生产脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程的制作方法

专利名称：生产脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程的制作方法
技术领域：
本发明至少部分地涉及采用经改造的细胞或微生物将碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体(例如脂肪酸或脂肪酸衍生物，如三酰甘油)的领域。联邦政府资助研究 导致本文所公开发明的某些方面的研究(至少部分)由能源部资助69106899支持。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
可持续生产的生物燃料是化石燃料的替代品，并且可以有助于缓解对易于得到的化石燃料储备的消耗，同时避免与化石燃料相关的污染和温室气体排放，从而以可持续的方式满足对负担得起的能源的日益增长的需求。然而，现有生产方法的若干缺点妨碍了广泛实施生物燃料生产，例如生产生物燃料的植物与粮食作物竞争有农业价值的土地面积，或者使用仅有限供应的工业物质作为碳源。

发明内容
对化石燃料之可持续性和可再生性的日益增加的关注使得开发了不同来源的多种替代性生物燃料，包括由微生物(如细菌或酵母)从可再生资源合成的脂质。可用作生物燃料或生物燃料前体的脂质包括例如脂肪酸及其衍生物(例如，三酰甘油)。微生物合成的生物燃料或生物燃料前体的经济可行性依赖于使用具有包括多个有利特性之组合的表型的适合微生物，所述有利特性例如允许将碳有效转化为生物燃料或生物燃料前体的代谢、高的生物质形成率、生物燃料或生物燃料前体的高产率、生物燃料或生物燃料前体的高水平细胞内积累或分泌、对原料(碳源和相关物质)和所合成产物(例如，脂肪酸或三酰甘油)的良好耐受以及生物燃料或生物燃料前体的稳定性(例如在低碳源浓度下)。转化产率(每克底物(例如葡萄糖)所产生的油的克数)尤为重要。通常用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物不符合足够允许以工业规模经济地生产生物燃料的所需表型。本发明的一些方面涉及在微生物中改造所需特性以生产生物燃料或生物燃料前体。虽然自二十世纪三十年代和二十世纪四十年代起，已研究了微生物中的脂质和脂肪酸代谢(参见，例如 Woodbine, M. 1959, Microbial fat !Microorganisms as potential fatproducers. Prog. Ind. Microbiol. I : 181),但是,尽管在遗传改造微生物或优化生产过程的条件方面作出了诸多努力，在微生物中改造与生物燃料生产相关的期望表型方面的进展仍然很小。到目前为止，遗传改造工作主要集中在操作脂肪酸合成通路上游或其中的基因靶标和优化发酵或培养条件(例如，通过用脂肪酸补充生长培养基)。遗传改造微生物的一个主要障碍是缺少靶微生物中(例如产油(oleaginous)酵母中)关键代谢通路调节因子的基因组信息和注释。因此，在用于生产生物燃料的微生物中仍然缺少控制将碳水化合物向脂质转化的关键调节因子的功能鉴定和注释。本发明的一些方面涉及将产油酵母解脂耶氏酵母(Y. Iipolytica)鉴定为用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物。本发明的一些方面涉及发现微生物中脂肪酸代谢的关键调节因子。本发明的一些方面涉及发现硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)作为微生物中碳水化合物向脂质转化的关键调节因子。本发明的一些方面涉及编码微生物中脂肪酸代谢的关键调节因子的分离的核酸。本发明的一些方面提供了编码产油微生物的脂肪酸代谢之关键调节因子(例如，SCD基因产物)的分离的核酸。本发明的一些方面涉及操作脂肪酸代谢调节因子的活性(例如，通过遗传操作)来改造用于生产生物燃料的微生物。本发明的一些方面涉及改造用于生产生物燃料或生物 燃料前体的分离的微生物。本发明的一些方面涉及针对将碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体进行优化的分离的微生物，例如，包含活性增加的SCD基因产物的产油微生物。本发明的一些方面涉及改造用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物培养物。本发明的一些方面涉及使用改造用于生产生物燃料的微生物将碳水化合物源转化为脂肪酸或脂肪酸衍生物的方法。本发明的一些方面涉及使用改造用于生产生物燃料的微生物将碳水化合物转化为脂肪酸或脂肪酸衍生物的生物反应器。本发明的一些方面提供了使用经改造微生物至少部分地将碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体的方法。本发明的一些方面涉及分离的产油细胞，其包含提高选自血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶(malic enzyme)、ACC、SCD、FAAl、ACS、ACS2、FATl、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基辅酶A合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因的一种或更多种基因的表达的遗传修饰，和/或降低选自JNK2和△-12去饱和酶的基因的表达的遗传修饰。在一些实施方案中，分离的产油细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含(a)包含在合适的同源或异源启动子的控制下编码基因产物的核酸的表达盒；(b)包含在异源启动子的控制下编码靶向基因产物的干扰RNA的核酸的表达盒；和/或(c)插入细胞基因组的核酸构建体，所述构建体包含提高或降低基因产物表达的核酸序列。在一些实施方案中，异源启动子是诱导型或组成型启动子。在一些实施方案中，核酸构建体抑制或破坏(disrupt)编码基因产物的天然基因的天然调节，导致天然基因的过表达。在一些实施方案中，核酸构建体抑制或消除天然基因的表达。在一些实施方案中，由缺失、破坏、突变和/或替换调节基因表达的调节区或调节区的一部分来介导天然基因的天然调节的抑制或破坏，或者由缺失、破坏、突变和/或替换天然基因的编码序列或调节天然基因表达的调节区或调节区的一部分来介导天然基因表达的抑制或消除。在一些实施方案中，由组成型或诱导型表达靶向JNK2和/或A-12去饱和酶基因产物且抑制所述基因表达的核酸来介导JNK2和/或A-12去饱和酶基因表达的降低。在一些实施方案中，靶向JNK2和/或A-12去饱和酶基因转录本的核酸通过RNAi途径抑制转录本的表达。在一些实施方案中，靶向JNK2和/或A-12去饱和酶转录本的核酸是siRNA, shRNA或micro RNA。在一些实施方案中，通过在微生物中敲除野生型基因(例如，通过核酸构建体(如靶向性载体)与基因组JNK2或A-12去饱和酶基因座的同源重组)从而破坏野生型基因的表达来降低JNK2和/或A-12去饱和酶的表达。在一些实施方案中，将核酸构建体插入细胞的基因组中。在一些实施方案中，基因产物表达的提高的或降低赋予细胞将碳水化合物源转化为脂肪酸、脂肪酸衍生和/或TAG的有利表型。在一些实施方案中，有利表型是改变的脂肪酸谱、改变的三酰甘油谱、增加的脂肪酸和/或三酰甘油合成率、增加的转化产率、细胞中增加的三酰甘油积累和增强的对渗透压的耐受、增加的增殖速率、增加的细胞体积和/或细胞对浓度为致死和/或抑制其相同类型细胞的未经修饰细胞之增殖的物质增强的耐受。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的改变的脂肪酸谱或改变的三酰甘油谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少2倍。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的改变的脂肪酸谱或改变的三酰甘油谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少2. 5倍。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的改变的脂肪酸谱或改变的三酰甘油谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少5倍。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的改变的脂肪酸谱或改变的三酰甘油谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少6. 5倍。在一些实施方案中，细胞在对未经修饰细胞致死的渗透压条件下存活。在一些实施方案中，细胞在渗透压水平为未经修饰细胞所耐受之最高水平的200%的条件下存活。在一些实施方案中，细胞在渗透压水平为未经修饰细胞 所耐受的最高水平的300%的条件下存活。在一些实施方案中，细胞在渗透压水平为未经修饰细胞所耐受的最高水平的400%的条件下存活。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞增殖速率增加为至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少25倍或至少30倍。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的体积增加为至少2倍。在一些实施方案中，细胞耐受浓度为致死和/或抑制相同细胞类型的未经修饰细胞增殖的物质。在一些实施方案中，所述物质是可发酵糖，所述浓度为至少80g/l、至少100g/l、至少150g/l、至少200g/l、至少300g/l。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的脂肪酸或三酰甘油的合成率增加为至少5倍或至少10倍。在一些实施方案中，细胞以至少约20g/g、至少约25g/g或至少约30g/g的转化率将碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油。在一些实施方案中，细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一些实施方案中，细胞是产油酵母细胞。在一些实施方案中，细胞是解脂耶氏酵母细胞。本发明的一些方面涉及培养物，其包含分离的产油细胞和碳水化合物源，所述产油细胞包含提高选自血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶、ACC、SCD、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基辅酶A合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因的一种或更多种基因的表达的遗传修饰，和/或降低JNK2和/或A-12去饱和酶基因产物的表达的遗传修饰。在一些实施方案中，分离的产油细胞是本文所提供的经改造微生物。在一些实施方案中，所述碳水化合物源是可发酵糖。在一些实施方案中，所述碳水化合物源是单糖(monomericsugar) o在一些实施方案中,所述碳水化合物源是葡萄糖和甘油。在一些实施方案中，所述碳水化合物源未经灭菌。在一些实施方案中，所述培养物保持在未灭菌条件下。在一些实施方案中，所述培养物不包含对分离的产油细胞有选择性的抗生素或抗增殖剂。在一些实施方案中，所述碳水化合物源来自植物或藻类生物质。在一些实施方案中，所述碳水化合物源来自纤维素、半纤维素、淀粉、甘油或其衍生物。在一些实施方案中，所述的培养物还包含纤维素或半纤维素水解酶。在一些实施方案中，生物质或纤维素或半纤维素在热水或稀酸或氨纤维膨胀处理中预处理，利用水解酶预处理，蒸汽预处理和/或石灰预处理。在一些实施方案中，所述培养物包含浓度为对未经修饰野生型、与分离的产油细胞细胞类型相同的未经修饰细胞致死的物质。在一些实施方案中，所述物质是在预处理碳水化合物源(如乙酸类(acetate)、糠醛或芳族化合物)期间产生的有毒物质。在一些实施方案中，所述物质是碳水化合物源。在一些实施方案中，所述物质是可发酵糖。在一些实施方案中，所述物质是单糖。在一些实施方案中，所述培养物包含浓度为至少80g/l、至少100g/l、至少150g/l、至少200g/l、至少250g/l或至少300g/l的可发酵糖。本发明的一些方面涉及一种方法，其包括使碳水化合物源与分离的产油细胞接触，以及在适于使细胞至少部分地将所述碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油的条件下孵育与所述细胞接触的碳水化合物源，所述细胞包含提高选自血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶、ACC、SCD、FAAU ACS, ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基辅酶 A 合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因产物的一种或更多种基因的表达的遗传修饰，和/或降低JNK2和/或△-12去饱和酶基因表达的遗传修饰。在一些实施方案中，所述分离的产油细胞是本文所提供的经改造微生物。在一些实施方案中，所述碳水化合物源是糖(如葡萄糖、木糖·等)或来自植物或藻类生物质的淀粉。在一些实施方案中，所述碳水化合物源来自纤维素或半纤维素。在一些实施方案中，在纤维素或半纤维素水解酶的存在下，使所述碳水化合物源与所述细胞接触。在一些实施方案中，在55°C于每克生物质约15IU纤维素或半纤维水解酶的存在下，使所述碳水化合物源与所述细胞接触48小时。在一些实施方案中，用热水或稀释酸或氨纤维膨胀处理和/或水解酶预处理生物质或纤维素或半纤维素。在一些实施方案中，与分离的产油细胞接触的碳水化合物源包含浓度对与所述分离的产油细胞细胞类型相同的未经修饰细胞为致死浓度的物质。在一些实施方案中，所述物质是在预处理碳水化合物源(例如乙酸类)期间产生的有毒物质。在一些实施方案中，所述物质是所述碳水化合物源。在一些实施方案中，碳水化合物源是可发酵糖，与产油细胞接触之后所述可发酵糖的浓度为至少80g/l、至少100g/l、至少200g/l或至少300g/l。在一些实施方案中，在未灭菌条件下使碳水化合物源与分离的产油细胞接触。在一些实施方案中，在非灭菌条件下孵育与分离的产油细胞接触的碳水化合物源。在一些实施方案中，在开放反应器中孵育与分离的产油细胞接触的碳水化合物源。在一些实施方案中，在补料分批过程(fed batchprocess)中使碳水化合物源与分离的产油细胞接触并孵育以将所述碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油。在一些实施方案中，在连续过程中使碳水化合物源与分离的产油细胞接触并孵育以将所述碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油。在一些实施方案中，通过溶剂萃取从与分离的产油细胞接触的碳水化合物源萃取脂肪酸或三酰甘油。在一些实施方案中，所述溶剂萃取是溶剂己烷萃取。在一些实施方案中，将脂肪酸或三酰甘油从与分离的产油细胞接触的碳水化合物源中分离，然后通过酯交换反应(transesterification)精炼。本发明的一些方面涉及一种方法，其包括通过提高选自血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶、ACC、SCD、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS 和 AMPK 基因产物的一种或更多种基因产物的表达，和/或降低JNK2和/或A-12去饱和酶基因的表达来改变脂肪酸谱、三酰甘油谱、脂肪酸合成率(fatty acid synthesis rate)、三酰甘油合成率、细胞中脂肪酸衍生物积累的程度、脂肪酸衍生物的分泌率(rate of fatty acid derivativesecretion)、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的有效产率、对渗透压的耐受、增殖速率、细胞体积或细胞对用于碳水化合物源向脂肪酸或三酰甘油的转化中的有毒物质的耐受。在一些实施方案中，改变所述脂肪酸谱、所述三酰甘油谱、所述脂肪酸合成率、所述三酰甘油合成率、细胞中脂肪酸衍生物积累程度或细胞的脂肪酸衍生物分泌率是增加由细胞合成、积累或分泌的脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的量。在一些实施方案中，改变细胞的碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的效率是将转化效率增加为至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。在一些实施方案中，脂肪酸衍生物是三酰甘油。在一些实施方案中，改变细胞对渗透压的耐受或对有毒物质的耐受是赋予对相同细胞类型的未经修饰细胞为致死水平的渗透压或有毒物质的耐受。在一些实施方案中，改变增殖速率是将所述增殖速率增加为至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少30倍。在一些实施方案中，改变所述细胞体积是将所述细胞体积增加为至少2倍。在一些实施方案中，所述细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，所述酵母是产油酵母。在一些实施方案中，所述产油酵母是解脂耶氏酵母。本发明的一些方面涉及分离的核酸分子，其包含a)编码SEQ ID NO :1(解脂耶氏酵母SCD)的核苷酸序列,或b)与a)的核苷酸序列有至少85%的同一丨丨生的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码SEQ ID NO: I的核苷酸序列是SEQ ID NO :2。在一些实施方案中， 核苷酸序列与SEQ ID NO :2的核苷酸序列有至少85%的同一丨丨生。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO :2的核苷酸序列有至少90%的同一丨丨生。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO :2的核苷酸序列有至少95%的同一丨丨生。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO :2的核苷酸序列有至少97. 5%的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQID NO 2的核苷酸序列有至少99%的同一性。在一些实施方案中，提供了核酸构建体，其包含如本文所述的分离的核酸分子(例如本段所述的分离的核酸分子)和异源的分离的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，所述组成型启动子是翻译延伸因子(Translation Elongation Factor,TEF)启动子。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是药物诱导型启动子。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含经修饰S⑶启动子。在一些实施方案中，修饰是完全或部分缺失和/或突变野生型S⑶启动子序列，导致对应答于高水平脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的所述SCD启动子的反馈抑制的破坏。在一些实施方案中，所述修饰是将异源序列插入野生型SCD启动子区，任选地结合完全或部分缺失和/或突变野生型SCD启动子序列，导致对应答于高水平脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的所述SCD启动子的反馈抑制的破坏。本发明的一些方面涉及载体，其包含表达盒，例如本文中所提到的任意表达盒。本发明的一些方面涉及包含如本文所述的表达盒或如本文所述载体的至少一部分的细胞。在一些情况下，本申请的主题可以涉及相关产物、特定问题的可替选解决方案和/或单个系统或制品的多种不同的用途。本发明的其它优点、特征和用途将通过本发明非限制性实施方案的以下详述并结合附图而变得明显。在本说明书与通过引用并入的文件包含相矛盾的公开内容的情况下，应当以本说明书为准。


