一种从河流水体快速筛选异养型氨氧化微生物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从河流水体快速筛选异养型氨氧化微生物的方法。a、取河流表层水体，经过隔除和沉淀后，再用灭菌的0.22微米滤膜抽滤，滤膜放入瓶中进行预培养，培养基为抽滤后的河水或者人工培养液，培养温度为25～35℃，振荡培养3～4天，维持pH值6～7，溶解氧高于2mg/L，得到预培养液；b、从预培养液取出液体，分离纯化富集培养液体中的微生物；c、异养氨氧化活性实验：采用专性液体培养基对步骤（b）分离纯化富集培养的微生物进行氨氮降解活性测定，挑选在培养2-3天后氨氮降解效率60%以上的微生物，由此得到高效菌株；d、对步骤（c）获得的高效菌株进行再分离纯化富集培养，由此得到异养型氨氧化微生物。
【专利说明】一种从河流水体快速筛选异养型氨氧化微生物的方法
【技术领域】:
[0001]本发明属于环保【技术领域】，具体涉及一种从河流水体筛选异养氨氧化微生物的方法。
【背景技术】:
[0002] 氮元素循环是地球元素循环的主要途径之一。当含氮污染物被分解后，将进入氮循环的第一步核心环节:氨氧化过程。传统理论认为氨氧化过程主要由自养型微生物驱动，有机物的存在将严重抑制该过程的进行，导致河流氮污染情况的加剧。近年来，随着人们对湖泊氮循环系统的深入研究，逐渐认识到自养型好氧氨氧化过程并不是唯一驱动氨氧化的途径。异养型氨氧化可以实现有机物降解与氨氧化的同时发生，因此在河流碳氮污染非常普遍的今天显得尤其重要。异养型氨氧化的基本原理是异养型氨氧化微生物在好氧条件下同时转化氨氮、有机物为氮气与二氧化碳等，以达到同时降解河流中氨氮与有机物的功能，与传统的自养型生物脱氮技术相比具有节能降耗和环境友好等突出优点。
[0003]由于以往对河流异养氨氧化过程的忽视，导致其微生物功能大大被低估。应用异养氨氧化技术的一个关键前提就是研发筛选方法。从自然界河流等水体筛选的土著异养氨氧化微生物具有安全性、环境友好性与经济性的优点。但是由于自然界水体微生物众多，因此需要一个转性的筛选过程以达到快速筛选异养型氨氧化微生物的目的。
【发明内容】
:
[0004]本发明的目的是提供一种快速、大量从自然水体获取异养型氨氧化微生物的从河流水体快速筛选异养型氨氧化微生物的方法。
[0005]本发明的从河流水体快速筛选异养型氨氧化微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006]a、取河流表层水体，经过隔除和沉淀后，再用灭菌的0.22微米滤膜抽滤，滤膜放入瓶中进行预培养，培养基为抽滤后的河水或者人工培养液，培养温度为25~35°C，振荡培养3~4天，维持pH值6~7，溶解氧高于2mg/L，得到预培养液；所述的人工培养液，其碳氮比20~30:1，碳源为葡萄糖、乙酸、柠檬酸、乳酸、蔗糖、丙酸和甲酸中的一种或数种的组合物；
[0007]b、从预培养液取出液体，分离纯化富集培养液体中的微生物；
[0008]C、异养氨氧化活性实验:采用专性液体培养基对步骤(b)分离纯化富集培养的微生物进行氨氮降解活性测定，挑选在培养2-3天后氨氮降解效率60%以上的微生物，由此得到高效菌株；
[0009]d、对步骤(C)获得的高效菌株进行再分离纯化富集培养，由此得到异养型氨氧化微生物。
[0010]所述的步骤(a)人工培养液优选为Ml液体培养基，其每升在IL抽滤灭菌后河水中加入NH4Cl 0.1g,葡萄糖0.5g、乙酸钠0.5、乳酸钠0.25、柠檬酸钠0.25g、蔗糖0.25g，COD控制在500mg/L，pH6-7之间。
[0011]所述的步骤(c)的专性液体培养基为M3液体培养基，其每升是这么配制的:在IL 水中加入 NH4Cl 0.lg，葡萄糖 0.5g，NaHCO3 0.2g, KH2PO4 0.lg，CaCl2.2H20 0.04g,MgSO4.7H20 0.0.82g, KCl 0.04g, NaCl 0.04g,再用 NaHCO3 调节 pH 到 7 左右。
