一种检测柑桔黄脉病毒的引物对及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测柑桔黄脉病毒的引物对及相应的RT-PCR快速检测方法，通过对柑桔黄脉病毒总核酸的提取、特异性引物设计与优选，以及对引物浓度、PCR扩增条件的优化，实现了能检测柑桔黄脉病病原。本发明检测方法快速准确，检测稳定性好，特异性强，一致性高，可大规模推广应用，特别适用于品种（或品系）苗木的鉴定、脱毒，并用于指导引进品种和推广苗木的无毒化，确保柑桔产业的持续、健康、稳定发展。
【专利说明】一种检测柑桔黄脉病毒的引物对及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒检测【技术领域】，特别是涉及一种柑桔黄脉病毒的引物对及快速检测方法。
【背景技术】
[0002]柑桔黄脉病(Citrusyellow vein clearing disease, CYVQ)),也称朽1 樣黄脉病(Yellow vein clearing of Lemon),是由柑桔黄脉病毒(Citrus yellow vein clearingvirus，CYVCV)引起的。该病是Βον? (1989)在巴基斯坦调查发现后命名的，它是威胁柠檬生产的重要病害之一。主要症状表现为叶片侧脉及侧脉附近脉明、黄化，对光看更为明显，叶背可见侧脉处水浸状，部分叶片皱缩、反卷或船形叶，嫩叶症状表现明显，到老叶症状也不消失。主要导致光合作用降低、树势减弱、减产20%左右。柠檬黄脉病目前主要发生在印度、巴基斯坦、土耳其等国家。近年在我国云南瑞丽、重庆也发生类似症状，是我国柑桔上的新发病害。
[0003]到目前为止，世界上对该病害的研究较少，大都停留在生物学特性研究方面，本人近几年研究结果表明该病害具有嫁接传染性，对所有柠檬、酸橙品种都具有嫁接传染性并具典型症状，对甜橙、宽皮柑桔也具有侵染性，但症状不明显；能侵染辣椒和豇豆；柑桔黄脉病最适宜发病温度为18 ~24°C，柑桔黄脉病病毒微粒为13~15 X 400~1000nm联合丝状，通过热处理结合茎尖嫁接脱毒方法能有效脱除该病毒。这些研究结果与国外研究报道的相关结果相同。
[0004]但由于通过指示植物鉴定具有时间长，工作量大，不利于田间样品的大量检测。且到目前为止，国内尚无RT-PCR快速检测柑桔黄脉病毒的方法报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是建立一种柑桔黄脉病毒快速检测方法。该方法具有速度快、成本低、重复性好、稳定性高、操作性强等特点，适合大规模、高通量的样品分析，适用于田间样品检测、柑桔黄脉病流行监控、脱毒苗木鉴定等多种用途。
[0006]本发明的目的是这样实现的:
[0007]本发明目的之一，根据已报道的柑桔黄脉病毒全序列设计特异性引物对:
[0008]上游引物:5’ -TACCGCAGCTATCCATTTCC-3 ’
[0009]下游引物:5，-GCAGAAATCCCGAACCACTA-3，
[0010]总核酸提取及(RT)-PCR扩增所需试剂如下:
[0011]RNAiso Pluslml，氯仿 200 μ L，异丙醇，75% 乙醇，DEPC 水，2 XBuffer 液 5 μ L，MgS040.3 μ L，RT/Taq酶0.2 μ L，正反引物各0.2 μ L，灭菌去离子水2.I μ L。
[0012](RT)-PCR 扩增条件为:42°C,30min ；94°C,2min ；94°C, 30S, 55°C, 30S, 72°C,40S,40 个循环；72°C，5min。
[0013]本发明的目的还在于提供一种柑桔黄脉病毒检测的试剂盒，包括下列引物对:[0014]上游引物:5’ -TACCGCAGCTATCCATTTCC-3 ’
[0015]下游引物:5’ -GCAGAAATCCCGAACCACTA-3 ’。
[0016]本发明的目的还在于提供一种快速检测柑桔黄脉病毒的RT-PCR的检测方法，包括如下步骤:提取柑桔样品总核酸，设计特异性引物，对待测样品进行RT-PCR扩增，最后电泳鉴定:
[0017]所述RT-PCR扩增所需试剂如下:
[0018]RNAiso Pluslml，氯仿 200 μ L，异丙醇，75% 乙醇，DEPC 水，