图I :解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)的脂肪酸谱。A)在摇瓶实验中，使用气相色谱-质谱联用(GC-MS)测定培养于基本培养基中的解脂耶氏酵母对数期培养物的总游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)。B)在稳定生长期期间,在相同条件下测定相同培养物中的总FFA。C)在稳定期期间，测定相同培养物中的总脂质(FFA和酯化脂肪酸)。图2 :分析解脂耶氏酵母的总脂质。A)在基本培养基中培养野生型解脂耶氏酵母菌株直至72小时稳定期培养物，并在摇瓶实验中使用GC-MS测定总脂质。B)测定培养至稳定期(72小时)且在半组成型启动子控制下过表达SCD(天然A9去饱和酶)的突变菌株中的总脂质。C)用尼罗红对培养至稳定期的野生型菌株进行染色的共聚焦显微镜观察。D)用尼罗红对培养至稳定期的突变菌株进行染色并用共聚焦显微镜进行分析。图3 :在摇瓶中，解脂耶氏酵母突变体-I (过表达细胞色素B、血红蛋白、Glutl和A 9-去饱和酶(S⑶)，(D9，■))和野生型(LS， )对纯葡萄糖的葡萄糖消耗。与野生型解脂耶氏酵母相比，解脂耶氏酵母突变体-I表现出更快的葡萄糖消耗特性和与野生型中所观察到的不完全消耗相比的完全葡萄糖消耗。 图4:A)在72小时内，玉米秸杆水解产物(Hz)中解脂耶氏酵母突变体I (过表达细胞色素B、血红蛋白、Glutl和A 9-去饱和酶(S⑶))和突变体2 (过表达细胞色素B、血红蛋白和Glutl)的糖消耗。B)在数小时内，玉米秸杆Hz中突变体I和突变体2的油的产生。图5 比较野生型和经改造微生物的生长特性。YL-eng :过表达A 9_去饱和酶(S⑶)的突变解脂耶氏酵母。YL-wild:野生型解脂耶氏酵母。在含有浓度为250g/l的糖的基本培养基中培养细胞。野生型细胞不能在这些条件下生长，而突变细胞能够耐受高水平的糖并生长良好，表明在使用突变菌株的方法中可以获得较高的生物燃料或生物燃料前体生产率。Y轴OD值。X轴以小时表示的时间。图6 :过表达A 9-去饱和酶(SCD)的解脂耶氏酵母突变体的糖消耗和生长特性。在含有160g/l糖的培养基中培养细胞，监测培养物的OD和糖消耗。突变细胞在48小时内消耗了所供应的糖，并在分批补充糖之后继续生长。该图示出用于补料分批操作和半连续生物燃料生产方法的一个实施方案。图7 :经改造解脂耶氏酵母(过表达A 9-去饱和酶(S⑶)、细胞色素B和血红蛋白)的脂质广生。图8 :培养72小时后，突变菌株(过表达A 9_去饱和酶(SOT)、细胞色素B和血红蛋白；每组中左侧的柱)和野生型解脂耶氏酵母菌株(每组中右侧的柱)的脂肪酸谱。图9 :与野生型解脂耶氏酵母相比的不同突变解脂耶氏酵母菌株的生长动力学。CB :细胞色素B过表达体；D9 :S⑶过表达体。图10 :在不同葡萄糖水平下，与野生型解脂耶氏酵母相比的不同突变解脂耶氏酵母菌株的生长动力学。Wild :野生型解脂耶氏酵母；C18 :过表达A9-去饱和酶(S⑶)的突变解脂耶氏酵母。图11 :突变(过表达A9-去饱和酶(S⑶))和野生型解脂耶氏酵母的生长和脂质生产动力学。图12 :PYLEX1，用于解脂耶氏酵母中转基因表达的表达载体(A)。为本领域技术人员所公知的该载体可以包含选择标记或来自解脂耶氏酵母URA3基因的缺陷型URA3标记，其允许互补尿嘧啶营养缺陷型，如由LE DALL等，Curr. Genet.，26，38-44 (1994)所述的URA3d标记。用于调控表达的序列如在耶氏酵母中有活性的启动子和终止子序列。在一些实施方案中，该载体包含诱导型或组成型启动子。在一些实施方案中，可以在微生物中从PYLEXI过表达基因，例如，通过将目的构建体(如在启动子的控制下的S⑶cDNA)克隆入pYLEXl。显示了在TEF启动子控制下的细胞色素B和血红蛋白cDNA的示例性克隆(B，C)。图13 :在藻类生物质上培养经改造微生物。获得干燥的藻类并进行高压处理以裂解细胞和使淀粉胶化。用a-淀粉酶酶促处理经高压处理的细胞以释放葡萄糖。用我们的含有A 9-去饱和酶和细胞色素、Glutl以及血红蛋白的突变酵母细胞接种所得培养基。图中示出耶氏酵母突变体在没有任何添加物的发酵培养基中的强生长。细胞在4-5天内达到0D43。这表明突变酵母的生长没有被抑制。图14 :培养于藻类水解产物中的酵母细胞的显微镜观察。在图13所述条件下培 养细胞。收获细胞并用尼罗红染色以鉴定油。酵母细胞内的微滴表示油。图15 :培养于粗制甘油中的酵母细胞的显微镜观察。收获细胞并用尼罗红染色以鉴定油。酵母细胞内的微滴表示油。图16 :用于产生A 12-去饱和酶敲除菌株的包含A 12-去饱和酶基因侧翼区域和抗生素抗性序列的△ 12-去饱和酶敲除构建体的示意结构。图17 :经改造微生物在3%乙酸类(84小时时添加2%甘油)中的生长。详述介绍鉴于化石燃料资源的减少，大量研究工作致力于开发可再生的替代品。一种有前景的方法是改造微生物以从可再生碳源生产生物燃料(例如生物柴油或生物柴油前体如三酰甘油)，例如通过使用产生脂肪酸或脂肪酸衍生物的微生物Microalgae as araw material for biofuels production(Gouveia L, Oliveira A C. J Ind MicrobiolBiotechnol. 2009Feb ；36(2) :269-74)。虽然该发明的一些方面涉及使用光合微生物(如藻类)生产生物燃料或生物燃料前体，但光合微生物的使用产生了一系列技术挑战(Cadoret JP,Bernard 0. J Lipid biofuel production with microalgae potential andchallenges Soc Biol. 2008 ；202(3) :201-11)。研究工作的焦点转向改造微生物以在暗发酵过程中将可再生碳源(如来自生物质的可发酵糖(例如葡萄糖或来自玉米或甘蔗的糖)或者不可发酵碳水化合物聚合物(例如纤维素或半纤维素))转化为生物燃料或生物燃料前体。经济上可行地生产生物燃料需要(i)鉴定合适的微生物，和(ii)在微生物中改造出需要和/或期望的表型，该表型可包含多种特性。这种表型中的此类需要和/或期望的特性的实例包括但不限于快速且有效的生物质生产，超出不期望微生物的生长优势，有效地、理想地接近理论地碳水化合物到油的转化率,和对底物及终产物的高耐受。这些特性中的一些是以工业规模经济上可行地生产基于微生物的生物燃料的先决条件。理想地,经改造微生物应当表现出有利特性的组合，其赋予允许以可规模化的、成本节约的方式将丰富的碳源有效转化为生物燃料或生物燃料前体的表型。生物燃料或生物燃料前体的微生物生产本发明的一些方面涉及微生物介导的生物燃料或生物燃料前体的生产。术语“生物燃料”是指来自生物来源(如活细胞、微生物、真菌或植物)的燃料。该术语包括例如直接从生物来源得到的燃料(例如通过常规提取、蒸馏或精炼方法)和通过加工得自生物来源的生物燃料前体产生的燃料(例如通过化学修饰如酯交换方法)。可直接得到的生物燃料的例子是醇(如乙醇、丙醇和丁醇)、脂肪以及油。通过加工生物燃料前体(例如，脂质)得到的生物燃料的例子是生物柴油(例如，通过脂质的酯交换反应产生)和绿色柴油/经修饰的油燃料(例如，通过油的氢化产生)。生物柴油也称为脂肪酸甲(或乙)酯，它是目前经济上最重要的生物燃料之一，并且可以通过脂质的酯交换反应以工业规模生产，在酯交换反应中，氢氧化钠和甲醇(或乙醇)与脂质(例如三酰甘油)反应以产生生物柴油和甘油。用于以工业规模生产生物柴油的原料包括动物脂肪、植物油、棕榈油、大麻、大豆、油菜籽、亚麻、向日葵和含油藻类。在另一些方法中，微生物将生物质转化为生物燃料前体如脂质，然后其被提取并进一步加工以产生生物燃料。术语“生物质”是指由活细胞或生物(如微生物)生长和/或繁殖产生的物质。生物质可以包括细胞、微生物和/或细胞内内含物(例如细胞脂肪酸和TAG)以及细胞外物质。细胞外物质包括但不限于由细胞分泌的化合物例如分泌的脂肪酸或TAG。用于生产生物燃料的生物质的重要类型是藻类生物质和来自植物的生物质，例如玉米秸杆和木纤维。在一些实施方案中，用于生产生物燃料或生物燃料前 体的生物质可以包括来自植物的糖，例如来自甘蔗或玉米的糖。本发明的一些方面涉及鉴定、改造和开发用于经济上可行地工业规模生物柴油生产的脂质的微生物源，这些在之前均未被报道过。术语“脂质”是指脂肪酸及其衍生物。因此，脂质的例子包括脂肪酸(FA，饱和和未饱和两者)；甘油酯或甘油脂质，也称为酰基甘油如甘油单酯(单酰甘油)、甘油二酯(二酰甘油)、甘油三酯(三酰甘油、TAG或天然脂肪)；磷酸甘油酯(甘油磷脂)；非甘油酯(鞘脂、固醇脂，包括胆固醇和类固醇激素、孕戊烯醇脂包括萜类、脂肪醇、蜡和聚酮)；以及复合脂质衍生物(连接糖的脂质或糖脂和连接蛋白质的脂质)。脂质是活细胞和微生物质膜的重要部分。一些细胞和微生物还产生脂质以储存能量，例如以脂质微滴中的三酰甘油的形式。本发明的一些方面涉及根据微生物的合适脂质代谢鉴定用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物。术语“脂质代谢”是指涉及脂质的产生或降解的分子过程。脂肪酸合成、脂肪酸氧化、脂肪酸去饱和、TAG合成、TAG储存和TAG降解是作为细胞脂质代谢的一部分的过程的例子。因此，术语“脂肪酸代谢”是指涉及脂肪酸的合成、产生、转化或降解的所有细胞或有机过程。脂肪酸合成、脂肪酸氧化、TAG合成及TAG降解是作为细胞脂肪酸代谢的一部分的过程的例子。术语“三酰甘油”(TAG，有时也称为甘油三酯)是指这样的分子其包含通过酯键与三个脂肪酸分子(脂肪族一元羧酸)共价连接的一分子甘油，每个脂肪酸连接于甘油分子的三个羟基(OH)之一。由于三酰甘油的还原、无水性质，所以它是代谢能量的高浓缩储存形式，并且是适合用于生物柴油生产的原料。许多细胞和生物以脂肪酸和脂肪酸衍生物(如TAG)的形式储存代谢能量。脂肪酸及其衍生物(如TAG)提供了储存代谢能量的理想形式。包含于C-C键中的能量可以通过￠-氧化有效地释放，￠-氧化是形式上相当于脂肪酸生物合成的逆转的反应，但是其由构成不同分子途径的不同酶介导和调节。微生物可以从外部供应，内源转化和从头合成来产生脂肪酸。本发明的一些方面涉及根据微生物从外部供给的碳源有效合成并储存脂肪酸或脂肪酸衍生物的能力来鉴定用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物。
一种用于生物燃料生产的微生物本发明的一些方面涉及鉴定用于生产生物燃料或生物燃料前体的以工业规模将碳水化合物转化为脂质的适合微生物。迄今为止尚未鉴定允许以工业规模经济上可行地从碳水化合物源生产生物燃料或生物燃料前体的微生物。本发明的一些方面涉及根据解脂耶氏酵母有利的碱代谢(base metabolism)来将产油酵母解脂耶氏酵母鉴定为生产生物燃料或生物燃料前体的生物。解脂耶氏酵母是非致病性产油酵母，其可以利用多种碳源包括有机酸、烃和多种脂肪和油。术语“产油”是指可以积累其细胞干重的多于20%的脂质的微生物(参见 C. Ratledge 等，Microbial routes to lipids. Biochem Soc Trans. 1989Dec ；17 (6) 1139-41)。根据本发明的一些方面，解脂耶氏酵母是用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物，因为解脂耶氏酵母是能够同化碳水化合物(例如葡萄糖)或甘油作为唯一碳源的专性需氧微生物，并且与其它酵母菌株相比，解脂耶氏酵母中葡萄糖至脂肪酸和三酰甘油(TAG)的转化较高且脂质储存能力较高。参见例如Beopoulos A, Cescut J, Haddouche R, Uribelarrea JL, Molina-Jouve C, Nicaud JM, Yarrowia lipolytica as a model forbio-oil production. Prog Lipid Res. 2009Nov ；48 (6) :375_87。此外，解脂耶氏酵母是研究更为深入的“非常规”酵母物种之一，并且最近完成了解脂耶氏酵母的基因组测序，包括线粒体DNA测序。Kerscher S,Durstewitz G, Casaregola S,Gaillardin C,Brandt U. ,Th ecomplete mitoch ondrial genome of Yarrowia lipolytica. Comp Funct Genomics. 2001 ；2(2) :80-90。即使尚未完成基因组序列的功能注释，基因组序列数据的可得性也更方便了遗传操作。参见，例如 Sokolova L, Wittig I, B arth HD, Schigger H, Brutschy B,Brandt U. , LILBID—mass spectrometry of protein complexes from blue-nativegels,a sensitive top-down proteomic approach. Proteomics.网上公开 2010 Feb 1，PMID :20127694。在野生型解脂耶氏酵母中，在稳定生长期启动从碳源的脂肪酸和TAG合成，表明存在控制脂质代谢的严密调节机制。该调节机制控制可以被合成和储存的脂质的量，其显著限制了原料到脂质的转化产率。因此，野生型解脂耶氏酵母的代谢参数不适于经济上可行地以工业规模生产生物燃料或生物燃料前体。一种微生物脂肪酸代谢的关键调节因子本发明的一些方面涉及出乎意料地发现(i)饱和脂肪酸通过反馈回路抑制脂肪酸的从头合成和TAG储存，和(ii)在适于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物(例如解脂耶氏酵母)中过表达SCD、A 9-去饱和酶足以克制脂肪酸合成和TAG储存的该反馈抑制，引起脂肪酸和/或TAG合成、储存的显著增加。本发明的一些方面涉及出乎意料的发现，除使脂肪酸和/或TAG的合成和储存增加以外，在微生物中过表达S⑶还赋予微生物(例如，解脂耶氏酵母)生产生物燃料或生物燃料前体的有利表型，其包括但不限于(i) TAG储存途径的超活化，(ii)生长优势，(iii)持续的油生产，(iv)对培养基中碳水化合物源物质(例如，葡萄糖和另一些糖)的耐受增强，(V)脂肪酸谱改变，例如，利于生物燃料或生物燃料前体生产的饱和与不饱和脂肪酸的比率变化。本发明的SCD是产油微生物中脂肪酸代谢和TAG合成的关键调节因子的发现对于旨在借助经改造细胞将可再生碳源转化成生物燃料或生物燃料前体的方法具有重要意义。基于本发明的一些方面，现在可以改变微生物(例如产油酵母如解脂耶氏酵母)的脂肪酸和/或TAG谱，该改变赋予以工业规模将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的极理想表型，如显著增加脂肪酸合成、TAG合成、脂肪酸和TAG、生物质产量以及增强对培养基中高浓度底物、产物和/或毒素的耐受。根据本发明的一些方面，根据本文所提供的方法改变微生物中的脂质或脂肪酸代谢(例如通过单独过表达SCD或与本文所提供的其它遗传或非遗传修饰组合)允许产生针对生物燃料或生物燃料前体生产过程进行了优化的微生物。本发明的一些方面涉及经改造微生物中的脂肪酸代谢，引起微生物中脂肪酸和脂肪酸衍生物合成速率和积累增加。