[0012]所述的步骤(b)和步骤(c)的分离纯化富集培养，其具体步骤优选为:采用稀释法对微生物稀释后，涂平板进行分离，涂布平板的营养培养基为M2固体培养基，经培养后，采用平板划线分离，划线平板的营养培养基为Ml固体培养基，再经培养后，完成对微生物的分离纯化富集培养；
[0013]所述的Ml固体液体培养基，每升是这么配制的:在IL抽滤灭菌后河水中加入NH4Cl 0.lg、葡萄糖0.5g、乙酸钠0.5、乳酸钠0.25、柠檬酸钠0.25g、蔗糖0.25g和琼脂20g，COD 控制在 500mg/L，pH6_7 之间；[0014]所述的M2固体培养基，每升是这么配制的:在IL水中加入NH4Cl 0.lg，葡萄糖0.5g, NaHCO3 0.2g, KH2PO4 0.lg, CaCl2.2H20 0.04g、MgSO4.7H20 0.0.82g 和琼脂 20g。
[0015]所述的氨氮降解活性测定优选为:以步骤(b)的微生物作为受试菌体，在试管中按体积加入1%受试菌体，加入灭菌后的M3液体培养基，管口加上九层纱布或透气棉筛，培养条件为25°C，pH7，溶解氧不低于2mg/L，摇床转速150rpm条件下培养，测定COD、TOC与氨氮降解率，挑选在培养2-3天后氨氮降解效率60%以上的微生物；
[0016]所述的M3液体培养基每升是这么配制的:在IL水中加入NH4Cl 0.lg，葡萄糖0.5g, NaHCO3 0.2g, KH2PO4 0.lg, CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.0.82g, KCl 0.04g 和NaCl 0.04g,再用 NaHCO3 调节 pH 到 7。
[0017]本发明的从河流水体快速筛选异养型氨氧化微生物的方法具有以下优势:(I)可以快速、大量从自然水体获取异养型氨氧化微生物；(2)所获取的异养型氨氧化微生物能同时降解有机物与水体氨氮，无需曝气；(3)所获的异养型氨氧化微生物来源于自然水体，具有安全性、环境友好性与经济性的优点。
【具体实施方式】:
[0018]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0019]实施例1:
[0020]在东江河源段获取表层水5L，经过常规的隔除，沉淀前处理后，采用灭菌后的
0.22微米滤膜抽滤500ml河水，将河水中悬浮微生物收集于滤膜中，用镊子将滤膜放入500ml锥形瓶进行震荡培养，培养基为Ml液体培养基，COD为500mg/L、氨氮浓度为25mg/L0设定培养温度为25°C，用碳酸氢钠调节维持PH6-7之间，溶解氧不低于2mg/L，摇床转速150rpm，震荡培养时间4天，观察培养基浑浊后停止培养，得到预培养液。此过程逐渐采用氨氮与有机物胁迫，让异养型氨氧化微生物逐步成为悬浮体系的主体，加快富集的时间。
[0021](2)从预培养液中取IOml溶液，采用稀释法将预培养液稀释至到10_5比例，涂平板进行分离，涂布平板的营养培养基为M2固体培养基，25°C培养2天后，采用平板划线分离，划线平板的营养培养基为Ml固体培养基，进行2天富集培养后，所得菌种进行下一步异养氨氧化活性实验，测定其活性。
[0022](3)异养氨氧化活性实验:对步骤(2)所分离富集培养后的菌种进行异养型氨氧化活性测定,在试管中按体积加入1%受试菌体,加入灭菌后的M3液体培养基，管口加上九层纱布或透气棉筛，培养条件为25°C，pH7，溶解氧不低于2mg/L，摇床转速150rpm条件下培养48小时，测定COD、TOC与氨氮降解率，氨氮降解率超过80%以上，为具有异养氨氧化活性，由此得到高效菌株。
