用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重pcr引物、探针和基因芯片的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物、探针和基因芯片，所述多重PCR引物和探针为SEQ?ID?NO.1至SEQ?ID?NO.9所示的核苷酸序列；所述基因芯片包括固相载体、点样质控探针、阳性杂交质控探针、检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物和对应的探针。本发明采用荧光标记3种病毒的正向引物，在多重RT-PCR的基础上建立动物皮毛中携带3种病毒的基因芯片检测技术，能够高通量、灵敏、特异性检测皮毛中的RNA病毒，一次检测实现3种病毒的同时筛查，改变了原先每种病毒都需要一种特定方法的状况，节约了诊断时间，满足进出境检验检疫部门、进出口皮毛企业大批量进出口皮毛样品快速检测的需求，具有较大的应用价值。
【专利说明】用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物、探针和基因芯片
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物、探针和基因芯片，属于动物病毒检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]我国已经成为世界上最大的皮毛进口国，进口皮张来源广泛。但是由于各国皮毛动物养殖状况不同，动物疾病的流行情况不同等原因，导致进口皮张存在携带病毒种类繁多、性质差异大等问题。目前，进境皮毛中携带的RNA病毒主要有蓝舌病病毒(Bluetonguevirus, BTV)、口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)、牛病毒性腹湾病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)等3种病毒。这些病毒危害严重，通过皮毛传播的风险较高，因此对BTV、FMDV, BVDV等3种病毒进行快速、高通量检测，防止其通过进境皮毛入境，对于保护皮毛产业健康发展具有重要意义。迄今为止，国内外只有零星的几篇对皮毛携带一种或两种的病毒的检测方法的报道。检测方法主要依靠经典的血清学和PCR法，缺少对皮毛携带病毒的高通量检测方法，已经无法适应进出口皮毛快速、大批量的检测要求。
[0003]基因芯片(gene chip),又称基因微阵列(gene microarray),是20世纪90年代发展起来的前沿生物技术，该技术可对样品进行快速、准确、高效的检测，具有高通量、多样性、微型化以及自动化等特点，适用于大批量样品的快速诊断。因此开发一种能够快速、准确、高效、灵敏检测BTV、FMDV、BVDV的基因芯片具有重大意义。
【发明内容】
[0004]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物、探针和基因芯片，能够高通量、灵敏、准确检测进口皮毛`中携带的RNA病毒。
[0005]本发明解决的技术方案是，用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物和探针，所述多重PCR引物和探针为SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列；其中，检测蓝舌病病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2所示的核苷酸序列，检测蓝舌病病毒的探针为SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；检测口蹄疫病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，检测口蹄疫病毒的探针为SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列；检测牛病毒性腹泻病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列，检测牛病毒性腹泻病毒的探针为SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列。
[0006]所述检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的正向引物的5’端标记TAMARA荧光基团。
[0007]所述检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的探针的5’端加T碱基补足35bp，并在5’端对探针进行氨基化修饰。[0008]本发明所解决的技术方案还在于提供一种用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的基因芯片，所述基因芯片包括固相载体、点样质控探针、阳性杂交质控探针、检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物和对应的探针；其中，点样质控探针为SEQ ID N0.10所示的核苷酸序列；阳性杂交质控探针为SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列。
[0009]本发明的固相载体可以为带有活性基团的玻璃基片，也可以为本领域常用的其他基片。
[0010]本发明检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的方法，包括以下步骤:
[0011](I)检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物的设计与合成
[0012]在NCBI上查找蓝舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等3种病毒的基因组序列，并BLAST分析比较，利用Prime5.0软件分别设计3种病毒的引物和探针。每条正向引物的5’端标记TAMARA荧光基团，探针碱基长度小于35bp的探针5’端加T碱基到35bp，并在5’端对探针进行氨基化修饰，引物和探针的合成和标记由宝生物工程(大连)有限公司合成。同时，设计的点样质控探针、阳性杂交质控探针、3种病毒的多重PCR引物和探针的核苷酸序列如下:
[0013]
【权利要求】
1.用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物和探针，其特征在于，所述多重PCR引物和探针为SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列；其中，检测蓝舌病病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，检测蓝舌病病毒的探针为SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；检测口蹄疫病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，检测口蹄疫病毒的探针为SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列；检测牛病毒性腹泻病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列，检测牛病毒性腹泻病毒的探针为SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的多重PCR引物和探针，其特征在于，所述检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的正向引物的5’端标记TAMARA荧光基团。
3.根据权利要求1所述的多重PCR引物和探针，其特征在于，所述检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的探针的5’端加T碱基补足35bp，并在5’端对探针进行氨基化修饰。
4.一种用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括固相载体、点样质控探针、阳性杂交质控探针、检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物和对应的探针；其中，点样质控探针为SEQ IDN0.10所示的 核苷酸序列；阳性杂交质控探针为SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列。
【文档编号】C12N15/11GK103695566SQ201410018956
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】徐超, 张勤, 杨娜, 张子宏, 李珂, 苗丽 申请人:徐超