分枝杆菌药敏检测试剂盒及其测试方法
【专利摘要】本发明公开了一种安全有效、操作方便、测试时间短、测试药物范围广的分枝杆菌药敏检测试剂盒及其测试方法。本发明所述分枝杆菌药敏检测试剂盒包括盒体（1），在所述盒体（1）内包括有若干药敏培养基（2）、药敏测试板（3）、无菌吸嘴（4）、无菌稀释液（5）、杂菌抑制剂（6）、说明书和报告签，所述药敏培养基（2）由基础培养基、促生长剂和抑菌剂组成，所述药敏测试板（3）上设置有阴性对照孔（31）、阳性对照孔（32）和若干个呈矩阵排列的且包被有不同抗结核药物的含药孔（33）。本发明可应用于结核分枝杆菌检测领域。
【专利说明】分枝杆菌药敏检测试剂盒及其测试方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种体外诊断试剂，具体涉及一种分枝杆菌药敏检测试剂盒及其测试方法。
【背景技术】 [0002]结核病是当今世界上传染病中主要杀手，已对国际公共卫生构成严重挑战。据世界卫生组织报告，目前全球已有20亿人感染结核菌，每年约有300万死于结核病，2006年全球新发患者数高达920万例，死亡170万例，即每天超过4600人死于结核病，每年死于结核病的成年人多于艾滋病、疟疾和热带病死亡人数的总和。耐药结核菌、尤其是耐多药(MDR)和严重耐多药(XDR)结核菌的出现是结核病死灰复燃的主要原因之一。MDR结核菌对异烟肼和利福平这两种目前最主要的抗结核药物耐药，XDR结核菌除对异烟肼和利福平耐药外，还对二线抗结核药物耐药。WHO监测显示，全球已有100多个国家和地区发现MDR结核菌感染，45个国家和地区发现XDR结核菌感染。我国也被列为耐药结核菌感染“需引起警示的热点地区”之一，总耐药率达27.8%，MDR结核菌感染达10.7%，远高于世界平均水平。更严重的是，我国个别地区已发现XDR结核菌感染，上海、北京、山东等地区MDR结核病患者中6%~20%为XDR结核菌感染。耐药结核病不仅治疗周期长、使用一线药物副作用大，而且治愈率低、患者死亡率高(XDR结核病患者死亡率高达30%~98%)，为结核病控制带来了新的严峻挑战。高耐药率不仅对结核患者的治疗带来很大困难，而且将加剧结核病的流行，对人群的传播、发病和死亡造成极大的威胁，因此耐多药结核病的诊断与治疗成为控制结核病的关键。
[0003]传统的结核药敏实验主要是基于罗氏固体培养基的绝对浓度法和比例法，由于分枝杆菌生长缓慢，其药敏检测时间长需要4周才能报告药敏结果。无法及时有效的指导临床用药，耽误病人的病情。世界卫生组织大力提倡采用液体培养基的药敏测定技术，但是目前临床上可以使用的基于液体的药敏测定试剂，需要昂贵的仪器设备，且检测成本较高，限制了其推广应用。同时国内对基于液体的分枝杆菌微量药敏的检测方法有大量的文献资料，但是目前国内可用于临床的市场化商品盒还没有。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种安全有效、操作方便、测试时间短、测试药物范围广的分枝杆菌药敏检测试剂盒及其测试方法。
[0005]本发明所述分枝杆菌药敏检测试剂盒所采用的技术方案是:所述试剂盒包括盒体，在所述盒体内包括有若干药敏培养基、药敏测试板、无菌吸嘴、无菌稀释液和杂菌抑制齐?，所述药敏培养基由基础培养基、促生长剂和抑菌剂组成，所述药敏测试板上设置有阴性对照孔、阳性对照孔和若干个呈矩阵排列的且包被有不同抗结核药物的含药孔。
[0006]所述无菌稀释液为钾盐和钠盐无菌溶液。
[0007]所述杂菌抑制剂为多粘菌素B、两性霉素B、萘啶酸、阿洛西林和甲氧苄啶的冻干制剂。
[0008]在所述含药孔内包被的抗结核药物包括利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素、莫西沙星、卡那霉素、对氨基水杨酸、利福喷丁、利福布丁、克拉霉素、氯法齐明、亚胺培南或利奈唑胺。