[0019]2 X Buffer 液 5μ L，MgS040.3 μ L, RT/Taq 酶 0.2 μ L，正反引物各 0.2 μ L，灭菌去离子水2.1 μ L ;
[0020]RT-PCR 扩增条件为:程序为 42°C，30min ；94°C, 2min; 94°C, 30S, 55 °C, 30S, 72 °C,40S, 40 个循环；72°C, 5min。
[0021]优选的，所述提取样品总核酸，样品主要取春、秋梢嫩叶叶脉及附近组织。
[0022]所述电泳鉴定得到的特异性片段大小为612bp。
[0023]本发明具体按如下步骤进行:
[0024]1、总核酸提取:
[0025](I)取样、研磨:
[0026]由于CYVCV症状主要表现春季和秋季的叶片上，尤其在嫩叶上，故采样嫩叶叶脉及附近组织10-15mg装于无菌eppendorf`管,液氮研磨；
[0027](2)加入RNAiso Pluslml，盖紧离心管盖，涡旋，室温静置5min ;12000g4°C离心5min,上清液转至新的1.5ml的离心管中；加入200 μ L氯仿,振荡混匀，室温静置5min,12000g4°C离心15min ;上清液转至新的离心管中，加入0.5-1倍RNAiso Plus体积量的异丙醇，室温静置lOmin，12000g4°C离心IOmin ;用与RNAiso Plus等量的75%乙醇清洗沉淀，7500g4°C离心5min，弃上清保留沉淀，放在通风橱干燥5min，溶解于30-50 μ LDEPC处理水中备用。可放入冰中再放入_20°C保存。
[0028]2、(RT)-PCR 扩增:
[0029]取I μ L总核酸提取液加入I μ L灭菌去离子水于离心管中，在94°C变性，冰水浴2min后，加入RT-PCR扩增所需试剂，利用PCR仪进行扩增。
[0030](RT)-PCR扩增所需体系如下:2XBuffer液5μ L，MgS040.3 μ L，RT/Taq酶0.2μ L，正向引物混合液0.2 μ L，反向引物混合液0.2 μ L，加灭菌去离子水2.1 μ L补足体积至10 μ Lo
[0031 ] (RT) -PCR 扩增条件为:42°C, 30min ；94°C, 2min; 94 °C, 30S, 55 °C，30S, 72 °C，40S,40 个循环；72°C,5min ；
[0032]3、PCR产物电泳检测:
[0033]取5 μ L PCR产物与3 μ L染料相混合，在室温下进行1.5%水平琼脂糖恒压凝胶电泳。电泳条件为初始电压150V，5min ;后续电压100V，30min。电泳完毕后EB染色，凝胶成像系统观测电泳结果。
[0034]4、电泳结果分析:
[0035]柑桔黄脉病毒扩增出612bp的片段，见附图1。
[0036]用PCR产物纯化试剂盒对产物进行切胶回收并纯化，产物进行测序,利用NCBI的BLAST工具对获得的序列进行比对分析，与CYVCV基因组对应序列同源性达到97%以上。
[0037]有益效果:本发明能快速准确检测到柑桔黄脉病毒，检测的稳定性好，特异性强，一致性高，适用于大规模推广，实现了柑桔黄脉病毒高效快速检测，有利于摸清田间柑桔黄脉病发生状况，同时利于加快茎尖嫁接脱毒苗的评价，推进引进品种和推广苗木的无毒化进程，确保柑桔安全生产。
【专利附图】
【附图说明】:
[0038]图1:柑桔黄脉病RT-PCR检测电泳图谱
[0039]M:100bp DNA分子量标准；1_4:柑桔黄脉病毒；5:阴性对照；6:水对照。
[0040]图2:采集田间样品进行黄脉病RT-PCR检测电泳图谱。
[0041]M:100bp DNA分子量标准；1_3健康样品；4_8:柑桔黄脉病病毒；9:水对照。
【具体实施方式】
[0042]本发明检测柑桔黄脉病毒RT-PCR检测方法如下:
[0043]1、核酸提取:(I)取重庆、云南瑞丽黄脉病疑似样品，以及中国农业科学院柑桔研究所脱毒中心毒源库保存的土耳其黄脉病样品5个，3个健康柠檬样品，共选取了 8个样品，每样取10-15mg嫩叶叶脉及附近组织于无菌eppendorf管,液氮研磨；