天然脂肪酸分子通常具有4至28个碳原子的无分支的脂肪族链或尾。如果脂肪族链的所有碳原子均通过C-C单键连接，则脂肪酸被称为“饱和的”，或者如果两个或更多个碳原子通过C-C双键连接，则脂肪酸被称为“不饱和的”。不饱和脂肪酸在膜流动性、细胞活性、代谢、控制基因转录的核事件的调节中扮演重要角色。酵母中脂肪酸谱主要由C16和C18脂肪酸(例如棕榈酸(C16)、棕榈油酸(C16)、硬脂酸(C18)和油酸(C18))组成。棕榈酸是具有16个碳原子的脂肪族链的无支链饱和脂肪酸(碳原子/不饱和键16. 0)。硬脂酸是具有18个碳原子的脂肪族链的无支链饱和脂肪酸(18. 0)。棕榈油酸是16个碳原子的脂肪族链的单不饱和脂肪酸(16. I)。油酸是18个碳原子的脂肪族链的单不饱和脂肪酸(18. I)。酵母中少数脂肪酸种类包括C14和C26脂肪酸，它们在蛋白质修饰中有重要功能或分别作为鞘脂和GPI锚的组分。脂肪酸的从头合成使用大量代谢物、乙酰基辅酶A、ATP和NADPH，从而与依赖于这些化合物的其它细胞过程有竞争。NADPH为脂肪酸延长循环中的两个还原步骤所需，这将脂肪酸合成与细胞的代谢状态关联，导致脂肪酸合成被限制到细胞有高能量负荷的条件(由增加的ATP/AMP比率、升高的还原当量和升高的乙酰基辅酶A储备指示)下。脂肪酸代谢中涉及几乎所有亚细胞器，表明需要在多个水平进行调节以维持脂肪酸稳态。大多数生物(包括酵母)能够从多种碳源从头合成脂肪酸。在起始步骤中，通过由乙酰辅酶A羧化酶(ACC ;在酵母中的由ACCl和HFAl编码)向丙二酰辅酶A添加CO2来羧化乙酰辅酶A。生物素是该反应中的重要辅因子，并通过生物素载脂蛋白连接酶(在酵母中由BPL1/ACC2编码)与ACC载脂蛋白(apoprotein)共价连接。ACC是三功能酶，带有生物素羧基载体蛋白(BCCP)结构域、生物素羧化酶(BC)结构域和羧基转移酶(CT)结构域。在大多数细菌中，这些结构域表达为单独的多肽并装配成异复合物。相反，真核ACC(包括线粒体ACC变体(酵母中的Hfal))在单个多肽上带有这些功能。由ACC产生的丙二酰辅酶A在由脂肪酸合酶、FAS和延长酶催化的循环系列反应中作为两个碳的供体。在酵母中，胞浆脂肪酸合成中所涉及的单独功能分别表现为一个或两个不同多肽链上的分离结构域。酵母胞浆脂肪酸合酶(FAS)是由两个亚基FaslW亚基)和Fas2(a亚基)构成的复合物，其组织为六聚a 60 6复合物。Fasl带有乙酰基转移酶、烯酰基还原酶、脱水酶和丙二酰基棕榈酰转移酶活性。Fas2包含酰基载体蛋白、3-酮基还原酶、3-酮基合酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶活性。酵母线粒体的脂肪酸合成通过类型II FAS系统进行，其在不同多肽上带有单独的酶促活性Acpl,携带磷酸泛酰巯基乙胺基团辅基(prosthetic phosphopantetheinegroup)的酰基载体蛋白；Ceml, ^ -酮酰基-ACP合酶；0arl, 3-氧代酰基_[酰基载体蛋白质]还原酶；Htd2,3-p5基酰基-硫酯脱水酶；Etrl,烯酰基-ACP还原酶。Ppt2的功能是磷酸泛酰巯基乙胺蛋白质转移酶，其催化磷酸泛酰巯基乙胺辅基与apoACP的连接。脂肪酸从头合成的直接产物是饱和脂肪酸。已知在真核生物(包括酵母)中，饱和脂肪酸是不饱和脂肪酸的前体。不饱和脂肪酸一般由特异性酶(称为去饱和酶)通过饱和脂肪酸中C-C单键的去饱和而产生。控制饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸的调控机制尚未完全理解。在真核生物中，不饱和脂肪酸在膜流动性、细胞活性、代谢和控制基因转录的 核事件的调节中扮演重要角色。通常，约80%的酵母脂肪酸是单不饱和的，意指它们在其脂肪族链中包含一个不饱和键。单不饱和脂肪酸生物合成中的一个至关重要的步骤是在A9位(碳9和10之间)引入第一顺式双键。由硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD，也称为A9-去饱和酶)催化该氧化反应。虽然双键的插入发生于几种不同的其中具有亚甲基的脂肪酰辅酶A底物，但是优选的SCD的底物是分别转化为棕榈油酰(16. I)辅酶A和油酰(18. I)辅酶A的棕榈酰(16. 0)辅酶 A 和硬脂酰(18. 0)辅酶 A (Ntambi，J. Lipid Res.，1999，40，1549-1558)。在1990年于酿酒酵母(S. cerevisiae)中将硬脂酰辅酶A去饱和酶基因鉴定为 OleUStukey JE 等，J Biol Chem.，1990，265 (33) :20144-9)。在 1994 年，通过从人脂肪组织分离0. 76kb的部分cDNA部分地表征了人硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(Li等，Int. J. Cancer, 1994，57，50348-352)。在1999年该基因被完全表征，并且发现多腺苷酸化位点的替选使用产生3. 9kb和5. 2kb的两种转录本(Zhang等，Biochem. J.，1999,340,255-264)。在酿酒酵母中，由内质网(ER)驻留和基本A 9-去饱和酶Olel催化脂肪酸的单去饱和(Martin CE, Oh CS, Jiang Y, Regulation of long chain unsaturated fatty acidsyntnesis in yeast. . Biochim Biophys Acta. 2007Mar ; 1771 (3) :271-85. Epub 2006 Jul13)。本发明的一些方面(至少部分)涉及鉴定本文所述的解脂耶氏酵母中酿酒酵母Olel的同系物SCD。以下示出解脂耶氏酵母SCD的代表性序列的非限制性例子> gi I 0548053 | ref | XP_501496. 11 YAL10C05951p [解脂耶氏酵母]MVKNVDQVDLSQVDTIASGRDVNYKVKYTSGVKMSQGAYDDKGRHISEQPFTWANWHQHINWLNFILVIALPLSSFAAAPFVSFNWKTAAFAVGYYMCTGLGITAGYHRMWAHRAYKAALPVRIILALFGGGAVEGSIRffffASSHRVHHRffTDSNKDpYDARKGFffFSHFGNMLLVpNpKNKGRTDISDLNNDffVVRLQHKYYVYVLVFMAIVLpTLVCGFGWGDWKGGLVYAGIMRYTFVQQVTFCVNSLAHWIGEQpFDDRRTPRDHALTALVTFGEGYHNFHHEFpSDYRNALIWYQYDpTKWLIWTLKQVGLAffDLQTFSQNAIEQGLVQQRQKKLDKWRNNLNWGIPIEQLpVIEFEEFQEQAKTRDLVLISGIVHDVSAFVEHHPGGKALIMSAVGKDGTAVFNGGVYRHSNAGHNLLATMRVSVIRGGMEVEVWKTAQNEKKDQNIVSDESGNRIHRAGLQATRVENPGMSGMAA (SEQ ID NO 1)> gi I 50548052 | ref | XM_501496. I 解脂耶氏酵母 YALI0C0595lp (YALIOCO595Ig)mRNA,完整 cdsATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGATCTCTCGCAGGTCGACACCATTGCCTCCGGCCGAGATGTCAACTACAAGGTCAAGTACACCTCCGGCGTTAAGATGAGCCAGGGCGCCTACGACGACAAGGGCCGCCACA
TTTCCGAGCAGCCCTTCACCTGGGCCAACTGGCACCAGCACATCAACTGGCTCAACTTCATTCTGGTGATTGCGCTGCCTCTGTCGTCCTTTGCTGCCGCTCCCTTCGTCTCCTTCAACTGGAAGACCGCCGCGTTTGCTGTCGGCTATTACATGTGCACCGGTCTCGGTATCACCGCCGGCTACCACCGAATGTGGGCCCATCGAGCCTACAAGGCCGCTCTGCCCGTTCGAATCATCCTTGCTCTGTTTGGAGGAGGAGCTGTCGAGGGCTCCATCCGATGGTGGGCCTCGTCTCACCGAGTCCACCACCGATGGACCGACTCCAACAAGGACCCTTACGACGCCCGAAAGGGATTCTGGTTCTCCCACTTTGGCTGGATGCTGCTTGTGCCCAACCCCAAGAACAAGGGCCGAACTGACATTTCTGACCTCAACAACGACTGGGTTGTCCGACTCCAGCACAAGTACTACGTT
TACGTTCTCGTCTTCATGGCCATTGTTCTGCCCACCCTCGTCTGTGGCTTTGGCTGGGGCGACTGGAAGGGAGGTCTTGTCTACGCCGGTATCATGCGATACACCTTTGTGCAGCAGGTGACTTTCTGTGTCAACTCCCTTGCCCACTGGATTGGAGAGCAGCCCTTCGACGACCGACGAACTCCCCGAGACCACGCTCTTACCGCCCTGGTCACCTTTGGAGAGGGCTACCACAACTTCCACCACGAGTTCCCCTCGGACTACCGAAACGCCCTCATCTGGTACCAGTACGACCCCACCAAGTGGCTCATCTGGACCCTCAAGCAGGTTGGTCTCGCCTGGGACCTCCAGACCTTCTCCCAGAACGCCATCGAGCAGGGTCTCGTGCAGCAGCGACAGAAGAAGCTGGACAAGTGGCGAAACAACCTCAACTGGGGTATCCCCATTGAGCAGCTGCCTGTCATTGAGTTTGAGGAGTTCCAAGAGCAGGCCAAGACCCGAGATCTGGTTCTCATTTCTGGCATTGTCCACGACGTGTCTGCCTTTGTCGAGCACCACCCTGGTGGAAAGGCCCTCATTATGAGCGCCGTCGGCAAGGACGGTACCGCTGTCTTCAACGGAGGTGTCTACCGACACTCCAACGCTGGCCACAACCTGCTTGCCACCATGCGAGTTTCGGTCATTCGAGGCGGCATGGAGGTTGAGGTGTGGAAGACTGCCCAGAACGAAAAGAAGGACCAGAACATTGTCTCCGATGAGAGTGGAAACCGAATCCACCGAGCTGGTCTCCAGGCCACCCGGGTCGAGAACCCCGGTATGTCTGGCATGGCTGCTTAG (SEQ ID NO :2)硬脂酰辅酶A去饱和酶或S⑶在其由辅酶A酯化的脂肪酸底物的A9-C处引入双键。该活性影响饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸(例如硬脂酸与油酸)的比率。硬脂酸是SCD的主要底物，但是其它链长度脂肪酸也可以由SCD加工。认为人体中的硬脂酰辅酶A去饱和酶是脂肪生成酶，这不仅是由于它在单不饱和脂肪酸的生物合成中的重要角色，还由于其通过膳食和胰岛素进行调节的模式(Ntambi，Lipid Res.，1999，40，1549-1558)。因此，硬脂酰辅酶A去饱和酶的调节在生理上相当重要并且其活性对饮食变化、激素失调、发育过程、温度变化、金属、醇、过氧化物酶体增殖子和酚类化合物敏感(Ntambi，Lipid Res.，1999，40，1549-1558)。动物模型在通过多聚不饱和脂肪酸(PUFA)调节硬脂酰辅酶A去饱和酶的研究中非常有用。例如，在清瘦和肥胖Zucker大鼠(Jones等)的脂肪组织中观察到，当对两组均饲喂与对照膳食相比PUFA含量高的膳食时，硬脂酰辅酶A去饱和酶mRNA减少了 75 %(Jones等，Am. J. Physiol.，1996，271，E44-49)。用组织培养系统获得了类似的结果。在鼠3T3-L1脂肪细胞系中，花生四烯酸、亚麻油酸、亚麻酸和二十碳五烯酸以剂量依赖的方式使硬脂酰辅酶A去饱和酶的表达降低(Sessler等，J. Biol. Chem.，1996，271，29854-29858)。对不同组织中PUFA调节硬脂酰辅酶A去饱和酶基因表达的分子机制仍了解很少。目前对调节机制的理解涉及PUFA与推定的PUFA结合蛋白相结合，然后，通过PUFA结合蛋白与硬脂酰辅酶A去饱和酶基因的顺式作用PUFA应答元件(SREBP)的结合发生转录抑制(Ntambi, Lipid Res.，1999，40，1549-1558 ；Zhang 等，Biochem. J.，2001，357，183-193)。虽然，已经在不同生物中研究了 S⑶基因催化活性的调节，但S⑶基因的表达和调节对脂质代谢的意义本身仍未成为深入研究的对象。已提出SCD影响饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸(例如硬脂酸与油酸)的比率。本发明的一些方面涉及出乎意料地发现S⑶还作为微生物中(例如解脂耶氏酵母中)脂肪酸和TAG代谢的关键调节因子发挥作用。本发明的一些方面涉及出乎意料地发现单独过表达SCD基因产物不仅改变受影响细胞中的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比率，而且足以引起脂肪酸和/或TAG合成速率和/或储存的显著且出乎意料地增加。单独操作去饱和酶表达为以工业规模将碳水化合物转化为脂质的微生物(例如产油酵母细胞)赋予极理想表型的该出乎意料的发现对通过微生物介导的发酵过程从可再生碳源有效生产生物燃料或生物燃料前体具有深远意义。通过在微生物中过表达SCD克制脂肪酸合成和储存的下调不仅赋予微生物增加的脂肪酸合成率和积累，还克服了培养中FA/TAG合成限于微生物的稳定期的限制。出乎意料地，微生物(例如用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物)中SCD的过表达还赋予微生物对高浓度底物(例如可发酵糖)和与底物相关的有毒物质(例如底物预处理过程的副产物)的耐受。由S⑶过表达赋予的表型(例如上述耐受提高表型)允许在将糖转化为脂质的工业发酵过程中的获得高浓度的脂质(参见图11的通过S⑶过表达克服FA合成负调节)。根据本发明的一些方面，操作其它基因可有助于通过微生物发酵从碳源大规模生产生物燃料或生物燃料前体。例如，影响含碳底物(例如糖)转向脂肪酸合成的基因。因此，本发明的一些方面提供了操作调节碳流入或流出脂质合成途径所涉及之基因的表达以实现脂质生产参数的改善的方法。本发明的一些方面提供了对调节生产生物燃料或生物燃料前体之微生物的脂质代谢的其它基因产物的表达和/或活性进行操作的方法。本发明一些方面的操作旨在增加碳水化合物向脂肪酸和/或TAG的转化以针对从碳水化合物源大规模生产脂质对所操作生物进行优化。本发明一些方面提供的操作例如特定基因产物的过表达、敲除、敲低、活化和/或抑制可以单独或组合，和/或与本领域技术人员已知的其它操作组合实施。术语“操作”是指遗传操作(例如特定基因产物的过表达、敲除、敲低、活化和/或抑制)和非遗传操作(例如培养基、底物、底物预处理、pH、温度、转化方法等的操作)二者。基因表达操作(在本文中也称为基因表达的调控)可以是对给定基因表达的天然调节的破坏或抑制，过表达，表达的抑制或表达的完全消除。在天然基因序列(例如天然SCD基因序列)上游插入异源启动子或在启动子中缺失调节序列(例如介导SCD基因通过饱和脂肪酸的反馈抑制的调节序列)是破坏或抑制表达的天然调节的例子。调控基因表达的策略可以包括遗传改变(例如通过重组技术如基因靶向或病毒转导)，或者非遗传改变(例如已知引起基因表达上调或下调的环境改变，或者调控因子的瞬时递送例如将药物或 小RNA分子瞬时递送至靶细胞)。遗传和非遗传改变微生物的方法为本领域技术人员所公知并且描述于例如J. Sambrook和D. Russell,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press ;第 3 版(January 15,2001) ；David C. Amberg,Daniel J. Burke ;和 Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics A Cold SpringHarbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(April2005) ；John N. Abelson,Melvin I. Simon,Christine Guthrie和Gerald R. Fink,Guide toYeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volume 194 (Methods in EnzymologySeries, 194), Academic Press(March 11,2004) ；Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,Part B,第350卷(Methodsin Enzymology, % 350 卷),Academic Press ;第 I 版(July2, 2002) ；Christine Guthrieand Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, PartC,第351 卷,Academic Press ;第 I版(July 9,2002) ；Gregory N. Stephanopoulos,AristosA. Aristidou和 Jens Nielsen,Metabolic Engineering !Principles and Methodologies,Academic Press ； % I 版·(October 16,1998);以及 Christina SmoIke, The MetabolicPathway Engineering Handbook !Fundamentals, CRC Press ;第 I 版(July28, 2009),其全部通过引用并入本文。本文所使用的术语“过表达”是指与参照细胞(例如相同细胞类型的野生型细胞或相同细胞类型但缺少特定修饰例如遗传修饰的细胞)相比，给定细胞、细胞类型或细胞状态中给定基因表达水平的增加。在表现出会抑制野生型细胞中SCD基因表达之饱和脂肪酸浓度的解脂耶氏酵母细胞中强制地持续表达SCD基因是基因过表达的一个例子。本文所使用的术语“敲除”是指对基因产物(例如RNA或蛋白质)的表达的功能性破坏。其通常通过用靶向性构建体靶向各基因组区引起来自重组基因的基因产物(例如mRNA或蛋白质)表达的完全抑制，所述靶向性构建体与所述基因组区的特定部分重组并且缺失所述区的一部分和/或插入异源核苷酸或核苷酸序列。在二倍体中，这样的同源重组事件通常只影响两个等位基因中的一个。纯合性可以通过多种策略获得，例如通过繁殖杂合体和筛选子代。在二倍体生物(例如酵母)中，术语“敲除菌株”一般是指非功能性等位基因纯合的菌株。本文所使用的术语“敲低”是指部分抑制基因产物(例如mRNA或蛋白质)的表达。本领域已知多种基因敲低策略可用于抑制基因表达(例如抑制或将资源转移出脂质合成途径的基因的表达，如产油酵母例如解脂耶氏酵母中的ACS2、FATU PCS60和/或AMPK)。例如，可以采用利用RNA干扰(RNAi)和/或micro RNA (miRNA)途径(包括小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、双链RNA(dsRNA) ,miRNA和本领域已知的其它基于核酸的小干扰分子)的基因敲低策略。在一个实施方案中，使用基于载体的RNAi模式(例如shRNA或shRNA-mir表达构建体)降低细胞中(例如产油酵母细胞如解脂耶氏酵母细胞中)基因(例如抑制或将资源转移出脂质合成途径的基因，如ACS2、FATl、PCS60和/或AMPK)的表达。