHO, -OH 和 C00R3，
其中R2和R3各自且彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基，
前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H，且
其中A代表无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳原子的烃基。
[0029]在也是第一至第二个实施方案的一个实施方案的第三个实施方案中，一种方法解决了所述问题，其中A具有式-(CH2)n _，其中η是至少4，优选至少10。
[0030]在第三方面，通过使用根据第一方面的全细胞催化剂或根据第二方面的方法用于将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯胺化，解决了作为本发明的基础的问题。
[0031]在第四方面，一种反应混合物解决了作为本发明的基础的问题，所述反应混合物包含在水溶液中的根据第一方面的全细胞催化剂和式(I)的脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯
R1-A- COOR2(I)，
其中 R1 选自-H、-CHO, -OH 和 C00R3，
其中R2和R3各自且彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基，
前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H，且
其中A代表无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳原子的烃基，优选式-(CH2)n -，其中η是至少4，特别优选至少10。
[0032]本发明是基于发明人的以下发现:用于从脂肪酸生产ω-氨基脂肪酸且具有适当酶组合物(Ausstattung)的全细胞催化剂中的在功能上共表达的重组脂肪酸还原酶或α-双加氧酶会令人惊讶地增加ω-氨基脂肪酸的产率。
[0033]此外，本发明是基于发明人的以下发现:用于从脂肪酸生产ω-氨基脂肪酸且具有适当酶组合物的全细胞催化剂中的在功能上共表达的重组脂肪酸还原酶或α-双加氧酶会令人惊讶地降低得到的产物中的干扰性副产物(尤其是二羧酸及其酯形式的过度氧化的脂肪酸)的浓度。
[0034]此外，本发明是基于发明人的以下发现:用于从脂肪酸生产ω-氨基脂肪酸且具有适当酶组合物的全细胞催化剂中的在功能上共表达的重组脂肪酸还原酶或α-双加氧酶会提高液体阳离子交换剂(诸如油酸)的纯度和可复用性，所述液体阳离子交换剂用于从含有全细胞催化剂的发酵溶液中除去ω-氨基脂肪酸。
[0035]本发明涉及一种改进的将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯转化成胺的方法，其特征在于，除催化脂肪酸经由它的多个氧化阶段转化为胺的反应的酶外，也存在至少一种脂肪酸还原酶或α -双`加氧酶、或者两种酶的组合，优选地，当将全细胞催化剂用于执行所述方法时。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“脂肪酸还原酶”被理解为是指这样的酶:其在消耗ATP和NAD(P)H下催化ω-羧基酸(也被描述为二羧酸或ω-羧基脂肪酸)向对应的ω-氧代脂肪酸的转化。在现有技术中，例如在W0/2010/135624中，描述了用于生产ω-羟基脂肪酸的脂肪酸还原酶，但是不是作为用于生产ω-氨基脂肪酸的系统的一部分。在一个更优选的实施方案中，所述脂肪酸还原酶选自含有以下氨基酸序列及其变体的脂肪酸还原酶:ΥΡ_887275.1、ΖΡ_11001941.1、ΖΡ_06852401.1、ΝΡ_959974.1、ΥΡ_001070587.1、ΖΡ_05217435.1、ΥΡ_882653.1、ΥΡ_639435.1、ΖΡ_10800193.1、ΥΡ_006452763.1、ΥΡ_006730440.1、ΖΡ_11196216.1、ΥΡ_005349252.1、ΖΡ_05224908.1、ΥΡ_005338837.1、ΥΡ_006307000.1、ΥΡ_005343991.1、ΖΡ_11001942.1、ΖΡ_09979565.1、ΥΡ_005003162.1、ΥΡ_953393.1、ΥΡ_001850422.1、ΖΡ_11011489.1、ΖΡ_12689264.1、ΥΡ_905678.1、ΖΡ_09976919.1、ΥΡ_004746059.1、ΝΡ_217106.1、ΥΡ_004525443.1、ΝΡ_337166.1、ΖΡ_09685823.1、ΥΡ_978699.1、ΖΡ_06437984.1、ΖΡ_06514086.1、ΝΡ_856267.UCAA19077.1、ΝΡ_301424.1、ΖΡ_06522140.1、ΖΡ_06518098.1、ΖΡ_11008938.1、ΖΡ_07432374.2、AAR91681.1、ΥΡ_006808747.1、ΥΡ_001851230.1、ΖΡ_15327751.1、ΖΡ_15455857.1、ΖΡ_12874284.1、ΖΡ_15332534.1、ΖΡ_15512956.1、ΖΡ_14244106.1、ΖΡ_15470899.1、ΖΡ_11439367.1、ΥΡ_001703694.1、ΖΡ_15446742.1、ΥΡ_006808978.1、ΖΡ_07964926.1、ΥΡ_006521379.1、WP_007769435.1、ΖΡ_15512957.1、ΖΡ_12874283.1、ΥΡ_005350955.1、ΖΡ_14243341.1、ΥΡ_001705436.1、ΖΡ_15329649.1、