[0009]所述药敏测试板为26孔、48孔或96孔板。
[0010]所述药敏测试板上的阴性对照孔、阳性对照孔和含药孔为直径为6~10mm，深度为8~12mm的圆底形微孔，通过贴膜或外盖进行密封。
[0011]所述杂菌抑制剂为通过真空冷冻干燥制得的冻干杂菌抑制剂。
[0012]采用上述分枝杆菌药敏检测试剂盒进行分枝杆菌检测的方法包括以下步骤:
(I)取出冻干杂菌抑制剂，旋开瓶盖，将无菌稀释液全部加入后充分摇匀；
(2 )取出药敏培养基及药敏测试板，使它们在接种标本前接近室温；吸取混合均匀的杂菌抑制剂加入药敏培养基，充分混合均匀；
(3)用无菌吸嘴吸取经过步骤(2)处理过的药敏培养基加入到阴性对照孔；
(4)将分枝杆菌培养菌株磨菌比池至lmg/ml,加入一支新的药敏培养基中混匀；在所述药敏测试板上的含药孔内接种含有菌液的药敏培养基，贴膜或盖好外盖置37°C温箱培养;
(5)7-10天后观察结果，孔底出现白色菌体沉淀的为阳性，则表示在该孔有细菌生长，根据各含药孔、对照孔的生长结果判断药物敏感性。
[0013]本发明的有益效果是:本发明所述试剂盒提供完整的配套试剂及指导说明，临床用户可根据实验需求选择不同规格的微孔板对临床结核病人的药物敏感度进行监测，指导用药，减少耐药菌株的产生。采用本发明的分枝杆菌药敏检测试剂盒及测试方法7~10 d既可提供简单明了的药敏判断结果，又可以获得菌型结果，比罗氏的药敏检测时间大大缩短，且仅需肉眼判读结果，不需要昂贵的仪器设备，具有准确、快速、低成本和操作简单的优点，是一种安全有效、操作方便、测试时间短、测试药物范围广的分枝杆菌药敏检测试剂盒。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是本发明试剂盒的简易结构示意图；
图2是实施例一中所述药敏测试板的简易结构示意图。
【具体实施方式】
[0015]本发明所述试剂盒包括盒体I,在所述盒体I内包括有若干药敏培养基2、药敏测试板3、无菌吸嘴4、无菌稀释液5、杂菌抑制剂6、说明书和报告签，所述药敏培养基2由基础培养基、促生长剂和抑菌剂组成，所述药敏测试板3上设置有阴性对照孔31、阳性对照孔32和若干个呈矩阵排列的且包被有不同抗结核药物的含药孔33。下面就具体实施例对本发明做进一步阐述:
实施例一:
在本实施例中，本发明包括以下部分:
1、分枝杆菌药敏培养基由棕色玻璃螺口瓶灌装为IOml/支，共20支/盒。
[0016]2、分枝杆菌药敏测试板为26孔微孔板，共20条，每条由无菌三边封铝箔袋密封，其中同时密封I个无菌吸嘴方便客户使用。26孔微孔板示意图如图2所示。
[0017]3、无菌稀释液为3ml/支的钾盐和钠盐无菌溶液，用防盗滴瓶灌装。
[0018]4、杂菌抑制剂为多粘菌素B、两性霉素B、萘啶酸、阿洛西林、甲氧苄啶的冻干制剂，将多粘菌素B、两性霉素B、萘啶酸、阿洛西林、甲氧苄啶的混合药液通过真空冷冻干燥工艺制得。
[0019]5、采用分枝杆菌药敏检测试剂盒进行分枝杆菌的药敏测试:
(I)取出冻干杂菌抑制剂，旋开瓶盖，将无菌稀释液全部加入瓶内后充分摇匀。
[0020](2)取出药敏培养基及药敏测试板，使其在接种标本前接近室温，吸取IOOul混合均匀的杂菌抑制剂加入药敏培养基，充分混合均匀。
[0021](3)用无菌吸嘴吸取200ul上述药敏培养基加入到两个阴性对照孔。
[0022](4)将培养菌株磨菌比浊至lmg/ml，取IOOul加入到一支新的药敏培养基中，混匀。每孔加200ul含有菌液的药敏培养基(除上述2孔)，贴膜后置37°C温箱培养。