根据本发明一些方面的分离的质粒可以包含与编码小干扰核酸(例如shRNA)的基因有效连接的启动子。在一些实施方案中，可以使用分离的质粒载体产生能够感染细胞(例如酵母细胞或细菌细胞)的病毒颗粒(例如逆转录病毒或噬菌体)。示例性病毒包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、噬菌体和本领域已知以及本文中公开的其它病毒。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)活性的方法。SCD是在与辅酶A偶联的硬脂酸的C9和ClO之间插入双键的A 9去饱和酶，如在本文中其它处所详述的，该插入步骤是产生去饱和的脂肪酸及其衍生物的关键步骤。在一些实施方案中，该操作是过表达。在一些实施方案中，操作通过使生产生物燃料或生物燃料前体的微生物与有效连接异源启动子(例如，组成型或诱导型启动子)的包含SCD基因产物(例如SCD蛋白)编码核酸的表达构建体接触来进行。在一些实施方案中，编码S⑶基因产物的核酸包含SEQ ID NO :2的编码序列。在一些实施方案中，S⑶是解脂耶氏酵母S⑶，例如包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列的解脂耶氏酵母S⑶。在一些实施方案中，微生物是解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，在微生物中进行对SCD活性的操作以赋予用于大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物的增强的耐受。硬脂酰辅酶A去饱和酶基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :852825入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作c-Jun N-末端激酶2 (JNK2)的活性的方法。JNK2位于细胞质中并在饥饿过程中催化脂肪酸分解用于产生能量和碳屏蔽(carbonblock)。JNK2为能量稳态所需并在应答于细胞低糖水平的脂肪酶活化中扮演着重要角色。参见Grimard V, Massier J, Richter D, SchwudkeD, Kalaidzidis Y, Fava E, Hermetter A, Thiele C. , siRNA screening revealsJNK2as an evolutionary conserved regulator of triglyceride homeostasis. JLipid Res. 2008Nov ；49(11) :2427-40. Epub 2008 Jul 8。在一些实施方案中，消除或降低生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中的JNK2活性，例如分别通过敲除或敲低。在一些实施方案中，降低生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中的JNK2活性以增加产物稳定性和/或减少产物分解代谢。在一些实施方案中，使用了条件性抑制系统，并在碳水化合物源(例如可发酵糖)很少的生产过程期间抑制JNK2活性。在一些实施方案中，在微生物中对JNK2基因产物的活性进行操作以赋予用于大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。JNK2基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :5601入口下可见不例性的代表性基因和基因广物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作A-12去饱和酶基因产物的活性的方法。△ -12去饱和酶参与将含油酸的脂质转化为高级链脂质。在一些实施方案中，例如考虑到所得生物燃料的冷流特性，期望避免长链脂肪酸的生产或使其最小化以生产生物燃料。在一些实施方案中，消除或降低生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中△-12去饱和酶的活性，例如分别通过完全(例如，敲除)或部分基因缺失或敲低。在一些实施方案中，降低用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中的A-12去饱和酶活性以增加产物稳定性、在微生物中获得期望的TAG谱和/或降低产物的分解代谢。在一些实施方案中，使用条件性抑制系统抑制A-12去饱和酶活性。在一些实施方案中，在微生物中对A-12去饱和酶基因产物的活性进行操作以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率，增加的碳水化合物向脂质转化的效率，增加的脂质储存，增加的C18脂肪酸的含量，增加的微生物的总脂肪酸储积中C18脂肪酸的百分数，所产生的脂质、油或TAG的增加的冷流特性，增加的生长速率，对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。A-12去饱和酶基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :2909806入口下可见不例性的代表性基因和基因广物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作血红蛋白基因产物的活性的方法。对于血红蛋白基因产物(包括用于本发明一些实施方案的血红蛋白基因产物)的概述，参见Frey AD, Kallio PT. Bacterial hemoglobinsand flavoh emoglobins versatile proteinsand their impactonmicrobiology andbiotechnology. FEMS MicrobiolRev. 20030ct ；27(4) :525_45。在一些实施方案中，例如通过过表达编码血红蛋白蛋白质的核酸来增加微生物中血红蛋白基因产物(例如血红蛋白蛋白质)的活性。在一些实施方案中，微生物中血红蛋白的过表达引起微生物中氧传递增加。在一些实施方案中，由于增加的氧流入需要高氧的合成途径(例如脂肪酸合成途径)，所以增加的血红蛋白活性导致生物燃料或生物燃料前体合成增加。在一些实施方案中，在微生物中操作血红蛋白基因产物的活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。血红蛋白基因和基因 产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID :7738539 (Deide 12990)入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作细胞色素基因产物的活性的方法，所述细胞色素基因产物例如细胞色素B基因产物，更特别地为细胞色素B5基因产物。在一些实施方案中，通过例如过表达编码细胞色素蛋白的核酸来增加微生物中细胞色素基因产物(例如细胞色素蛋白)的活性。在一些实施方案中，在微生物中过表达细胞色素引起微生物中的氧传递增加。在一些实施方案中，由于增加的氧流入需要高氧的合成途径(例如脂肪酸合成途径)，所以增加的细胞色素活性导致生物燃料或生物燃料前体合成增加。在一些实施方案中，在微生物中操作细胞色素基因产物的活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物的增强的耐受。细胞色素基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :1528入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作葡萄糖转运蛋白(GLUT)基因产物(例如Glut I基因产物)的活性的方法。在一些实施方案中，通过例如过表达编码GLUT蛋白质的核酸来增加微生物中GLUT基因产物(例如GLUT蛋白质)的活性。在一些实施方案中，在微生物中过表达编码GLUT蛋白质的核酸引起微生物的葡萄糖摄取增加。在一些实施方案中，由于葡萄糖的摄取增加，所以增加的GLUT活性导致生物燃料或生物燃料前体合成增加。在一些实施方案中，在微生物中操作GLUT基因产物的活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。GLUT基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :38109入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作丙酮酸羧化酶(PC)基因产物的活性的方法。在一些实施方案中，通过例如过表达编码PC蛋白质的核酸来增加微生物中PC基因产物(例如PC蛋白质)的活性。在一些实施方案中，在微生物中过表达编码PC蛋白质的核酸引起微生物的葡萄糖摄取增加。在一些实施方案中，由于葡萄糖的摄取增加，所以增加的PC活性导致生物燃料或生物燃料前体合成增加。在一些实施方案中，在微生物中操作PC基因产物的活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。PC基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :5091A口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作苹果酸酶(ME)基因产物的活性的方法。ME催化(S)-苹果酸氧化脱羧成丙酮酸，同时伴随二氧化碳的释放和NADP+到NADPH的转化。在一些实施方案中，通过例如过表达编码ME蛋白质的核酸来增加微生物中ME基因产物(例如ME蛋白质)的活性。在一些实施方案中，在微生物中过表达编码ME蛋白质的核酸引起微生物中NADPH水平增加，导致充足水平的还原性代谢物(例如NADPH)用于增加脂肪酸合成。在一些实施方案中，由于NADPH水平增加，所以增加的ME活性导致生物燃料或生物燃料前体合成增加。在一些实施方案中，在微生物中操作ME基因产物的活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。ME基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID : 17436入口下可见示例性的代表性基因和基因广物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中(例如解脂耶氏酵母中)操作乙酰辅酶A羧化酶(ACC)基因产物的方法。ACC基因产物介导乙酰辅酶A (脂肪酸合成中的主要C2前体)转化为丙二酰辅酶A，该转化被认为是脂肪酸合成中的第一关键步骤并且还被认为是脂肪酸合成中的限速步骤(参见Cao Y，Yang J，Xian M，Xu X,Liu W. Increasing unsaturated fatty acid contents in Esch erich ia coli bycoexpression of three different genes. Appl Microbiol Biotechnol. 2010)。在一些实施方案中，ACC活性操作是ACC过表达。在一些实施方案中，微生物中ACC过表达增加脂肪酸合成率和/或赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存、增加的生长速率、对物质(例如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度的增强的耐受。ACC基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :855750入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作酰基辅酶A合成酶(ACS)的活性的方法。ACS是催化具有辅酶A的脂肪酸的硫酯化以形成活化中间体的酶家族(参见 Lu X, Vora H, Khosla C. , Ov erproduction of free fattyacids in E.coli !implications for biodiesel production Metab Eng.2008 Nov ；10(6) :333-9)。这些中间体是磷脂、脂肪酸胆固醇酯或脂肪酸醇酯(如TAG)的前体。解脂耶氏酵母包含两种已知的和两种预测的酰基辅酶A合成酶。在本发明的一些实施方案中，在产生脂质的生物中过表达ACS酶以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存和/或分泌、增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。ACS基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :851245入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作酰基辅酶A合成酶2(ACS2)的活性的方法，ACS2是位于过氧化物酶体中的酶并且参与脂肪酸的降解。在一些实施方案中，抑制ACS2阻止或抑制脂肪酸通过酵母分解代谢降解，并且在一些实施方案中，这种抑制补充FAAl基因产物活性的增加以使增加的脂肪酸分泌入培养基中。解脂耶氏酵母包含ACS2乙酰基辅酶A合成酶(参见Beopoulos A，Cescut J，Haddouche R,Uribelarrea JL, Molina-Jouve C, Nicaud JM. ,Yarrowia lipolytica as amodel for bio-oil production. Prog Lipid Res. 2009Nov ；48(6) :375-87)。在一些实施方案中，在微生物中敲除、敲低和/或抑制ACS2基因产物表达或活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对物质(例如碳源、生 物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度的增强的耐受。ACS2基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID :850846入口下可见不例性的代表性基因和基因广物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作FAAl基因产物的活性的方法。FAAl基因产物催化具有辅酶A的长链脂肪酸的细胞质硫酯化以产生活化的中间体。解脂耶氏酵母FAAl是酿酒酵母P30624FAA1长链脂肪酸辅酶A连接酶的同系物。该酶参与游离脂肪酸储积的产生以及脂肪酸的分泌。在一些实施方案中，在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中过表达FAAl基因产物以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。FAAl基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www. ncbi. nlm. nih.gov)中GeneID :854495入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作非常长链脂肪酸辅酶A合成酶(FATl)活性的方法。认为FATl控制具有辅酶A的非常长链脂肪酸的脂肪酸转运和硫酯化。解脂耶氏酵母包含FATl非常长链脂肪酸辅酶A合成酶。在一些实施方案中，通过例如遗传操作来抑制FATl活性以阻止非常长脂肪酸衍生物的合成和/或增加游离脂肪酸的储积。在一些实施方案中，在微生物中敲除、敲低和/或抑制FATl基因产物的表达或活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对物质(例如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度的增强的耐受。FATl基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www. ncbi.nlm. nih. gov)中GeneID :852329入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。本发明的一些方面提供了操作PCS60的方法，PCS60也称为FAT2、AMP结合蛋白酰基辅酶A合成酶或过氧化物酶体辅酶A合成酶，它是具有未确定底物特异性的过氧化物酶体酰基辅酶A合成酶。解脂耶氏酵母包含酿酒酵母PCS 60同系物。抑制PCS60将阻止非常长脂肪酸衍生物的合成并增加游离脂肪酸的储积。在本发明的一些实施方案中，在微生物中敲除、敲低和/或抑制PCS60基因产物的表达或活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对物质(例如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度的增强的耐受。FAT2基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID :852523入口下可见不例性的代表性基因和基因广物序列。本发明的一些方面提供了在用于大规模生产生物燃料或生物燃料前体的微生物(例如解脂耶氏酵母)中过表达ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)的方法。适于以工业规模生产生物燃料或生物燃料前体的一些微生物(包括解脂耶氏酵母)通常产生大量柠檬酸。ACLY介导柠檬酸转化为辅酶A，根据本发明的一些方面，该反应可以通过ACLY表达促进(参见 Holz M, Forster A, Mauersberger S, Barth G, Aconitase overexpression changestheproduct ratio of citric acidproduction by Yarrowia lipolytica. Appl MicrobiolBiotechnol. 2009Jan ；81 (6) :1087-96) 0在一些实施方案中，ACLY过表达降低不期望的柠檬酸产生和/或提供其它来源的乙酰辅酶A用于合成生物燃料或生物燃料前体。