一种针对镰刀菌的多重pcr检测的引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种针对镰刀菌的多重PCR检测的引物及其应用，所述引物由三组引物对组成，够一次性通过多重PCR扩增体系快速准确鉴定引起玉米穗腐病的三种镰刀菌：禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌，检测引物具有很好的特异性，仅能从目标菌中扩增到特异大小的条带，不能从近源种或其他病原真菌中检测到条带；而且整个PCR和电泳过程仅耗时2h，快速、简便、准确区分引起玉米穗腐的三种不同镰刀菌。
【专利说明】—种针对镰刀菌的多重PCR检测的引物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种鉴定镰刀菌的引物序列及其应用。
【背景技术】
[0002]玉米是重要的粮食作物和饲料来源，穗腐病是玉米生长后期最常见的病害之一，在各玉米产区均有发生，由多种病原菌引起。镰刀菌是引起玉米穗腐病的主要病原菌，不仅给玉米生产造成巨大的经济损失，镰刀菌在致病过程中积累的真菌毒素还降低玉米的品质，给食品安全和饲料安全造成严重威胁。
[0003]在不同气候带的玉米产区中，引起玉米穗腐病的镰刀菌种群结构不同。在欧洲中东部，玉米穗腐病的主要致病菌是禾谷镰刀菌graminearum,轮枝镰刀菌F.verticillioides则遍布整个欧洲，其他的一些镰刀菌也会引起玉米穗腐病，包括/7.subglu tinans, F.pro Ii fera turn和F.cu Imorum。在中国，引起玉米穗腐病的镰刀菌种群主要包括禾谷镰刀菌F.graminearum,轮枝镰刀菌F.verticillioide和层出镰刀菌/7.其中轮枝镰刀菌/7.verticillioide为优势种群，禾谷镰刀菌/7.其次,层出镰刀菌/7.也经常有检出。由于不同的镰刀菌产生的
真菌毒素的种类不一样，再加上传统的形态学检测方法耗时费事，因此，急需通过多重PCR检测的引物建立一种快速简便且能一次准确区分这三种不同镰刀菌的检测方法对于玉米穗腐病的种群分布和动态分析奠定理论基础，为该病害的综合治理提供科学依据。
[0004]此外,禾谷镰刀菌/7.还是引起麦类作物赤霉病的主要病原菌,因此多重PCR检测的引物还可以直接用于检测引起麦类作物赤霉病的病原菌。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于，为同时检测禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌，基于不同镰刀菌编码的酮酸-还原异构酶的ILV5基因和编码留醇24-C还原酶的ERG24B基因的碱基差异，提供一种用于多重PCR检测的引物及其应用。
[0006]本发明目的是这样实现的:
一种针对镰刀菌的多重PCR检测的引物，其特征在于:多重PCR检测的引物由三组引物对组成，它们分别是序列号为SEQ ID N0.1的Fg-F和序列号为SEQ ID N0.2的Fg-R,序列号为SEQ ID N0.3的Fv-F和序列号为SEQ ID N0.4的Fv-R,以及序列号为SEQ ID N0.5的Fp-F和序列号为SEQ ID N0.6的Fp-R0
[0007]本发明中，所述多重PCR检测的引物在针对禾谷镰刀菌(/7.CraffiiflearwffiA轮枝镰刀菌iF.Verticillioide)和层出镰刀菌iF.Proliferatum)检测中的应用。 [0008]本发明中，所述的应用，其具体步骤为:
a)提取待检测菌株的DNA;
b)多重PCR扩增:以待检测菌株的DNA为模板进行多重PCR扩增；
多重 PCR 反应体系:10 XPCR Buffer 2.5 μ 1,4.5U Taq 酶、dNTPs 0.2 μ M、MgCl2 2mM、DNA 模板 2 μ 1、引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ IDN0.5和SEQ ID N0.6各0.07 μ M，最后加灭菌双蒸水至25 μ I ;
多重PCR反应条件:94°C预变性5 min;94°C变性25 s、60°C退火25 s、72°C延伸25 s,共30个循环；72°C延伸10 min, 10°C保存；
c)1.5% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，经含有1% (w/v)的EB染色液染色后，观测凝胶中DNA条带大小，扩增得到885-bp DNA条带为禾谷镰刀菌，扩增得到416_bpDNA条带为轮枝镰刀菌，扩增得到220-bp DNA条带为层出镰刀菌。
[0009]本发明的优点在于，所提供的三组引物及其多重PCR方法能够一次性通过多重PCR扩增体系快速准确鉴定引起玉米穗腐病的三种镰刀菌(禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌)，检测引物具有很好的特异性，仅能从目标菌中扩增到特异大小的条带，不能从近源种或其他病原真菌中检测到条带；而且整个PCR和电泳过程仅耗时2h，因此，本发明的引物与检测方法可以用来快速、简便、准确区分引起玉米穗腐的三种不同镰刀菌。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1a为采用引物组SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2进行PCR特异性检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；