[0044](2)加入RNAiso Pluslml，盖紧离心管盖，涡旋，室温静置5min ;12000g4°C离心5min,上清液转至新的1.5ml的离心管中；加入200 μ L氯仿,振荡混匀，室温静置5min,12000g4°C离心15min ;上清液转至新的离心管中，加入0.5-1倍RNAiso Plus体积量的异丙醇，室温静置lOmin，12000g4°C离心IOmin` ;用与RNAiso Plus等量的75%乙醇清洗沉淀，7500g4°C离心5min，弃上清保留沉淀，放在通风橱干燥5min，溶解于30-50 μ LDEPC处理水中备用。可放入冰中再放入_20°C保存。
[0045]2、(RT)-PCR 扩增:
[0046]取I μ L总核酸提取液加入I μ L灭菌去离子水于离心管中，在94°C变性，冰水浴2min后，加入RT-PCR扩增所需试剂，利用PCR仪进行扩增。
[0047](RT)-PCR扩增所需体系如下:2XBuffer液5μ L，MgS040.3 μ L，RT/Taq酶0.2μ L，正向引物混合液0.2 μ L，反向引物混合液0.2 μ L，加灭菌去离子水2.1 μ L补足体积至10 μ Lo
[0048](RT) -PCR 扩增条件为:42°C, 30min ；94°C, 2min; 94 °C, 30S, 55 °C，30S, 72 °C，40S,40 个循环；72°C,5min ；
[0049]3、PCR产物电泳检测:
[0050]取5 μ L PCR产物与3 μ L染料相混合，在室温下进行1.5%水平琼脂糖恒压凝胶电泳。电泳条件为初始电压150V，5min ;后续电压100V，30min。电泳完毕后EB染色，凝胶成像系统观测电泳结果。
[0051]4、电泳结果分析:
[0052]扩增出612bp的柑桔黄脉病毒目标片段，见附图2。对PCR产物用PCR产物纯化试剂盒切胶回收，纯化后测序，利用NCBI的BLAST工具对获得的序列进行比对分析，与CYVCV基因组对应序列同源性达到97%以上。[0053]上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属【技术领域】中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍`应由本发明的权利要求所涵盖。
【权利要求】
1.一种用于柑桔黄脉病毒检测的引物对，其特征在于，所述引物对的序列为: 上游引物:5 ’ -TACCGCAGCTATCCATTTCC-3， 下游引物:5’ -GCAGAAATCCCGAACCACTA-3’。
2.一种用于柑桔黄脉病毒检测的试剂盒，其特征在于:包括如权利要求1所述的引物对。
3.一种快速检测柑桔黄脉病毒的RT-PCR的检测方法，其特征在于包括如下步骤:提取柑桔样品总核酸，设计特异性引物，对待测样品进行RT-PCR扩增，最后电泳鉴定: 所述RT-PCR扩增所需试剂如下: RNAiso Pluslml，氯仿 200 μ L，异丙醇，75% 乙醇，DEPC 水， 2X Buffer 液 5 μ L，MgS040.3 μ L, RT/Taq 酶 0.2 μ L，正反引物各 0.2 μ L,灭菌去离子水 2.1 μ L ;
RT-PCR 扩增条件为:程序为 42 0C，30min ；94°C, 2min ;94°C, 30S, 55 °C，30S, 72 °C，40S,40 个循环；72°C，5min。
4.根据权利 要求3所述的检测方法，其特征在于:所述提取样品总核酸，样品主要取春、秋梢嫩叶叶脉及附近组织。
5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于:所述柑桔黄脉病毒的引物对如权利要求1所述。
6.根据权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于:电泳得到的特异性片段大小为612bp。
7.权利要求1所述的引物对在柑桔黄脉病毒检测中的用途。
8.权利要求2所得试剂盒在柑桔黄脉病毒检测中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK103757135SQ201410025175
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月20日 优先权日:2014年1月20日
【发明者】陈洪明, 李中安, 王雪峰, 周彦, 唐科志, 周常勇 申请人:中国农业科学院柑桔研究所