在一些实 施方案中，在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物(包括解脂耶氏酵母)中抑制柠檬酸的过量产生。在一些实施方案中，微生物中(例如解脂耶氏酵母中)ACLY过表达增加脂肪酸合成率和/或赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对物质(例如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度的增强的耐受。也参见 Lasserre JP, Nicaud JM, Pagot Y, Joubert-Caron R, Caron M, HardouinJ. Talanta. First complexomic study of alkane—binding protein complexes in theyeast Yarrowia lipolytica. 2010 Feb 15 ；80(4) :1576_85。ACLY 基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID : 108728入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。本发明的一些方面提供了过表达脂肪酸合酶复合物(FAS)的方法。虽然ACC可能是脂肪酸合成中的限速酶，但是也已提出其它步骤对该途径进行控制，最值得注意的是 FAS (参见 Schweizer E, JCiittig H，Regler R，Rottner G. J，Genetic control ofYarrowia lipolytica fatty acid synthetase biosynthesis and function. BasicMicrobiol. 1988 ;28 (5) :283-92)。该复合物是在整个脂质合成途径中底物最强(mostsubstrate-intensive)的过程中延伸脂肪酸链的多功能多肽。在一些实施方案中，微生物中(例如解脂耶氏酵母中)ACLY过表达增加了脂肪酸合成率和/或赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存和/或分泌、增加的生长速率、对物质(例如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度增强的耐受。FAS基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI 数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov)中 GeneID :853653 和 GeneID 855845入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。本发明的一些方面提供了抑制AMP活化蛋白激酶(AMPK)的方法。AMPK是通过应答于细胞AMP =ADP比率通过磷酸化来调节其它蛋白质的活性的调节酶(参见Lee-YoungRS, Palmer MJ, Linden KC, LePlastrier K， Canny BJ, Hargreaves M， Wadley GD， KempBE，McConell GK. Carbohydrate ingestion does not alter skeletal muscle AMPKsignaling during exercise in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2006Sep ；291(3) :E566-73)。在酵母中，AMPK表现出靶向ACC和INO I，INOl是脂质生物合成早期步骤所需的基因。在AMPK敲除突变体中缺少ACC磷酸化导致超活化的ACC和脂肪酸的过量产生。在一些实施方案中，在微生物中抑制AMPK引起脂质合成的超活化。在一些实施方案中，通过例如敲除AMPK基因完全消除微生物中的AMPK活性。在一些实施方案中，通过例如遗传或非遗传操作抑制微生物中AMPK的活性。AMPK活性的抑制(与完全消除不同)可避免对由AMPK调节的其它细胞过程的负作用。在一些实施方案中，在微生物(例如解脂耶氏酵母)中敲除、敲低和/或抑制AMPK基因产物的表达或活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存和/或分泌、增加的生长速率、对物质(如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度增强的耐受。AMPK基因和基因产物序列为本领域技术
人员所公知。NCBI 数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中 GeneID : 100145903 入口下可见不例性的代表性基因和基因产物序列。分离的核酸本发明的一些方面提供了为微生物(例如解脂耶氏酵母)赋予生产生物燃料或生物燃料前体的需要和/或期望表型之基因产物的编码核酸。在一些实施方案中，该核酸是来自解脂耶氏酵母的核酸。在一些实施方案中，该核酸编码去饱和酶，例如A9去饱和酶。在一些实施方案中，该核酸编码解脂耶氏酵母A 9去饱和酶。在一些实施方案中，该核酸包含SEQ ID N0:1。在一些实施方案中，该核酸是SEQ ID N0:1。在一些方案中，该核酸编码基因产物，例如由SEQ ID NO 1编码的蛋白质。本发明的一些方面提供了基因产物(例如蛋白质)，其为微生物(例如解脂耶氏酵母)赋予生产生物燃料或生物燃料前体的需要和/或期望表型。在一些实施方案中，该蛋白质是来自解脂耶氏酵母的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是去饱和酶，例如A9去饱和酶。在一些实施方案中，该蛋白质是解脂耶氏酵母A9去饱和酶。在一些实施方案中，该蛋白质的氨基酸序列是提供于SEQ ID NO 2中的氨基酸序列。术语“核酸”是指包含多个连接的核苷酸的分子。“核酸”和“核酸分子”互换使用并且意指寡核糖核苷酸以及寡脱氧核糖核苷酸。该术语还涵盖多核苷(即多核苷酸除去磷酸)和包含核酸的任意其它有机碱。有机碱包括腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和肌苷。核酸可以是单链的或双链的。核酸可以天然或非天然的。核酸可以从天然来源获得或者可以使用核酸合成仪合成(即合成的)。本领域中常规地进行核酸的分离并且合适的方法可见标准分子生物学教科书。(参见，例如Maniatis’Handbook of MolecularBiology。)如本文所述，核酸可以是DNA或RNA，如基因组DNA、线粒体DNA、mRNA、cDNA、rRNA、miRNA、PNA或LNA或者其组合。根据本发明的一些方面也可使用非天然核酸如细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。本发明的一些方面涉及使用核酸衍生物。如将在本文中描述的，使用某些核酸衍生物可以通过防止本发明核酸的消化来增加其稳定性，特别是当它们暴露于可能包含核酸酶的生物样本时。本文中所使用的核酸衍生物是非天然核酸或其单元。核酸衍生物可以包含非天然元件如非天然核苷酸和非天然骨架连接。根据本发明一些方面的核酸衍生物可以包含骨架修饰例如但并不限于硫代磷酸酯连接、磷酸二酯修饰的核酸、磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸的组合、磷酸甲酯、磷酸烷基酯、磷酸酯、硫代磷酸烷基酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯(acetamidate)、羧甲基酯、硫代磷酸甲酯、二硫代磷酸酯、对乙氧基及其组合。核酸的骨架组成可以是同源的或异源的。根据本发明的一些方面的核酸衍生物可以包含糖和/或碱中的替换或修饰。例如，一些核酸衍生物可以包括具有骨架糖的核酸，骨架糖共价连接除3'位处的羟基外的和除5'位处的磷酸基外的低分子量有机基团(例如2' -0-烷基化核糖基团)。核酸衍生物可以包括非核糖糖阿拉伯糖。核酸衍生物可以包含取代的嘌呤和嘧啶如C-5丙炔修饰碱基、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、次黄嘌呤、2-硫脲嘧啶和假异胞嘧啶。在一些实施方案中，核酸可以包括肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA) ,DNA,RNA或上述的联合核酸(co-nucleic acid)如DNA-LNA联合核酸。 本文所使用的术语“分离的核酸分子”是指不在其天然环境中的核酸，例如，(i)通过本领域已知方法从细胞或微生物(例如细菌或酵母)中提取和或/纯化的核酸，所述本领域已知方法例如碱性裂解宿主细胞然后例如通过氧化硅吸附法纯化核酸；(ii)通过例如聚合酶链反应(PCR)体外扩增的核酸；(iii)通过克隆(例如将核酸克隆入表达载体)重组产生的核酸；(iv)通过例如体外酶消化或通过剪切然后胶分离的片段化和大小分离的核酸；或者(V)通过例如化学合成而合成的核酸。在一些实施方案中，通过本领域公知的重组DNA技术易于操作分离的核酸。因此，认为克隆入载体的核酸或递送到宿主细胞并整合入宿主基因组的核酸是分离的，但在其天然宿主中的天然状态下(例如在宿主的基因组中)的核酸则不是。分离的核酸可以是基本纯化的，但不需要如此。例如，克隆或表达载体中的分离的核酸不是纯的，其可仅包含小百分比的其所处细胞中的物质。但是本文所使用的术语中这种核酸是分离的。本发明的一些方面涉及赋予生产生物燃料或生物燃料前体的微生物所需或期望表型的基因产物的编码核酸，其与启动子或其它转录活化元件相连接。在一些实施方案中，编码基因产物且与启动子连接的核酸包含于表达载体或表达构建体中。本文所使用的术语“表达载体”或“表达构建体”是指用一系列允许特定核酸在宿主微生物(例如产油酵母)中转录的特定核酸元件重组或合成产生的核酸构建体。在一些实施方案中，表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。在一些实施方案中，表达载体包含与启动子有效连接的待转录的编码核酸。启动子是促进待转录核酸进行转录的核酸元件。启动子通常位于相同链和其所控制转录的核酸序列的上游(或5’)。在一些实施方案中，表达载体包含与异源启动子有效连接的待转录的编码核酸。异源启动子是非天然地与给定核酸序列有效连接的启动子。例如，解脂耶氏酵母中的SCD基因天然地与解脂耶氏酵母SCD基因启动子有效连接。因此，除野生型解脂耶氏酵母SCD基因启动子以外的与SCD基因或其部分有效连接的任意启动子(例如表达构建体中)是异源启动子。在一些实施方案中，表达载体包含有效连接组成型启动子的编码核酸，例如编码SCD基因产物的核酸。术语“组成型启动子”是指允许其相关联的基因持续转录的启动子。在一些实施方案中，表达载体包含有效连接诱导型启动子的编码核酸，例如，编码S⑶基因产物的核酸。在本文中与术语“条件性启动子”替换使用的术语“诱导型启动子”是指仅在存在或不存在生物或非生物因子时允许其相关联基因转录的启动子。本领域公知的诱导型启动子的例子是药物诱导型启动子(例如四环素/强力霉素诱导型启动子、他莫昔芬诱导型启动子)以及依赖于重组事件活化的启动子(例如crc-介导的IoxP位点的重组)。本领域技术人员公知将表达载体或表达构建体递送到微生物(例如酵母细胞)中的方法。可以通过生物相关领域技术人员公知的多种方法将核酸(包括表达载体)递送到原核微生物或真核微生物。根据本发明的一些方面的将核酸递送到微生物中的方法包括但不限于不同的化学、电化学和生物方法，例如，热休克转化、电穿孔、转染(例如脂质体介导的转染、DEAE-Dextran介导的转染或磷酸钙转染)。在一些实施方案中，使用用于转移遗传物质的载剂或载体将核酸构建体(例如SCD表达构建体)引入宿主微生物中。用于将遗传物质转移到微生物中的载体为本领域技术人员所公知，包括例如质粒、人工染色体和病毒载体。用于构建核酸构建体(包括包含组成型或诱导型异源启动子的表达构建体、敲除或敲低构建体)的方法以及用于将核酸或核酸构建体递送到微生物中的方法和载体为本领域技术人员所公知，并描述于例如以下中J. Sambrook和D. Russell, Molecular Cloning ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress ;第3版(January 15,2001)；David C. Amberg,Daniel J. Burke和 Jeffrey N. Strathern,Methods in Yeast Genetics ACold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress (April 2005) ； John N. Abelson, Melvin I. Simon, Christine Guthrie 和 GeraldR. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A,第 194 卷(Methodsin Enzymology Series,194), Academic Press(March 11,2004) ；Christine Guthrie 和Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B,第 350 卷(Methods in Enzymology,第 350 卷)，Academic Press ;第 I 版(July 2,2002)；Christine Guthrie andGerald R, Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,Part C,第 351 卷，Academic Press ;第 I 版(July 9,2002) ；Gregory N. Stephanopoulos,Aristos A.Aristidou 和 Jens Nielsen, Metabolic Engineering !Principles andMethodologies, Academic Press ;第 I 版(October 16,1998);以及Christina SmoIke, TheMetabolic Pathway Engineering Handbook !Fundamentals,CRC Press ;第 I 版(July 28,2009)，其全部通过引用并入本文。在一些实施方案中，在微生物中对赋予微生物所需或期望表型之基因产物的编码基因的天然启动子(例如天然SCD启动子)进行修饰以改变其转录活性的调节。在一些实施方案中，与未经修饰的对应物相比，经修饰启动子表现出增加的转录活性。本文所使用的术语“经修饰启动子”是指其核苷酸序列已被人工改变的启动子。这样的人工改变的例子是单独的或组合的核苷酸缺失、插入或突变。可以以靶向的方式进行人工启动子改变，例如通过同源重组方法，如基因靶向、敲除、敲低、定点突变或人工锌指核酸酶介导的策略。或者，可以通过随机或半随机事件如照射或非靶向的核苷酸整合后续选择来进行这样的改变。一般进行启动子修饰以调控各启动子的转录活化特性。例如，破坏或缺失介导应答于胞内脂肪酸水平升高来抑制SCD启动子的调节元件将引起SCD基因的持续转录活化，即使在胞内脂肪酸水平升高的条件下也是如此。类似地，将组成型活化的转录活化元件插入条件性启动子区可以使各基因在正常抑制性条件下过表达。本领域技术人员公知在微生物中靶向破坏(例如引起转录速率增加的祀向破坏)天然启动子(例如天然SCD启动子)的方法。在一些实施方案中，提供核酸构建体用于在生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中敲除A-12去饱和酶基因。在一些实施方案中，敲除构建体包含微生物A-12去饱和酶基因的基因组序列，其侧翼的核苷酸序列在插入A-12去饱和酶基因时破坏A-12去饱和酶基因产物的表达。在一些实施方案中，破坏A-12去饱和酶基因产物表达的核酸是抗生素抗性标记物，例如腐草霉素抗性基因。在一些实施方案中，A-12去饱和酶敲除载体包含SEQ IDNO :28所提供的序列。将敲除载体递送到微生物中的方法为本领域技术人员所公知，在微生物中(例如酵母中)进行同源重组的方法为本领域技术人员所公知。本发明并不限于该方面。微生物改造方法本发明的一些方面涉及经改造微生物(例如解脂耶氏酵母)以表现出以大规模生产生物燃料或生物燃料前体的所需和/或期望表型。本发明的一些方面涉及代谢改造S⑶ 途径以得到针对生产生物燃料进行了优化的微生物。本发明的一些方面涉及代谢改造调节碳流入或流出脂肪酸合成途径的基因以得到针对生产生物燃料进行了优化的微生物。本发明的一些方面提供了通过调节解脂耶氏酵母的天然脂代谢大大增加解脂耶氏酵母介导的碳源向脂质的转化效率的方法。本发明的一些方面涉及这样的发现过表达增加脂肪酸或三酰甘油积累的基因(如SC1D)不仅引起脂质积累增加，而且引起脂质合成率、脂质含量和/或生长速率增加。显著地和出乎意料地，根据由本发明提供的一些方法的脂质代谢调节还赋予另一些有利性质，例如对原料物质(包括高浓度底物(例如葡萄糖))和/或通常污染原料(例如经预处理的原料)的有毒物质的耐受增强。这样的污染物质的一些非限制性例子是糠醛、5-羟甲基糠醛和乙酸类。预处理后产生污染的有毒物质的原料物质的非限制例子是来自木材的原料、玉米秸杆和甘蔗渣。本发明的一些方面涉及在解脂耶氏酵母中通过克制脂质代谢的关键调节因子的转录抑制(例如通过克制SCD的转录抑制)来改造出所需和/或期望表型。还考虑了在产生生物燃料的另一些微生物(例如酵母、细菌、真菌或藻类)中操作脂质代谢的关键调节因子(例如，SCD)。为了改造用于以工业规模生产生物燃料的生物(例如产油酵母)，重要的是详细理解各生物中调控脂肪酸和脂质代谢的分子机制。直至本发明，用于生物燃料生产的产生油的微生物(例如产油酵母)中的脂肪酸和脂质代谢调节因子的鉴定和功能注释仍未解决。本发明的一些方面提供了产油酵母解脂耶氏酵母中的关键调节因子基因SCD的鉴定和功能注释。还提供了分离的SCD核酸和蛋白质分子。本发明的一些方面涉及通过遗传改造在微生物中改造出用于生产生物燃料或生物燃料前体的期望表型。本发明的一些方面涉及在微生物中操作参与生产生物燃料或生物燃料前体(例如脂肪酸或三酰甘油)的基因。本发明的一些方面涉及在微生物中平行地操作参与生产生物燃料或生物燃料前体的多个基因。