图1b为采用引物组SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4进行PCR特异性检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；
图1c为采用引物组SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6进行PCR特异性检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；
在图1a图1b图1c中:泳道M为DNA标准物，泳道Y为阴性对照，泳道1_3为禾谷镰刀菌/7.gramine arum、泳道_ 4_6为轮枝镰刀菌/7.verticil I ioides、泳造_ 7_9为层出镰刀菌Z7.proliferatum10-15依次分别为亚洲镰刀菌Z7.aWica?、水稻恶苗病菌/7./i/j'iiaro1、尖孢镰刀菌/7.稻痕病菌orjzea、灰葡萄孢汉ciflerea和油菜
菌核病菌 S Sclero tiorium。
[0011]图2为1-10个待测玉米样品的多重PCR检测扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。
[0012]【具体实施方式】:
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0013]实施例1 DNA的提取
实施例所涉及试剂:CTAB提取液:含有20 mM EDTAU00 mM Tris-HClU.4 M NaCl以及体积比为2% CTAB。
[0014]实施例所涉及菌株:3株禾谷镰刀菌(/7.株轮枝镰刀菌(/7.ver ticillioide)^3 株层出键刀菌(Z7.pro Ii fera turn )、I 株亚洲键刀菌(Z7.asi a ti cum )、I株水稻恶苗病菌(/7.fujikuroi )、I株尖孢镰刀菌(/7.0xysproum)Λ株稻痕病菌i Magnaporthe oryzea)^ \株灰葡萄抱QBotrytis cinerea )和I株油菜菌核病菌{Sc Ier ο tinia sclero ti ori um )。上述菌株均为常见的植物病原真菌，可以通过常规的分离纯化方法获得，即:取植物感病样品的病健交界处，无菌操作条件下使用70%乙醇消毒5s，再在无菌水中清洗3次，置于含有杀细菌的链霉素的PDA平板上培养，然后通过已有报道的形态学特征和分子检测方法进行验证，后保存在4°C冰箱。
[0015]分别对上述菌株通过以下方法提取DNA:
用无菌的接种针从PDA平板上刮取约100 mg的新鲜菌丝，置于1.5 ml的离心管中，加500 μ I的CTAB提取液，用电钻驱动玻璃棒充分研磨，震荡均匀，在室温静置10 min后13200 rpm离心10 min ;取上清液到1.5ml的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混合均匀，在-20°C冰箱放置20 min后13200 rpm离心10 min，弃上清，将沉淀用I ml的70%乙醇洗涤，室温放置干燥后溶解于100 μ I的灭菌双蒸水，放于_20°C冰箱备用。
[0016]实施例2引物设计及合成
根据不同镰刀菌编码的酮酸-还原异构酶的TZ作基因和编码留醇24-C还原酶的基因的碱基差异，设计了三组等位专化PCR引物Fg-F + Fg-R,Fv-F + Fv-R和Fp-F+ Fp-R，引物序列如下表1。
【权利要求】
1.一种针对镰刀菌的多重PCR检测的引物，其特征在于:多重PCR检测的引物由三组引物对组成，它们分别是序列号为SEQ ID N0.1的Fg-F和序列号为SEQ ID N0.2的Fg-R，序列号为SEQ ID N0.3的Fv-F和序列号为SEQ ID N0.4的Fv-R,以及序列号为SEQ ID N0.5的Fp-F和序列号为SEQ ID N0.6的Fp-R。
2.—种如权利要求1所述多重PCR检测的引物在针对禾谷镰刀菌(/7.Graminearum)^轮枝镰刀菌(/7.VerticiIlioide)和层出镰刀菌iF.Proliferatum)检测中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其具体步骤为: a)提取待检测菌株的DNA; b)多重PCR扩增:以待检测菌株的DNA为模板进行多重PCR扩增； 多重 PCR 反应体系:10 XPCR Buffer 2.5 μ 1,4.5U Taq 酶、dNTPs 0.2 μ M、MgCl2 2mM、DNA 模板 2 μ 1、引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ IDN0.5和SEQ ID N0.6各0.07 μ M，最后加灭菌双蒸水至25 μ I ; 多重PCR反应条件:94°C预变性5 min;94°C变性25 s、60°C退火25 s、72°C延伸25 s,共30个循环；72°C延伸10 min, 10°C保存； c)1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，经含有1%的EB染色液染色后，观测凝胶中DNA条带大小，扩增得到885-bp DNA条带为禾谷镰刀菌，扩增得到416_bp DNA条带为轮枝镰刀菌，扩增得到220-b p DNA条带为层出镰刀菌。
【文档编号】C12N15/11GK103740815SQ201310707580
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】刘馨, 史建荣, 徐剑宏, 仇剑波, 王健 申请人:江苏省农业科学院