一种植物胚乳特异性表达启动子pENP3及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种植物胚乳特异性表达启动子pENP3及其应用。本发明还提供了含有该启动子pENP3的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子。本发明的上述启动子可以应用在植物转基因工程中。本发明提供的启动子可以启动外源基因在植物胚乳中特异性表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，特别是单子叶植物或胚乳型双子叶植物，尤其能够驱动外源基因在稻米胚乳中特异性表达，因此可以用于提高和改善稻米的品质，从而培育出理想的、品质更加优良的稻米。
【专利说明】一种植物胚乳特异性表达启动子PENP3及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和植物基因工程【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种植物胚乳特异性基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在胚乳中表达。
【背景技术】
[0002]水稻是最主要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米为主食。随着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来越高的要求。因而利用各种方法来提高水稻单产、改良稻米品质，有着积极重要的意义。通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中具有很好的应用前景。自1983年获得第一株转基因烟草以来，在近30年的时间里，植物基因工程的研究取得了突飞猛进的进展，已经成为现代生物学和育种学中一项重要的方法和技术。
[0003]高等生物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用的过程。在此过程中基因表达的开启、关闭、表达部位和表达量的闻低都将会受:到精细的调控，基因的表达调控是一个多层次的复杂过程，受不同的调节因素控制，也是在多阶段水平来实现的，即转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。尽管基因表达在高等生物中是多级调控系统，但是转录水平上调控是最关键的环节。因为转录的起始及其发生频率是基因表达环节中最基本的一步。启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，是众多转录因子及RNA聚合酶的最终作用靶标，因此深入研究启动子的结构、功能、作用模式等对于回答分子生物学中的一些基本理论问题具有重大意义。因此，人们在开发一些新的转化技术如细胞器转化、定向转化等的同时，越来越注重通过控制目的基因的时空表达来达到相应的转化目的。研究者们通过寻找更为有效的组织、器官特异性表达启动子或者是诱导表达启动子来代替组成型启动子，以期更好地调控植物基因表达。正因为如此，组织特异性启动子在植物基因工程中的研究地位也越来越突出。
[0004]所谓组织特异性启动子是指除具有一般启动子的结构外，通常还有增强子和沉默子的一般特性。在组织特异性启动子的调控下，基因的表达常常只发生在某些特定的器官或组织部位，并常常表现出发育调节的特性。这些启动子的调控往往受到组织细胞生理状态和化学物理信号等物质的诱导，还受到发育阶段的调控，其表达是多种因子相互作用的结果。
[0005]果实和种子是植物的生殖器官，也是营养物质主要的储藏场所。利用果实或种子等器官特异性启动子调控基因表达，不仅可以提闻基因在这些部位的表达量，将生物能耗降到最低，有利于表达产物的分离，而且可以有目的地提高转基因植物果实或种子的营养或改善其品质。Vasconcelos等用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因，使转基因水稻谷粒中铁和锌的含量都有所增加，而且铁蛋白主要积累在胚乳中，不会在食品加工过程中丢失。研究人员在一些单子叶植物的种子储藏蛋白中也分离了一些胚乳特异表达的顺式作用元件，最著名的GCN4元件被认为对维持胚乳特异表达活性是必须的，但也有文献报道，GCN4元件仅仅是起到增强启动子在胚乳中的表达强度的作用，其并不能决定启动子胚乳特异表达的特性。另外，一些种子中特异表达的启动子如PsGNS2启动子(Buchner et al., 2002)、FAEl (Rossak et al., 2001)启动子等也有相关的报导。
[0006]水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是禾本科作物功能基因组学研究的模式植物。人们日常食用的大米即为水稻的胚乳，胚乳的形成和发育直接影响着水稻的产量和品质，因此，对水稻胚乳特异性表达基因的深入研究，具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种驱动外源基因在植物胚乳中特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]一方面，本发明提供一种植物胚乳特异性表达启动子，所述启动子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻胚乳特异表达启动子,本文中称为pENP3或启动子PENP3。
[0010]优选地，所述植物胚乳特异性表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。
[0011]另一方面，本发明提供一种植物胚乳特异性表达启动子PENP3，所述植物胚乳特异性表达启动子PENP3的DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者优选地，所述启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物。这些启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物胚乳中特异性表达。
[0012]另一方面，本发明还提供一种表达盒，所述表达盒包含权利要求1-3中任意一项所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP3。
[0013]又一方面，本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包含根据本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子PENP3 ；
[0014]优选地，所述重组载体为重组表达载体；进一步优选地，在所述重组表达载体中，本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子连接于待表达的基因序列的上游。
[0015]根据本发明的一种优选实现方式，所述待表达的基因为Gus基因(β -葡萄糖苷酸酶基因);所述重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即ρΕΝΡ3构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-pENP3。其中，pCAMBIA1391来自于CAMBIA，为公开使用载体，并且在安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存。 并且，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子、上述表达盒、或上述重组载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。
[0016]另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子、上述表达盒、上述重组载体、或上述宿主菌。再一方面，本发明提供上述植物胚乳特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用。具体而言，所述培育转基因植物的培育过程是:将本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子连接于待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。待表达的基因即目标基因包括用于改良植物品质和积累的基因以及植物营养吸收相关的基因。
[0017]并且优选地，可以利用所述应用来改良植物胚乳性状，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻；更优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-pENP3，以用于改良水稻胚乳形状。 [0018]本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与SEQ No:1中相同):
[0019]
【权利要求】
1.一种植物胚乳特异性表达启动子PENP3，其特征在于，所述植物胚乳特异性表达启动子pENP3包含序列表中SEQ ID NO:1所示的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP3，其特征在于，所述植物胚乳特异性表达启动子PENP3的DNA序列为序列表中SEQID NO:1所示的序列。
3.一种植物胚乳特异性表达启动子PENP3，其特征在于，所述植物胚乳特异性表达启动子PENP3的DNA序列与序列表SEQ ID NO:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述植物胚乳特异性表达启动子PENP3为在序列表SEQ ID NO:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物。
4.一种表达盒,其特征在于,所述表达盒包含权利要求1-3中任意一项所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP3。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含根据权利要求1-3中任一项所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP3。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组表达载体，在所述重组表达载体中，所述植物胚乳特异性表达启动子PENP3连接于待表达的基因序列的上游，优选地，所述待表达的基因为Gus基因；所述重组表达载体为pCAMBIA1391-pENP3。
7.—种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含根据权利要求1-3中任一项所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP3、根据权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5-6中任意一项所述的重组载体。
8.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含根据权利要求1-3中任意一项所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP3、根据权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5-6中任意一项所述的重组载体。
9.一种权利要求1-3中任意一项所述的植物胚乳特异性表达启动子pENP3在培育转基因植物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，培育转基因植物包括:将权利要求1-3中任意一项所述的植物胚乳特异性表达启动子PENP3连接于载体中的待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述应用用于改良植物胚乳性状，所述植物为单子叶植物:水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。
【文档编号】C12N15/82GK103725680SQ201310738081
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】魏鹏程, 杨剑波, 张银萍, 李 浩, 杨亚春, 李莉, 倪大虎, 秦瑞英, 宋丰顺, 马卉 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所