一种植物胚乳特异性表达启动子pENP2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种植物胚乳特异性表达启动子pENP2及其应用，含有该启动子的表达盒、重组表达载体、宿主菌和转化子，并且本发明还提供了上述启动子在植物转基因工程中的应用。本发明提供的启动子可以启动外源基因在植物胚乳中特异性表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，特别是单子叶植物或胚乳型双子叶植物，尤其能够驱动外源基因在稻米胚乳中特异性表达，因此可以用于提高和改善稻米的品质，从而培育出理想的、品质更加优良的稻米。
【专利说明】一种植物胚乳特异性表达启动子PENP2及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和植物基因工程【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种水稻基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在胚乳中表达。
【背景技术】
[0002]水稻是最主要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米为主食。随着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来越高的要求。因而，利用各种方法来提高水稻单产、改良稻米品质，有着极其重要的意义。将现代生物技术运用于水稻品种改良中，可以解决一些用常规方法难以解决的问题。自九十年代以来，水稻生物技术取得了很大的发展，一些控制重要农艺性状基因的分离和水稻转基因技术的不断完善，为用基因工程技术来改良水稻品种奠定了良好 的基础。
[0003]植物生物技术的最新发展不仅实现了传统农艺性状的改良，如:提高作物产量、增强抗病、抗虫、抗除草剂特性和改良品质等，而且使植物成为生物医药和工业产品的生物反应器。对于绝大多数禾本科作物，由于其产量高、生产成本低、耐储藏且生产规模容易控制等特点，决定了其为第二代转基因产物的理想载体。近年来利用水稻种子生产具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究发展很快，且已经取得了巨大成功。如维生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白、具有预防和治疗缺铁性贫血和提高自身免疫功能的大豆铁蛋白、具有刺激胰岛素分泌预防糖尿病发生功能的GLP (胰高血糖素样肽)、乙肝疫苗和花粉过敏症疫苗等均成功地在水稻中表达并高水平积累。然而缺少相应的启动子成为目前生物技术应用(外源基因的理想表达部位，表达方式，表达时期和表达水平等)的限制因子。
[0004]植物基因工程的根本目标是培育能使目的基因稳定而且高效表达的转基因植株。基因表达受控于转录起始处的核苷酸序列即启动子成分，它主要包括RNA聚合酶启动转录的信号，以指导合成相应的信使RNA分子，进一步指导蛋白质的合成。启动子控制基因转录水平，同时还决定了基因的表达时间和表达方式。因此，启动子是基因表达所必需的，其决定了外源基因在转基因植物中表达的时间、空间和表达的强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素。目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子。然而，由于组成型启动子驱动外源基因在受体植物内所有部位持续的表达，不仅造成浪费，而且往往会影响植株正常的生长发育。组织特异型启动子可将外源基因集中在某一时间或目标组织中表达，不仅可避免因在转基因植株非目标组织中表达所造成的能源浪费，而且也可避免因在非收获器官或组织中表达目标蛋白而造成的转基因食品的潜在不安全性等。因此，组织特异性启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛的应用价值。胚乳特异型启动子是组织特异型启动子的一种，它可以控制外源基因在植物胚乳中高效表达、避免外源基因在植物的其它部位表达，从而减少对植物的不利影响。
[0005]筛选和分离一些具有组织专一性、高表达水平的启动子以及分析有关重要特异性调控元件的功能，在基因工程研究中有着广泛的用途。胚乳是粮食作物营养的最重要组成部分，因此分离胚乳特异性强表达启动子对植物品质的改良具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种驱动外源基因在植物胚乳中特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
[0007]具体而言，一方面，本发明提供一种植物胚乳特异性表达启动子，所述启动子包含序列表SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻胚乳特异表达启动子,本文中称为pENP2或启动子PENP2。
[0008]优选地,所述 植物胚乳特异性表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。
[0009]另一方面，本发明提供一种植物胚乳特异性表达启动子pENP2，所述植物胚乳特异性表达启动子PENP2的DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；
[0010]或者，所述植物胚乳特异性表达启动子PENP2为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物。这些启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物胚乳中特异性表达。
[0011]另一方面，本发明还提供一种表达盒，所述表达盒包含权利要求1-3中任意一项所述的植物胚乳特异性表达启动子pENP2。。
[0012]又一方面，本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包含上述的植物胚乳特异性表达启动子PENP2。优选地,所述重组载体为重组表达载体；进一步优选地，在所述重组表达载体中，本发明提供的所述植物胚乳特异性表达启动子PENP2连接于待表达的基因序列的上游。
[0013]根据本发明的一种实现方式，所述待表达的基因为Gus基因(β -葡萄糖苷酸酶基因)；所述重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列(即ρΕΝΡ2或启动子ρΕΝΡ2)构建于PCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391- ρΕΝΡ2。其中，pCAMBIA1391来自于CAMBIA，为公开使用载体，并且在安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存。
[0014]并且，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子、上述表达盒、或上述重组载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。
[0015]另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子、上述表达盒、上述重组载体、或上述宿主菌。
[0016]再一方面，本发明提供上述植物胚乳特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用。具体而言，转基因植物的培育过程是:将本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子连接于待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。待表达的基因即目标基因包括用于改良植物品质和积累的基因以及植物营养吸收相关的基因。
[0017]并且优选地，可以利用所述应用来改良植物胚乳性状，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻；更优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391- pENP2,以用于改良水稻胚乳形状。
[0018]本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与SEQ No:1中相同):
[0019]
【权利要求】
1.一种植物胚乳特异性表达启动子PENP2，其特征在于，所述植物胚乳特异性表达启动子pENP2包含序列表SEQ ID No:1所示的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP2，其特征在于，所述植物胚乳特异性表达启动子PENP2的DNA序列为序列表SEQ IDNo:1所示的序列。
3.一种植物胚乳特异性表达启动子PENP2，其特征在于，所述植物胚乳特异性表达启动子PENP2的DNA序列与序列表SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述植物胚乳特异性表达启动子PENP2为在序列表SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物。
4.一种表达盒,其特征在于,所述表达盒包含权利要求1-3中任意一项所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP2。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含根据权利要求1-3中任一项所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP2。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组表达载体，在所述重组表达载体中，所述植物胚乳特异性表达启动子PENP2连接于待表达的基因序列的上游，优选地，所述待表达的基因为Gus基因；所述重组表达载体为pCAMBIA1391-pENP2。
7.—种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含根据权利要求1-3中任一项所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP2、 根据权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5-6中任意一项所述的重组载体。
8.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含根据权利要求1-3中任意一项所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP2、根据权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5-6中任意一项所述的重组载体。
9.一种权利要求1-3中任意一项所述的植物胚乳特异性表达启动子pENP2在培育转基因植物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，培育转基因植物包括:将权利要求1-3中任意一项所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP2连接于载体中的待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述应用用于改良植物胚乳性状，所述植物为单子叶植物:水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。
【文档编号】C12N1/21GK103710344SQ201310738025
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】李莉, 杨剑波, 魏鹏程, 张银萍, 李 浩, 杨亚春, 倪大虎, 秦瑞英, 宋丰顺, 马卉 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所