在一些实施方案中，通过本发明的一些方面提供的方法操作单个基因来改造微生物用于生产生物燃料或生物燃料前体，所述基因例如A 9去饱和酶(例如，S⑶)、GLUT (例如，Glutl)、血红蛋白、细胞色素(例如，细胞色素B5)、苹果酸酶、ACC、ACS、ACS2、FAAUFAT1、FAT2、ACLY、FAS、AMPK、JNK2或A-12去饱和酶。在一些实施方案中，通过本发明的一些方面提供的方法操作多个基因来改造微生物用于生产生物燃料或生物燃料前体，所述基因例如A9去饱和酶(例如，S⑶)、GLUT(例如，Glutl)、血红蛋白、细胞色素(例如，细胞色素 B5)、苹果酸酶、ACC、ACS、ACS2、FAAl、FATl、FAT2、ACLY、EAS, JNK2、A-12 去饱和酶和/或AMPK中两个或更多个的任意组合。在一些实施方案中，改造微生物以包含增加水平的SCD基因产物和另外的基因产物表达的其它操作(例如遗传操作)，所述另外的基因产物例如GLUT (例如，Glutl)、血红蛋白、细胞色素(例如，细胞色素B5)、苹果酸酶、ACC、ACS、ACS2、FAA1、FAT1、FAT2、ACLY、FAS、JNK2、A-12去饱和酶或AMPK基因产物。在一些实施方案中，改造微生物以包含增加水平的S⑶基因产物和血红蛋白基因产物。在一些实施方案中，改造微生物以包含增加水平的S⑶基因产物和GLUT基因产物(例如Glutl基因产物)。在一些实施方案中，改造微生物以包含增加水平的S⑶基因产物、GLUT基因产物(例如Glutl基因产物)以及血红蛋白和/或细胞色素基因产物。在一些实施方案中，改造微生物以包含增加水平的SCD基因产物和Glutl、血红蛋白以及细胞色素b5和任选的△ 12去饱和酶敲除。在一些实施方案中，微生物是解脂耶氏酵母。用于生产生物燃料的经改造微生物 本发明的一些方面涉及针对大规模生产生物燃料或生物燃料前体进行了改造和/或优化的微生物。在一些实施方案中，提供了通过由本发明的一些方面提供的方法或者使用由本发明的一些方面提供的核酸或蛋白质进行了操作的经改造微生物。在一些实施方案中，提供了过表达根据本发明的一些方面为微生物赋予生产生物燃料或生物燃料前体所需和/或期望之表型的基因产物的经改造微生物。在一些实施方案中，提供了包含增加的SCD基因产物活性的微生物。在一些实施方案中，微生物表现出增加的脂肪酸合成率、增加的TAG储存和/或其它所需或期望性状。 在一些实施方案中，经改造微生物是产油酵母，例如解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，由本发明提供的经改造酵母表现出一个或更多个极理想和出乎意料的表型特性，例如增加的碳至油的转化(例如以接近理论值的比率)、强生长、持续的油生产、显著的生物质生产以及对碳源和相关物质增强的耐受。在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的经改造微生物(例如，经改造酵母)表现出约0.02g/g(所产生的油、脂质或TAG的克数/所消耗的葡萄糖的克数)至约0. 3g/g的碳至油转化率。在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的经改造微生物(例如经改造酵母)表现出以下碳至油转化率约0. 010g/g(所产生TAG的克数/所消耗的葡萄糖的克数)、约 0. 02g/g,约 0. 025g/g,约 0. 03g/g,约 0. 04g/g,约 0. 05g/g,约 0. 06g/g,约 0. 07g/g,约 0. 075g/g,约 0. 08g/g,约 0. 09g/g,约 0. lg/g,约 0. llg/g,约 0. 12g/g,约0. 13g/g,约 0. 14g/g,约 0. 15g/g,约 0. 16g/g,约 0. 17g/g,约 0. 18g/g,约 0. 19g/g,约 0. 2g/g,约 0. 21g/g,约 0. 22g/g,约 0. 23g/g,约 0. 24g/g,约 0. 25g/g,约 0. 26g/g,约 0. 27g/g,约0. 28g/g，约0. 29g/g或约0. 3g/g或者接近理论值。在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的经改造微生物(例如经改造酵母)表现出以下碳至油转化率至少约0. OlOg/g(所产生的TAG克数/所消耗的葡萄糖克数)、至少约0. 02g/g、至少约0. 025g/g、至少约0. 03g/g、至少约0. 04g/g、至少约0. 05g/g、至少约0. 06g/g、至少约0. 07g/g、至少约0. 075g/g、至少约 0. 08g/g、至少约 0. 09g/g、至少约 0. lg/g、至少约 0. llg/g、至少约 0. 12g/g、至少约0. 13g/g、至少约0. 14g/g、至少约0. 15g/g、至少约0. 16g/g、至少约0. 17g/g、至少约0. 18g/g、至少约0. 19g/g、至少约0. 2g/g、至少约0. 21g/g、至少约0. 22g/g、至少约0. 23g/g、至少约 0. 24g/g、至少约 0. 25g/g、至少约 0. 26g/g、至少约 0. 27g/g、至少约 0. 28g/g、至少约0. 29g/g或至少约0. 3g/g或接近理论值。在一些实施方案中，与野生型酵母相比，由本发明的一些方面提供的经改造酵母表现出增加为以下的生物质产生约2倍、约2. 5倍、约5倍、约7. 5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约32倍、约35倍或约40倍。在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的经改造酵母表现出对碳源和/或相关物质浓度的耐受为由野生型酵母所耐受的最高浓度的多至约150%、多至约175%、多至约200%、多至约225%、多至约250%、多至约275%、多至约300%、多至约325%、多至约350%、多至约375%、多至约400%或多至约500%。碳源相关物质的非限制性例子包括污染碳源的有毒物质，例如在预处理碳源期间产生或使用的物质(例如，酸性物质如乙酸类或氨)。
本文中所示出的数据确定了产油酵母中脂质积累的一个新的限速步骤，改造其使得经操作的微生物大大改进就从碳水化合物源(例如葡萄糖)生产生物燃料而言的特性。因此，由本发明提供的方法和生产是使用微生物(例如酵母)发酵从可再生碳水化合物源替代性地生成生物燃料的重大进步。用于生产生物燃料的微生物培养物本发明的一些方面涉及本文中所提供的或者根据本发明的一些方面改造的或者包含本文中所提供的分离的核酸或蛋白质的微生物培养物。在一些实施方案中，培养物包含本文中所提供的或者根据本发明的一些方面改造的或者包含来自本文列出的分离的核酸或蛋白质的微生物，以及培养基(例如液体培养基)。在一些实施方案中，培养物包含本文中所提供的或者根据本发明的一些方面改造的或者包含本文中所提供的分离的核酸或蛋白质的微生物，以及碳水化合物源。在一些实施方案中，培养物包含本文中所提供的或者根据本发明的一些方面改造的或者包含本文中所提供的分离的核酸或蛋白质的微生物，以及建立顺应微生物的存活、生长和或微生物中碳水化合物向生物燃料或生物燃料前体转化的盐度、渗透压和pH条件的盐和/或缓冲液。在一些实施方案中，培养物包含其它组分，例如添加剂。添加剂的非限制性实例是营养物、酶、氨基酸、白蛋白、生长因子、酶抑制剂(例如蛋白酶抑制剂)、脂肪酸、脂质、激素(例如地塞米松和赤霉素)、微量元素、无机化合物(例如还原剂如锰)、氧化还原调节剂(例如抗氧化剂)、稳定剂(例如二甲亚砜)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、抗生素(例如布雷菲德菌素A)、盐(例如NaCl)、螯合剂(例如EDTA、EGTA)和酶(例如纤维素酶、分散酶(dispase)、透明质酸酶或DNA酶)。在一些实施方案中，培养物可以包含诱导或抑制从条件性或诱导型启动子转录的药物，例如多西环素、四环素、他莫昔芬、IPTG、激素或金属离子。尽管具体培养条件(例如碳源的浓度)取决于各待培养的经改造微生物，但用于产生微生物培养物的一般方法和培养条件为本领域技术人员已知，并描述于例如以下中J. Sambrook和D. Russell,Molecular Cloning ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press ;第 3 版(January 15,2001) ；David C. Amberg, Daniel J. Burke 和Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics A Cold Spring Harbor LaboratoryCourse Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April 2005) ；John N. Abelson,Melvin I. Simon, Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology, Part A,第 194 卷(Methods in Enzymology Series,194), AcademicPress (March 11,2004) ；Christine Guthrie和Gerald R. Fink,Guide to Yeast Geneticsand Molecular and CEllBiology,Part B,第 350 卷(Methods in Enzymology, Vol 350),Academic Press ;第 I 板(July 2,2002)；以及 Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology Part C,第351 善,AcademicPress ;第I版(July 9，2002)，其全部通过引用并入本文。如本领域公知的，对于油生产，在适于油积累的条件下培养本文所述的经改造微生物培养物。在一些实施方案中，提供了显示超出相同类型的野生型微生物和/或超出其它微
生物(例如通常见于在碳源向生物燃料或生物燃料前体转化中污染微生物培养物的微生物)的生长优势的经改造微生物。例如，在一些实施方案中，提供了与相同类型的野生型微生物或其它微生物相比表现出增加的增殖速率和/或在对相同种类的野生型微生物和/或其它微生物有毒或限制生长或繁殖的条件下的增强的耐受或存活力。在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的经改造微生物的生长和/或增殖优势转化成使用未灭菌培养和发酵条件来生产生物燃料或生物燃料前体的可能性，因为这样缓解或完全取消了由污染微生物引起的培养物过度生长问题。在一些实施方案中，在未灭菌条件下培养由本发明的一些方面提供的经改造微生物以生产生物燃料或生物燃料前体。例如，在一些实施方案中，使用未灭菌原料、未灭菌培养基、未灭菌添加物或未灭菌生物反应器(例如未灭菌条件下的开放反应器)生产生物燃料或生物燃料前体。用于生产生物燃料的方法/原料/生物反应器本发明的一些方面涉及使用本发明的经修饰微生物生产生物燃料或生物燃料前体的方法。在一些实施方案中，提供了以工业规模生产生物燃料或生物燃料前体的方法。使用由本发明的一些方面提供的方法可以将多种碳源转化为生物燃料或生物燃料前体。糖、淀粉和纤维是适用于由本发明的一些方面提供的转化方法的碳水化合物源的非限制性例子。根据本发明的一些方面，碳水化合物源可以包含精炼和/或未精炼的糖、淀粉和/或纤维或者其任意组合。糖的非限制性例子是可发酵糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和乳糖。淀粉的非限制性例子是淀粉酶和支链淀粉。纤维的非限制性例子是植物纤维，如纤维素、半纤维素和木质纤维。本发明的一些方面涉及使用工业副产品、中间产物或废品(例如粗植物提取物、糖蜜、秸杆或污水)作为碳源。在一些实施方案中，碳源来自藻类。在一些实施方案中，特意产生藻类生物质以在微生物介导的生物燃料或生物燃料前体生产中用作碳源。在一些实施方案中，提供了用于生产生物燃料或生物燃料前体的方法，其包括使用廉价的、丰富的和易于得到的碳源原料作为碳源。在一些实施方案中，使用纤维素或半纤维作为碳源。在一些实施方案中，纤维素或半纤维素来自工业副产品或废品。在一些实施方案中，纤维素或半纤维素直接地来自植物或藻类生物质。植物或藻类生物质是最丰富的原料之一，并且包括大量不可发酵糖和纤维，例如纤维素和半纤维素。在一些实施方案中，预处理生物质原料以将不可发酵糖或纤维转化成可发酵糖，从而使其可用于微生物生长和微生物介导的生物燃料或生物燃料前体生产。在一些实施方案中，生物质原料的预处理包括使用本领域技术人员公知的预处理方法将纤维素和/或半纤维素组分解聚为单糖，所述预处理方法例如稀酸或氨纤维膨胀(AFEX)法(参见,例如Yang B,ffyman CE. Dilute acidand autohydrolysis pretreatment. Methods Mol Biol. 2009 ;581 :103—14 ;Balan V，BalsB， Chundawat SP, Marshall D， Dale BE， Lignocellulosic biomasspretreatment usingAFEXMethods Mol Biol. 2009 ；581 :61-77)。用于将生物质聚合物解聚为单糖的其它方法为本领域技术人员公知并考虑用于本发明的一些实施方案中。在一些实施方案中，使用稀酸法预处理包含不可发酵糖的生物质原料以将不可发酵糖解聚为可发酵单糖。在一些实施方案中，在适度温和的温度下用稀硫酸以确定的时间处理生物质。例如，在一些实施方案中，用约0. 5%、约1%、约2%、约3%、约4%、约5%或约6%的硫酸处理生物质。在一些实施方案中，在约30°C、约371、约401、约50°C、约60°C、约 70°C、约 80°C、约 90°C、约 100°C、约 110°C、约 120°C、约 130°C、约 140°C、约 150°C、约175°C、约200°C或多于约200°C下处理生物质。 在一些实施方案中，所得水解产物包含不溶性木质素和可溶性纤维素聚合物和半纤维素聚合物。可以通过本领域技术人员公知的方法(例如通过用纤维素酶或其它水解酶)处理来进一步处理后面的产物以产生己糖和戊糖如葡萄糖和木糖单体。在一些实施方案中，用稀酸预处理不可发酵糖导致产生包含有毒化合物的副产物，根据本发明的一些方面，其抑制未改造微生物的生长、降低其活力和/或抑制其生物燃料或生物燃料前体的生产。在一些实施方案中，洗涤经预处理的原料，补充支持微生物生长和生物燃料或生物燃料前体生产的培养基和/或加过量石灰以解毒。在一些实施方案中，使用AFEX法预处理包含不可发酵糖的生物质原料以使不可发酵糖解聚为可发酵单糖。在一些实施方案中，在高温和高压下用液氨以确定的时间处理生物质。在一些实施方案中，处理生物质约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟、约90分钟或更长。在一些实施方案中，在约30°C、约 37°C、约 40°C、约 50°C、约 60°C、约 70°C、约 80°C、约 90°C、约 100°C、约 110°C、约 120°C、约130°C、约140°C、约150°C、约175°C、约200°C或多于约200°C下处理生物质。在一些实施方案中，AFEX预处理导致包含于原料中的结晶纤维素转化为非定形的可发酵形式。在一些实施方案中，经AFEX预处理的生物质原料不包含大量抑制微生物生长和/或生物燃料或生物燃料前体生产的有毒副产物，并且使用之前无需为生产生物燃料或生物燃料前体而解毒。在一些实施方案中，用水解或解聚糖聚合物的酶(例如用纤维素酶或半纤维素酶)处理经预处理或未经预处理的生物质原料。在一些实施方案中，使原料与酶在液相中接触，并在使得酶催化解聚或水解反应的温度下孵育足以水解或解聚生物质原料中的显著量不可发酵糖或纤维的一段时间。在一些实施方案中，孵育以水解和解聚之后，通过例如离心将与酶接触的原料的液相(包含可溶性可发酵糖级分)与包含不可发酵糖和纤维的固相分离。在一些实施方案中，随后使原料的液体级分与用于转化为生物燃料或生物燃料前体的微生物(例如由本发明的一些方面提供的)接触。在一些实施方案中，不可发酵糖或纤维的酶促转化发生于联合的生物过程中，例如与所产生的可发酵糖向生物燃料或生物燃料前体的微生物转化在相同时间和/或相同反应器中。在一些实施方案中，先进行酶促转化，然后使与酶接触的原料与生产生物燃料或生物燃料前体的微生物接触。在一些实施方案中，在相同时间和在相同反应器中进行酶促和微生物转化。在一些实施方案中，以乙酸类作为主要碳源来培养本文中提供的经改造微生物，例如过表达SCD基因且任选地携带本文所述的其它修饰的解脂耶氏酵母。例如，在一些实施方案中，在浓度为以下的乙酸类溶液中培养微生物:约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%或约10%。在一些实施方案中，乙酸类浓度为约3% 10%。在一些实施方案中，以乙酸类作为主要碳源培养的包含如本文所提供的经改造微生物的细胞培养物与甘油接触或被掺入甘油。在一些实施方案中，使微生物与甘油间歇地接触。在一些实施方案中，使微生物与甘油连续地或半连续地接触。在一些实施方案中，微生物与浓度为约0. 5%、约1%、约2%、约3%、约4%或约5%的甘油接触。使本文所提供的经改造微生物与甘油接触为产生TAG提供了更需要代谢物，并且从碳水化合物生产脂肪酸所需的还原部分。在一些实施方案中，在使用除乙酸类以外的碳源(例如本文所述的任意碳源)进行生物燃料或生物燃料前体生产方法中掺入甘油。 在一些实施方案中，大规模的微生物介导的碳水化合物向脂质转化的发酵过程可以在生物反应器中进行。本文中替换使用的术语“生物反应器”和“发酵器”是指其中发生生物和/或化学反应(其至少部分涉及活生物或者活生物的部分)的封闭物(enclosure)或部分封闭物。“大规模生物反应器”或“工业规模生物反应器”是用于以商业或半商业规模生产产物(例如生物燃料或生物燃料前体例如脂肪酸和/或TAG)的生物反应器。大规模生物反应器的体积范围通常在数升、数百升、数千升或更大。根据本发明一些方面的生物反应器可以包含微生物或微生物培养物。在一些实施方案中，生物反应器可以包含例如由本发明的一些方面提供的任意分离的微生物的芽孢和/或任意种类的休眠细胞类型，例如呈干燥状态的。在一些实施方案中，向这样的生物反应器中添加合适的碳水化合物源可以引起休眠细胞的活化，例如酵母孢子的萌发和随后至少部分碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体。根据本发明一些方面的一些生物反应器可以包含细胞培养系统，其中微生物与移动液体和/或气泡接触。根据本发明的一些方面的微生物或微生物培养物可以在悬液中或者附着到固相载体上培养。载体系统的非限制性例子包括微载体(例如可以是多孔的或非多孔的聚合物球体、微珠和微盘)、具有特定化学基团(例如叔胺基)的交联珠(例如葡聚糖)、包含捕获于无孔聚合物纤维的细胞的2D微载体、3D微载体(例如，可以包含多孔纤维的载体纤维、空心纤维、多筒反应器和半渗透膜)、具有降低的离子交换能力的微载体、包封的细胞、毛细管和聚集体。载体可以由材料如葡聚糖、明胶、玻璃和纤维素制成。可以以连续、半连续或非连续模式进行根据本发明一些方面的工业规模的碳水化合物向脂质的转化过程。根据本发明的操作模式的非限制性例子是分批、补料分批、延伸分批(extended batch)、重复分批、抽/填、旋转壁、旋转瓶和/或灌注模式的操作。在一些实施方案中，可以使用允许从生物反应器连续或半连续补给底物原料(例如碳水化合物源)和/或连续或半连续分离产物(例如分泌脂质、包含脂质的有机相、和/或表现出所需脂质含量的细胞)的生物反应器。本发明生物反应器的非限制性例子是搅拌式发酵罐、通过旋转混合装置进行搅拌的生物反应器、恒化器、通过振摇装置进行搅拌的生物反应器、气升式发酵器、填充床反应器、固定床反应器、流化床生物反应器、利用波诱导型搅拌的生物反应器、离心式生物反应器、辊瓶和空心纤维生物反应器、辊装置(例如台式的、车载的和/自动种类的)、垂直堆叠盘、转瓶、搅拌或摇动瓶、振荡式多孔板、MD瓶、T瓶、Roux瓶、多表面组织培养培育器、改进的发酵器和包被的珠(例如，用血清蛋白、硝化纤维素或羧甲基纤维素包被以防止细胞粘附的珠)。根据本发明一些方面的生物反应器和发酵器可以任选地包含传感器和/或控制系统以测量和/或调节反应参数。反应参数的非限制性例子是生物参数例如生长速率、细胞大小、细胞数目、细胞密度、细胞类型或细胞状态；化学参数例如pH、氧化还原电位、反应底物和/或产物的浓度、溶解气体的浓度例如氧浓度和CO2浓度、营养物浓度、代谢物浓度、葡萄糖浓度、谷氨酰胺浓度、丙酮酸浓度、磷灰石浓度、寡聚肽浓度、氨基酸浓度、维生素浓度、激素浓度、添加剂浓度、血清浓度、离子强度、离子浓度、相对湿度、摩尔浓度、渗透压、其它化学品(例如缓冲剂、佐剂或反应副产物)的浓度；物理/化学参数，例如密度、传导率、搅拌程度、压力和流速、剪切应力、剪切速率、粘度、颜色、浊度、光吸收、混合速率、转化率以及热动力学参数，例如温度、光强/光质等。