[0023](5)7-10天后观察结果，孔底出现白色菌体沉淀的为阳性，则表示在该孔有细菌生长，根据各含药孔、对照孔的生长结果判断药物敏感性。阴性对照孔C一第I列:上下孔中无任何变化；阳性对照孔C+第2列:两孔孔底有白色菌体沉淀生成，说明该孔有细菌生长为阳性；菌型PNB鉴定孔第3列:上下孔中无任何变化，说明为结核分枝杆菌复合群感染；药敏区链霉素SM两孔孔底有白色菌体沉淀生成，说明对链霉素SM耐药；异烟肼INH两孔孔底有白色菌体沉淀生成，说明对异烟肼INH耐药；利福平RFP、乙胺丁醇EMB、氧氟沙星0FLX、左氧氟沙星LVFX、莫西沙星Μ0Χ、阿米卡星AMK、卡那霉素ΚΑΝ、卷曲霉素CPM上下孔中无任何变化，说明对这些药敏感。
`[0024]实施例二:
在本实施例中，本发明包括以下部分:
1、分枝杆菌药敏培养基由棕色玻璃螺口瓶灌装为20ml/支，共10支/盒。
[0025]2、分枝杆菌药敏测试板为96孔微孔板，共10条，每条由无菌三边封铝箔袋密封，其中同时密封I个无菌吸嘴方便客户使用。
[0026]96孔微孔板药物浓度分布表
【权利要求】
1.一种分枝杆菌药敏检测试剂盒，其特征在于:它包括盒体(1)，在所述盒体(1)内包括有若干药敏培养基(2)、药敏测试板(3)、无菌吸嘴(4)、无菌稀释液(5)和杂菌抑制剂(6)，所述药敏培养基(2)由基础培养基、促生长剂和抑菌剂组成，所述药敏测试板(3)上设置有阴性对照孔(31)、阳性对照孔(32)和若干个呈矩阵排列的且包被有不同抗结核药物的含药孔(33)。
2.根据权利要求1所述的分枝杆菌药敏检测试剂盒，其特征在于:所述无菌稀释液(5)为钾盐和钠盐无菌溶液。
3.根据权利要求1所述的分枝杆菌药敏检测试剂盒，其特征在于:所述杂菌抑制剂(6)为多粘菌素B、两性霉素B、萘啶酸、阿洛西林和甲氧苄啶的冻干制剂。
4.根据权利要求1所述的分枝杆菌药敏检测试剂盒，其特征在于:在所述含药孔(33)内包被的抗结核药物包括利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素、莫西沙星、卡那霉素、对氨基水杨酸、利福喷丁、利福布丁、克拉霉素、氯法齐明、亚胺培南或利奈唑胺。
5.根据权利要求1所述的分枝杆菌药敏检测试剂盒，其特征在于:所述药敏测试板(3)为26孔、48孔或96孔板。
6.根据权利要求5所述的分枝杆菌药敏检测试剂盒，其特征在于:所述药敏测试板(3)上的阴性对照孔(31)、阳性对照孔(32)和含药孔(33)为直径为6~10mm，深度为8~12mm的圆底形微孔，通过贴膜或外盖进行密封。
7.根据权利要求3所述的分枝杆菌药敏检测试剂盒，其特征在于:所述杂菌抑制剂为通过真空冷冻干燥制得的冻干杂菌抑制剂。
8.—种如权利要求1所述的分枝杆菌药敏检`测试剂盒对分枝杆菌进行药敏测试的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)取出冻干杂菌抑制剂，旋开瓶盖，将无菌稀释液全部加入后充分摇匀； (2)取出药敏培养基及药敏测试板，使它们在接种标本前接近室温，吸取混合均匀的杂菌抑制剂加入药敏培养基，充分混合均匀； (3)用无菌吸嘴吸取经过步骤(2)处理过的药敏培养基加入到阴性对照孔； (4)将分枝杆菌培养菌株磨菌比池至lmg/ml,加入一支新的药敏培养基中混匀；在所述药敏测试板上的含药孔内接种含有菌液的药敏培养基，贴膜或盖好外盖置37°C温箱培养; (5)7-10天后观察结果，孔底出现白色菌体沉淀的为阳性，则表示在该孔有细菌生长，根据各含药孔、对照孔的生长结果判断药物敏感性。
【文档编号】C12Q1/18GK103740802SQ201410019031
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】孙宜峰, 王珍, 曾冰冰 申请人:珠海市银科医学工程有限公司