[0023](4)对步骤(3)所获得的高效菌株进一步纯化，纯化方法为:采用稀释法将高效菌株菌落稀释后，涂平板进行分离，涂布平板的营养培养基为M2固体培养基，25°C培养2天后，采用平板划线分离，划线平板的营养培养基为Ml固体培养基，进行2天富集培养后，由此获得异养型氨氧化菌株45株,其中30株氨氮降解率为80%以上。一般认为微生物同化氮利用率不超过30%，因此可以见所筛选的菌株均有较强的异养氨氧化能力。
[0024]Ml液体培养基，每升是这么配制的:在IL抽滤灭菌后河水中加入NH4Cl 0.lg，加入葡萄糖0.5g、乙酸钠0.5、乳酸钠0.25、柠檬酸钠0.25g、蔗糖0.25g组成的混合碳源，COD控制在500mg/L左右，pH6-7之间，灭菌备用。Ml固体培养基是在Ml液体培养基中加入琼脂 20g。
[0025]M2固体培养基，每升是这么配制的:在IL水中加入NH4Cl 0.lg，葡萄糖0.5g，NaHCO3 0.2g, KH2PO4 0.lg, CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.0.82g 和琼脂 20g，灭菌备用。
[0026]M3液体培养基，每升是这么配制的:在IL水中加入NH4Cl 0.lg，葡萄糖0.5g，NaHCO3 0.2g, KH2PO4 0.lg, CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.0.82g, KCl 0.04g, NaCl
0.04g，再用NaHCO3调节pH到7左右，灭菌备用。
[0027]实施例2:
[0028]在东江新丰江段获取表层水2L，经过常规的隔除，沉淀前处理后，采用灭菌后的
0.22微米滤膜抽滤500ml河水，由于该处水体较为洁净，实测氨氮为0.14mg/L, COD小于20mg/L，因此采用较大体积水体进行过滤富集，然后将河水中悬浮微生物收集于滤膜中，用镊子将滤膜放入500ml锥形瓶进行震荡培养，培养基为Ml液体培养基，COD为500mg/L、氨氮浓度为25mg/L。设定培养温度为35°C，用碳酸氢钠调节维持pH6_7之间，溶解氧不低于2mg/L，摇床转速150rpm，震荡培养时间3天，观察培养基浑浊后停止培养，得到预培养液。此过程逐渐采用氨氮与有机物胁迫，让异养型氨氧化微生物逐步成为悬浮体系的主体，加快富集的时间。
[0029](2)从预培养液中取20ml溶液，采用稀释法将培养菌液稀释至到10_4比例，涂平板进行分离，涂布平板的营养培养基为M2固体培养基，25°C培养2天后，采用平板划线分离，划线平板的营养培养基为Ml固体培养基，进行2天富集培养后，所得菌种进行下一步异养氨氧化活性实验，测定其活性。
[0030](3)异养氨氧化活性实验:对步骤(2)所分离的菌种进行异养型氨氧化活性测定，在试管中按体积加入1%受试菌体，加入灭菌后的M3液体培养基，管口加上九层纱布或透气棉筛，培养条件为25°C，pH7，溶解氧不低于2mg/L，摇床转速150rpm条件下培养72小时，测定COD、TOC与氨氮降解率，挑选氨氮降解率超过70%以上的微生物，为具有异养氨氧化活性，由此得到高效菌株。
[0031] (4)对步骤(3)所获得的高效菌株菌落进一步纯化，纯化方法为:采用稀释法将高效菌株菌落稀释后，涂平板进行分离，涂布平板的营养培养基为M2固体培养基，25°C培养2天后，采用平板划线分离，划线平板的营养培养基为Ml固体培养基，进行2天富集培养后，由此获得异养型氨氧化菌株53株,其中39株氨氮降解率为80%以上。一般认为微生物同化氮利用率不超过30%，因此可以见所筛选的菌株均有较强的异养氨氧化能力。
[0032]所述的Ml液体 培养基、Ml固体培养基、M2固体培养基和M3液体培养基同实施例1o
【权利要求】