能够测量本文所述的参数的传感器为力学和电学相关领域的技术人员所公知。基于从本文所述的传感器输入能够调节生物反应器中参数的控制系统为生物反应器工程领域的技术人员所公知。可以在合适的生物反应器中培养本发明一些方面所提供的多种不同微生物以根据本发明的一些方面进行大规模的碳水化合物向生物燃料或生物燃料前体转化，例如来自多种酵母(如产油酵母)、细菌、藻类和真菌源的微生物。酵母细胞的非限制性例子是来自以下的细胞解脂耶氏酵母、多形汉逊酵母(Hansenula poIymorpha)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、贝酵母(S. bayanus)、克鲁氏乳酸酵母(S. K. lactis)、Waltomyceslipofer. Mortierella alpine、Mortierella isabellina、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、鲁氏毛霉(Mucor rouxii)、皮状丝抱酵母(Trichosporon cutaneu)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、淀粉酶酵母(Saccharomyces diastasicus)、许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、酿酒酵母(S. cerevisiae)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。细菌的非限制性例子是枯草杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、链霉菌(Streptomyces)、突光假单抱菌(Pseudomonas fIuorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单抱菌属(Pseudomonas sp)、红球菌属(Rhodococcus sp)、链霉菌属(Streptomvces sp)和产喊菌属(Alcaligenes sp.)。可以从例如以下物种培养真菌细胞曲霉菌西肉萨米(Aspergillusshirousamii)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)和里氏木霉(Trichoderma reesei)。藻类细胞的非限制性例子是来自以下的细胞富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)、对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、微藻属(Nannochloropsis sp)、杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)、小球藻(Chlorella vulgaris)、浮水小球藻(Chlorellaemersonii)和极大螺方定藻(Spirulina maxima)。根据本发明一些方面转化为生物燃料或生物燃料前体的碳水化合物源的类型取决于所使用的特定微生物。由本发明的一些方面提供的一些微生物可以用于有效地转化特定碳水化合物源，而不同的碳水化合物源可能不能被相同的微生物高效处理或者根本不能处理。根据本发明的一些方面，产油酵母解脂耶氏酵母可以有效地将糖(如葡萄糖、果糖、蔗糖和/或乳糖)和糖含量较高的碳水化合物源(例如糖蜜)和植物纤维转化为脂肪酸及其衍生物。在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的微生物(例如产油酵母如解脂耶氏酵母)至少部分地分泌产生自碳源原料的生物燃料或生物燃料前体，例如脂肪酸或三酰甘油。在一些实施方案中，使本发明一些方面提供的微生物与碳水化合物源在反应器中的水性溶液中接触，并且所分泌的生物燃料或生物燃料前体形成可以与水相分离的有机相。本文所使用的术语有机相是指包含非极性有机化合物(例如脂肪酸、TAG和/或其它非极性脂质)的液相。本发明的有机相可以进一步包含微生物、碳水化合物或见于各生物反应 器中其它相中的其它化合物。用于工业规模的相分离的方法为本领域技术人员所公知。在一些实施方案中，有机相被连续地或半连续地吸除。在一些实施方案中，使用包含连续地或半连续地提取有机相的分离器的生物反应器。在一些实施方案中，生物燃料或生物燃料前体在根据本发明一些方面的细胞中积累。在一些实施方案中，通过例如离心、沉降或过滤从生物反应器中连续地或半连续地分离积累了期望量的生物燃料或生物燃料前体的细胞。可以例如基于细胞物理特性(如细胞大小或密度)的变化通过本领域技术人员公知的方法进一步进行的细胞分离。然后，可以使用本领域技术人员公知标准萃取方法(例如溶剂己烷萃取)从各细胞中萃取所积累的生物燃料或生物燃料前体。在一些实施方案中，收集微生物细胞并用3倍所收集细胞体积的己烷进行萃取。在一些实施方案中，进一步精炼所萃取的生物燃料或生物燃料前体。在一些实施方案中，使用本领域技术人员公知的方法(例如酯交换方法)将生物燃料前体(例如三酰甘油)转化为生物燃料(例如生物柴油)。本发明的这些和其它实施方案的功能和优点将从下列实施例变得更完全地理解。以下实施例意在解释本发明的益处，但并不代表本发明的全部范围。
实施例材料和方法基因构建体将各基因(例如，GLUT1、血红蛋白、细胞色素、丙酮酸羧化酶、S⑶等)克隆入质粒YLEX(图12)的位点PmlI和Kpn之间。所使用的限制性位点是PmlI和Kpnl。对所有cDNA进行测序并在基因组数据库中比对(mapped)。比对的所克隆cDNA的示例性有代表性的序列数据库条目包括GLUTl :基因ID 6513 ;血红蛋白粪透明颤菌(Vitreoscillastercoraria)细菌血红蛋白基因，ACCESSION L77863 ;细胞色素基因ID :1528, CYB5A细胞色素b5A型；丙酮酸羧化酶基因ID :5091 ;Sra硬脂酰辅酶A去饱和酶(SOT):基因ID 710155。可用于产生过表达微生物的代表性序列(例如编码序列)为，例如血红蛋白(细菌)
ATGTTAGACCAACAAACCGTAGACACCAGCAAAGCCACTGTTCCTGTATTGAAAGAGCATGGCGTGACCATTACCACGACGTTTTACCAAAATTTGTTTGCCAAACATCCTGAAGTACGACCTTTGTTTGACATGGGTCGCCAAGCATCTTTGGAACAGCCTAAGGCTTTGGCGATGACGGTTGGGGCGGCGGCACAAAACATTGAAAATTTACCTGCAATTTTGCCTGCAGTACAAAAAATTGCCGTCAAACATTGTCAAGCAGGCGTGGCGGCACGACATTATCCGATTGTGGGTCAAGAATTGTTGGGTGCGATTAAAGAATTATTGGGTGATGCGGCGACCGATGATATTTTGGATGCGTGGGGCAAGGCTTATGGCGTGATTGCCGATGTTTTTATTCAAGTGGAAGCGGATTTGTACGCTCAAGACGCTGAATAA (SEQ ID NO :3)细胞色素B(耶氏酵母)ATGATCATCAACGGCAAGGTCTACGACATCTCCAGCTTCGTTGACGAGCATCCCGGTGGAGAGGAGGTTCTTCTTGATGCCGGTGGAACTGAGGCCACCAACGCTTTCGACGACGTTGGACACTCTGAGGACGCTTACGGCATCCTTAACGACCTCTATGTCGGTGAGGTTGACCCCAGCGAGGACGTTATCCGAAAGACTCACACTGTCAAGACTTCTTACGAGGACGGCGAGTCTGTTGGTGATGACCACGGATCTTCTTCCATGATCTTCCTCATTGTTGCTGCTGCTGTTGCCGCCGCTGCTTTCTTCTACCTCCAGGGTCAGAAATAA(SEQ ID NO :4)GLUT(大鼠)ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGGTGACGGGCCGCCTTATGTTGGCCGTGGGAGGGGCAGTGCTCGGATCCCTGCAGTTCGGCTATAACACCGGTGTCATCAACGCCCCCCAGAAGGTAATTGAGGAGTTCTACAATCAAACATGGAACCACCGCTATGGAGAGTCCATCCCATCCACCACACTCACCACACTCTGGTCTCTCTCCGTGGCCATCTTCTCTGTCGGGGGCATGATTGGTTCCTTCTCTGTGGGCCTCTTTGTTAATCGCTTTGGCAGGCGGAACTCCATGCTGATGATGAACCTGTTGGCCTTTGTGTCTGCCGTGCTTATGGGTTTCTCCAAACTGGGCAAGTCCTTTGAGATGCTGATCCTGGGCCGCTTCATCATTGGAGTGTACTGTGGCCTGACCACCGGCTTTGTGCCCATGTATGTGGGGGAGGTGTCACCCACAGCTCTTCGTGGAGCCCTGGGCACCCTGCACCAGCTGGGCATCGTCGTTGGGATCCTTATTGCCCAGGTGTTCGGCTTAGACTCCATCATGGGCAATGCAGACTTGTGGCCTCTACTGCTCAGTGTCATCTT CATCCCAGCCCTGCTACAGTGTATCCTGTTGCCCTTCTGCCCTGAGAGCCCCCGCTTCCTGCTCATCAATCGTAACGAGGAGA ACCGGGCCAAGAGTGTGCTGAAAAAGCTTCGAGGGACAGCCGATGTGACCCGAGACCTGCAGGAGATGAAAGAAGAGGGTCGG
权利要求
1.分离的产油细胞，其包含 提闻选自以下的一种或更多种基因的表达的遗传修饰血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶、ACC、SCD、FAAU ACS, ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY, FAS、酰基辅酶 A 合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因，和/或 降低JNK2和/或Λ-12去饱和酶的表达的遗传修饰。
2.权利要求I所述的分离的产油细胞，其中所述遗传修饰包括提高或降低所述基因产物的表达的核酸构建体，所述核酸构建体包含 (a)包含在合适的同源或异源启动子的控制下编码所述基因产物的核酸的表达盒， (b)包含在异源启动子的控制下编码靶向所述基因产物之干扰RNA的核酸的表达盒，和/或 (c)在插入所述细胞的基因组时调节所述基因产物的表达水平的核酸序列。
3.权利要求2所述的分离的产油细胞，其中所述异源启动子是诱导型或组成型启动子。
4.权利要求2所述的分离的产油细胞，其中所述核酸构建体抑制或破坏编码所述基因产物的天然基因的天然调节，导致所述天然基因的过表达。
5.权利要求2所述的分离的产油细胞，其中所述核酸构建体抑制或消除所述天然基因的表达。
6.权利要求4或5所述的分离的产油细胞， 其中通过缺失、破坏、突变和/或替换调节所述基因表达的调节区或调节区的一部分来介导对所述天然基因的天然调节的抑制或破坏，或者 其中通过缺失、破坏、突变和/或替换所述天然基因的编码序列或调节所述天然基因表达的调节区或调节区的一部分来介导对天然基因表达的抑制或消除。
7.权利要求I至6中任一项所述的分离的产油细胞，其中通过组成型或诱导型表达靶向JNK2和/或Λ-12去饱和酶基因产物且抑制所述基因表达的核酸来介导对JNK2和/或Λ-12去饱和酶表达的降低。
8.权利要求7所述的分离的产油细胞，其中所述基因产物是转录本，以及靶向JNK2和/或Λ -12去饱和酶转录本的所述核酸通过RNAi途径抑制所述转录本的表达。
9.权利要求8所述的分离的产油细胞，其中靶向JNK2和/或△-12去饱和酶转录本的所述核酸是 siRNA、shRNA 或 micro RNA。
10.权利要求3至9所述的分离的产油细胞，其中所述核酸构建体插入所述细胞的基因组中。
11.权利要求I至10中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述基因产物表达的提高或降低赋予所述细胞将碳水化合物源转化为脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油(TAG)的有利表型。
12.权利要求11所述的分离的产油细胞，其中所述有利表型是改变的脂肪酸谱、改变的TAG谱、增加的脂肪酸和/或三酰甘油合成率、增加的转化产率、增加的三酰甘油在细胞中积累和对渗透压增强的耐受、增加的增殖速率、增加的细胞体积和/或增强的细胞对对于相同细胞类型的未经修饰细胞而言致死和/或抑制其增殖的浓度的物质的耐受。
13.权利要求12所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞改变的脂肪酸谱或改变的TAG谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少2倍。
14.权利要求12所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞改变的脂肪酸谱或改变的TAG谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少2. 5倍。
15.权利要求12所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞改变的脂肪酸谱或改变的TAG谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少5倍。
16.权利要求12所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞改变的脂肪酸谱或改变的TAG谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少6. 5倍。
17.权利要求12至16中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞在对未经修饰细胞致死的渗透压条件下存活。
18.权利要求12至16中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞在渗透压水平为未经修饰细胞所耐受最高水平的200%的条件下存活。
19.权利要求12至16中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞在渗透压水平为未经修饰细胞所耐受最高水平的300%的条件下存活。
20.权利要求12至16中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞在渗透压水平为未经修饰细胞所耐受最高水平的400%的条件下存活。
21.权利要求12至20中任一项所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞的增殖速率增加为至少5倍。
22.权利要求12至20中任一项所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞的增殖速率增加为至少10倍。
23.权利要求12至20中任一项所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞的增殖速率增加为至少20倍。
24.权利要求12至20中任一项所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞的增殖速率增加为至少25倍。
25.权利要求12至20中任一项所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞的增殖速率增加为至少30倍。
26.权利要求12至25中任一项所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞的体积增加为至少2倍。