【权利要求】
1.全细胞催化剂，其表达重组α-双加氧酶、或重组脂肪酸还原酶和将所述脂肪酸还原酶进行磷酸泛酰巯基乙胺化的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的组合，且其另外表达转氨酶，其中，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和/或转氨酶优选地为重组体。
2.根据权利要求2所述的全细胞催化剂，其中，所述全细胞催化剂另外表达优选地为重组体的氨基酸脱氢酶。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的全细胞催化剂，其中，所述全细胞催化剂另外表达优选地为重组体的烷烃羟化酶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的全细胞催化剂，其中，所述全细胞催化剂另外表达优选地为重组体的AlkL家族的多肽。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的全细胞催化剂，其中，它另外表达优选地为重组体的醇脱氢酶。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的全细胞催化剂，其中，与全细胞催化剂的野生型相比，在β-氧化中参与的至少一种酶的活性降低。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的全细胞催化剂，其中，与全细胞催化剂的野生型相比，BioH或其变体的活性降低。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的全细胞催化剂，其中，与全细胞催化剂的野生型相比，FadL或其变体的活性增加。
9.用于将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯转化成胺的方法，所述方法包括下述步骤 a)通过与烷烃羟化酶和/或醇脱氢酶接触，将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯氧化成氧化产物，` b)使所述氧化产物与磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶或α-双加氧酶接触以产生醛,和 c)使所述醛与转氨酶接触。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，在步骤c)中，存在氨基酸脱氢酶。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的方法，其中，以根据权利要求1-8中任一项所述的全细胞催化剂的形式，提供选自磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶、α -双加氧酶、转氨酶、氨基酸脱氢酶和烷烃羟化酶的至少一种酶，优选得自该组的使用的所有酶。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中，所述脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω_氧代脂肪酸或其单酯是式(I)的化合物 R1-A- COOR2(I) 其中 R1 选自-H、-CHO, -OH 和 C00R3， 其中R2和R3各自且彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基， 前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H，且 其中A代表无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳原子的烃基。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其中，A具有式-(CH2)n_，其中η是至少4，优选至少10。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的全细胞催化剂或根据权利要求8-12中任一项所述的方法用于将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯胺化的用途。
15.反应混合物，其包含在水溶液中的根据权利要求1-8中任一项所述的全细胞催化剂和式(I)的脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯R1-A- COOR2(I)， 其中 R1 选自-H、-CHO, -OH 和 C00R3， 其中R2和R3各自且彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基， 前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H， 其中A代表无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳原子的烃基，优选式-(CH 2)n _，且其中η是至少4，特别优选至少10。
【文档编号】C12P13/04GK103881933SQ201310707410
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】S.沙费尔, J.吉伦, M.维泽尔, H-G.赫内曼, H.赫格尔, T.哈斯, W.布吕姆克 申请人:赢创工业集团股份有限公司