1.一种从河流水体快速筛选异养型氨氧化微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤: a、取河流表层水体，经过隔除和沉淀后，再用灭菌的0.22微米滤膜抽滤，滤膜放入瓶中进行预培养，培养基为抽滤后的河水或者人工培养液，培养温度为25~35°C，振荡培养3~4天,维持pH值6~7,溶解氧高于2mg/L,得到预培养液；所述的人工培养液,其碳氮比20~30:1，碳源为葡萄糖、乙酸、柠檬酸、乳酸、蔗糖、丙酸和甲酸中的一种或数种的组合物； b、从预培养液取出液体，分离纯化富集培养液体中的微生物； C、异养氨氧化活性实验:采用专性液体培养基对步骤(b)分离纯化富集培养的微生物进行氨氮降解活性测定，挑选在培养2-3天后氨氮降解效率60%以上的微生物，由此得到高效菌株； d、对步骤(c)获得的高效菌株进行再分离纯化富集培养，由此得到异养型氨氧化微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(a)的人工培养液为Ml液体培养基，其每升在IL抽滤灭菌后河水中加入NH4Cl 0.lg，葡萄糖0.5g、乙酸钠0.5、乳酸钠0.25、柠檬酸钠 0.25g、蔗糖 0.25g，COD 控制在 500mg/L, pH6_7 之间。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(c)的专性液体培养基为M3液体培养基，其每升是这么配制的:在IL水中加入NH4Cl 0.lg，葡萄糖0.5g, NaHCO3 0.2g，KH2PO4 0.lg，CaCl2.2Η20 0.04g, MgSO4.7Η20 0.0.82g，KCl 0.04g，NaCl 0.04g，再用 NaHCO3调节pH到7。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)和步骤(c)的分离纯化富集培养，其具体步骤为:采用稀释法对微生物稀释后，涂平板进行分离，涂布平板的营养培养基为M2固体培养基，经培养后，采用平板划线分离，划线平板的营养培养基为Ml固体培养基，再经培养后，完成对微生物的分离纯化富集培养； 所述的Ml固体液体培养基，每升是这么配制的:在IL抽滤灭菌后河水中加入NH4Cl0.lg、葡萄糖0.5g、乙酸钠0.5、乳酸钠0.25、柠檬酸钠0.25g、蔗糖0.25g和琼脂20g, COD控制在500mg/L，pH6-7之间； 所述的M2固体培养基，每升是这么配制的:在IL水中加入NH4Cl 0.lg，葡萄糖0.5g，NaHCO3 0.2g, KH2PO4 0.lg, CaCl2.2H20 0.04g、MgSO4.7H20 0.0.82g 和琼脂 20g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氨氮降解活性测定为:以步骤(b)的微生物作为受试菌体,在试管中按体积加入1%受试菌体,加入灭菌后的M3液体培养基，管口加上九层纱布或透气棉筛，培 养条件为25V, pH7，溶解氧不低于2mg/L，摇床转速150rpm条件下培养，测定COD、TOC与氨氮降解率，挑选在培养2_3天后氨氮降解效率60%以上的微生物；所述的M3液体培养基每升是这么配制的:在IL水中加入NH4Cl 0.1g,葡萄糖0.5g, NaHCO3 0.2g, KH2PO4 0.lg, CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.0.82g, KCl 0.04g 和NaCl 0.04g,再用 NaHCO3 调节 pH 到 7。
【文档编号】C12N1/00GK103923833SQ201310738282
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】钟玉鸣, 许玫英, 郭俊, 孙国萍, 潘国平, 连英丽 申请人:广东省微生物研究所