27.权利要求12至26中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞耐受致死相同细胞类型的未经修饰细胞和/或抑制其增殖的浓度的物质。
28.权利要求27所述的分离的产油细胞，其中所述物质是可发酵糖，以及所述浓度为至少80g/l。
29.权利要求27所述的分离的产油细胞，其中所述物质是可发酵糖，以及所述浓度为至少 100g/l。
30.权利要求27所述的分离的产油细胞，其中所述物质是可发酵糖，以及所述浓度为至少 150g/l。
31.权利要求27所述的分离的产油细胞，其中所述物质是可发酵糖，以及所述浓度为至少 200g/l。
32.权利要求27所述的分离的产油细胞，其中所述物质是可发酵糖，以及所述浓度为至少 300g/l。
33.权利要求12至32中任一项所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞的脂肪酸或TAG合成率增加为至少5倍。
34.权利要求12至33中任一项所述的分离的产油细胞，其中与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，所述细胞的脂肪酸或TAG合成率增加为至少10倍。
35.权利要求12至34中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞以约0.025g/g至约0. 3g/g(产生的TAG的克数/消耗葡萄糖的克数)的转化率将碳水化合物源转化为脂肪酸或TAG。
36.权利要求12至34中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞以至少约0.2g/g的转化率将碳水化合物源转化为脂肪酸或TAG。
37.权利要求12至34中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞以至少约0.3g/g的转化率将碳水化合物源转化为脂肪酸或TAG。
38.权利要求I至37中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。
39.权利要求I至38中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞是细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。
40.权利要求I至39中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞是产油酵母细胞。
41.权利要求I至40中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述细胞是解脂耶氏酵母(Y. Iipolytica)细胞。
42.培养物，其包含权利要求I至41或138中任一项所述的产油细胞。
43.培养物，其包含分离的产油细胞和碳水化合物源， 所述分离的产油细胞包含提高选自血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶、ACC、S⑶、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基辅酶A合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因中一种或更多种基因的表达的遗传修饰，和/或降低JNK2和/或A-12去饱和酶基因产物的表达的遗传修饰。
44.权利要求42或43所述的培养物，其中所述碳水化合物源是可发酵糖。
45.权利要求42至44中任一项所述的培养物，其中所述碳水化合物源是单糖。
46.权利要求42至45中任一项所述的培养物，其中所述碳水化合物源是葡萄糖和/或甘油。
47.权利要求42至46中任一项所述的培养物，其中所述碳水化合物源未灭菌。
48.权利要求42至47中任一项所述的培养物，其中所述培养物保持在未灭菌条件下。
49.权利要求42至48中任一项所述的培养物，其中所述培养物不包含对所述分离的产油细胞有选择性的抗生素或抗增殖剂。
50.权利要求42至49中任一项所述的培养物，其中所述碳水化合物源来自植物或藻类生物质。
51.权利要求42至50中任一项所述的培养物，其中所述碳水化合物源来自纤维素、半纤维素、淀粉、甘油或其衍生物。
52.权利要求50或51所述的培养物，其还包含纤维素水解酶或半纤维素水解酶。
53.权利要求50至52中任一项所述的培养物，其中所述生物质或所述纤维素或半纤维素在热水或稀酸或氨纤维膨胀处理中预处理，用水解酶预处理，通过蒸汽预处理和/或石灰预处理。
54.权利要求42至53中任一项所述的培养物，其中所述培养物包含对与所述分离的产油细胞相同细胞类型的未经修饰的野生型未经修饰细胞为致死浓度的物质。
55.权利要求54所述的培养物，其中所述物质是在预处理所述碳水化合物源如乙酸类、糠醛或芳族化合物期间产生的有毒物质。
56.权利要求54或55所述的培养物，其中所述物质是所述碳水化合物源。
57.权利要求54至56中任一项所述的培养物，其中所述物质是可发酵糖。
58.权利要求54至57中任一项所述的培养物，其中所述物质是单糖。
59.权利要求44至58中任一项所述的培养物，其中所述培养物包含浓度为至少80g/l的所述可发酵糖。
60.权利要求44至59中任一项所述的培养物，其中所述培养物包含浓度为至少IOOg/I的所述可发酵糖。
61.权利要求44至60中任一项所述的培养物，其中所述培养物包含浓度为至少150g/I的所述可发酵糖。
62.权利要求44至61中任一项所述的培养物，其中所述培养物包含浓度为至少200g/I的所述可发酵糖。
63.权利要求44至62中任一项所述的培养物，其中所述培养物包含浓度为至少250g/I的所述可发酵糖。
64.权利要求44至64中任一项所述的培养物，其中所述培养物包含浓度为至少300g/I的所述可发酵糖。
65.—种方法,其包括 使碳水化合物源与分离的产油细胞接触，所述细胞包含 提闻选自以下的一种或更多种基因的表达的遗传修饰血红 蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶、ACC、SCD、FAAl、ACS、 ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基辅酶 A 合成 酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因产物，和/或 降低JNK2和/或A-12去饱和酶基因的表达的遗传修饰；和 在适于由所述细胞至少部分地将所述碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油的条件下孵育与所述细胞接触的所述碳水化合物源。
66.权利要求65所述的方法，其中所述分离的产油细胞是权利要求I至41中任一项所述的分离的产油细胞。
67.权利要求65或66所述的方法，其中所述碳水化合物源是可发酵糖如葡萄糖或木糖或来自植物或藻类生物质的碳水化合物淀粉。
68.权利要求65至67中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物源来自纤维素或半纤维素。
69.权利要求65至68中任一项所述的方法，其中在纤维素水解酶或半纤维素水解酶的存在下，使所述碳水化合物源与所述细胞接触。
70.权利要求65至69中任一项所述的方法，其中在每克生物质约15IU纤维素水解酶或半纤维水解酶的存在下，使所述碳水化合物源与所述细胞于55°C接触48小时。
71.权利要求67至70中任一项所述的方法，其中用热水或稀酸或氨纤维膨胀处理和/或水解酶预处理所述生物质或所述纤维素或半纤维素。
72.权利要求65至71中任一项所述的方法，其中与所述分离的产油细胞接触的所述碳水化合物源包含对与所述分离的产油细胞相同细胞类型的未经修饰细胞为致死浓度的物质。
73.权利要求72所述的方法，其中所述物质是在预处理所述碳水化合物源如乙酸类、糠醛或芳族化合物期间产生的有毒物质。
74.权利要求72所述的方法，其中所述物质是所述碳水化合物源。
75.权利要求74所述的方法，其中所述碳水化合物源是可发酵糖，以及与所述产油细胞接触后所述可发酵糖的浓度为至少80g/l。
76.权利要求74所述的方法，其中所述碳水化合物源是可发酵糖，以及与所述产油细胞接触后所述可发酵糖的浓度为至少80g/l。
77.权利要求74所述的方法，其中所述碳水化合物源是可发酵糖，以及与所述产油细胞接触后所述可发酵糖的浓度为至少100g/l。
78.权利要求74所述的方法，其中所述碳水化合物源是可发酵糖，以及与所述产油细胞接触后所述可发酵糖的浓度为至少200g/l。
79.权利要求74所述的方法，其中所述碳水化合物源是可发酵糖，以及与所述产油细胞接触后所述可发酵糖的浓度为至少300g/l。
80.权利要求65至79中任一项所述的方法，其中在未灭菌条件下使所述碳水化合物源与所述分离的产油细胞接触。
81.权利要求65至80中任一项所述的方法,其中在未灭菌条件下孵育与所述分离的产油细胞接触的所述碳水化合物源。
82.权利要求65至81中任一项所述的方法，其中在开放反应器中孵育与所述分离的产油细胞接触的所述碳水化合物源。
83.权利要求65至82中任一项所述的方法，其中在补料分批过程中使所述碳水化合物源与所述分离的产油细胞接触并孵育以将所述碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油。
84.权利要求65至82中任一项所述的方法，其中在连续过程中使所述碳水化合物源与所述分离的产油细胞接触并孵育以将所述碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油。
85.权利要求65至84中任一项所述的方法，其中通过溶剂萃取从与所述分离的产油细胞接触的所述碳水化合物源萃取所述脂肪酸或所述三酰甘油。
86.权利要求85所述的方法，其中所述溶剂萃取是己烷萃取。
87.权利要求65至86中任一项所述的方法，其中将所述脂肪酸或所述三酰甘油从与所述分离的产油细胞接触的所述碳水化合物源中分离，然后通过酯交换反应精炼。
88.—种方法,其包括 通过提高细胞中选自以下的一种或更多种基因产物的表达血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶、ACC、SCD、FAAI、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基辅酶 A 合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因产物，和/或 降低所述细胞中JNK2和/或A-12去饱和酶基因的表达 来改变所述细胞中的脂肪酸谱、三酰甘油谱、脂肪酸合成率、三酰甘油合成率、脂肪酸衍生物的积累程度、脂肪酸衍生物的分泌率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的有效产率、对渗透压的耐受、增殖速率、细胞体积或细胞对将碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油的有毒物质的耐受。
89.权利要求88所述的方法，其中改变所述脂肪酸谱、所述三酰甘油谱、所述脂肪酸合成率、所述三酰甘油合成率、细胞中所述脂肪酸衍生物的积累程度或细胞的所述脂肪酸衍生物的分泌率是增加由细胞合成、积累或分泌的脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的量。
90.权利要求88或89所述的方法，其中改变所述细胞将碳水化合物转化为脂肪酸或脂肪酸衍生物的效率是将转化效率增加为至少2倍。
91.权利要求88或89所述的方法，其中改变所述细胞将碳水化合物转化为脂肪酸或脂肪酸衍生物的效率是将转化效率增加为至少3倍。
92.权利要求88或89所述的方法，其中改变所述细胞将碳水化合物转化为脂肪酸或脂肪酸衍生物的效率是将转化效率增加为至少4倍。
93.权利要求88或89所述的方法，其中改变所述细胞将碳水化合物转化为脂肪酸或脂肪酸衍生物的效率是将转化效率增加为至少5倍。
94.权利要求88至93中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸衍生物是三酰甘油。
95.权利要求88至94中任一项所述的方法，其中改变所述细胞对渗透压的耐受或对有毒物质的耐受是赋予对相同细胞类型的未经修饰细胞为致死水平的渗透压或有毒物质的耐受。
96.权利要求88至95中任一项所述的方法，其中改变所述增殖速率是将所述增殖速率增加为至少2倍。
97.权利要求88至95中任一项所述的方法，其中改变所述增殖速率是将所述增殖速率增加为至少5倍。
98.权利要求88至95中任一项所述的方法，其中改变所述增殖速率是将所述增殖速率增加为至少10倍。
99.权利要求88至95中任一项所述的方法，其中改变所述增殖速率是将所述增殖速率增加为至少20倍。
100.权利要求88至95中任一项所述的方法，其中改变所述增殖速率是将所述增殖速率增加为至少30倍。
101.权利要求88至100中任一项所述的方法，其中改变所述细胞体积是将所述细胞体积增加为至少2倍。
102.权利要求88至101中任一项所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞。
103.权利要求102所述的方法，其中所述酵母是产油酵母。
104.权利要求103所述的方法，其中所述产油酵母是解脂耶氏酵母。
105.分离的核酸分子，其包含a)编码SEQID NO :1 (解脂耶氏酵母SCD)的核苷酸序列，或 b)与a)的核苷酸序列有至少85%同一丨丨生的核苷酸序列。
106.权利要求105所述的分离的核酸分子，其中编码SEQID NO :1的所述核苷酸序列是 SEQ ID NO :2。
107.权利要求105所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQID NO:2的核苷酸序列有至少85%的同一性。
108.权利要求107所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列与SEQID NO :2的核苷酸序列有至少90%的同一性。
109.权利要求108所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列与SEQID NO :2的核苷酸序列有至少95%的同一性。
110.权利要求108所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列与SEQID NO :2的核苷酸序列有至少97. 5%的同一性。
111.权利要求108所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列与SEQID NO :2的核苷酸序列有至少99%的同一性。
112.表达盒，其包含权利要求105至111中任一项所述的分离的核酸分子和异源的分尚的启动子。
113.权利要求112所述的表达盒，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
114.权利要求113所述的表达盒，其中所述组成型启动子是翻译延伸因子(TEF)启动子。
115.权利要求113所述的表达盒，其中所述诱导型启动子是药物诱导型启动子。
116.表达盒,其包含权利要求105至111中任一项所述的分离的核酸分子。
117.权利要求116所述的表达盒，其还包含经修饰S⑶启动子。
118.权利要求117所述的表达盒，其中所述修饰是完全或部分缺失和/或突变野生型SCD启动子序列，导致对所述SCD启动子应答于高水平脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的反馈抑制的破坏。
119.权利要求117所述的表达盒，其中所述修饰是将异源序列插入野生型SCD启动子区，任选地结合完全或部分缺失和/或突变野生型SCD启动子序列，导致对所述SCD启动子应答于高水平脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的反馈抑制的破坏。
120.载体，其包含权利要求112至119中任一项所述的表达盒。
121.细胞，其包含权利要求112至119中任一项所述的表达盒或权利要求120所述载体的至少一部分。
122.权利要求43所述的培养物，其中所述碳水化合物源是乙酸类。
123.权利要求122所述的培养物，其中所述乙酸类的浓度为至少I%。
124.权利要求122所述的培养物，其中所述乙酸类的浓度为至少2%。
125.权利要求122所述的培养物，其中所述乙酸类的浓度为至少3%。
126.权利要求122所述的培养物，其中所述乙酸类的浓度为至少4%。
127.权利要求122所述的培养物，其中所述乙酸类的浓度为至少5%。
128.权利要求122至127中任一项所述的培养物，其中所述培养物还包含甘油。
129.权利要求128所述的培养物，其中所述甘油的浓度为2%。
130.权利要求65至74中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物源是乙酸类。
131.权利要求131所述的方法，其中所述乙酸类的浓度为至少I%。
132.权利要求131所述的方法，其中所述乙酸类的浓度为至少2%。
133.权利要求131所述的方法，其中所述乙酸类的浓度为至少3%。
134.权利要求131所述的方法，其中所述乙酸类的浓度为至少4%。
135.权利要求131所述的方法，其中所述乙酸类的浓度为至少5%。
136.权利要求131至135中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述细胞与甘油接触。
137.权利要求136所述的方法，其中所述方法包括使所述细胞与浓度为约2%的甘油接触。
138.权利要求I至40中任一项所述的分离的产油细胞，其中所述降低JNK2和/或A-12去饱和酶表达的遗传修饰是基因破坏，任选地为完全或部分基因缺失。
全文摘要
本发明的一些方面涉及用于使用经改造微生物将碳源转化为生物燃料或生物燃料前体的方法。本发明的一些方面涉及发现微生物中脂质代谢的关键调节因子。本发明的一些方面涉及用于生产生物燃料或生物燃料前体的经改造微生物。
文档编号C12N1/12GK102869768SQ201180022036
公开日2013年1月9日 申请日期2011年3月2日 优先权日2010年3月2日
发明者格里戈里·斯特凡诺普洛斯, 赛义德·侯赛因·伊马姆·阿比迪 申请人:麻省理工学院